La cuantificación de la histidina quinasa bacteriana autofosforilación mediante un ensayo de nitrocelulosa Encuadernación

El objetivo general de este protocolo es cuantificar la autofosforilación de las histidina quinasas bacterianas purificadas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la señalización de dos componentes. Como el efecto de estímulos afines en las interacciones proteína-proteína sobre la autofosforilación de las histidina quinasas.

Las principales ventajas de esta técnica son que es un método de alto rendimiento que se puede utilizar para detectar con precisión los picomoles de fosfohistadina formados y obtener parámetros cinéticos para las histidina quinasas. Como becario postdoctoral, utilizo la filtración en membranas de nitrocelulosa para cuantificar ligandos radiactivos unidos a proteínas. En consecuencia, tenía sentido desarrollar una técnica similar para cuantificar la fosforilación de histidina en histidina quinasas bacterianas.

Comience este procedimiento con la preparación de los reactivos y materiales como se describe en el protocolo de texto. Para configurar el aparato de diagrama de puntos de 96 pocillos, corte un trozo de membrana de nitrocelulosa de ocho centímetros por 12 centímetros. Coloque la nitrocelulosa en el aparato de diagrama de puntos.

Asegúrese de que la membrana se ajuste de manera que el aparato esté sellado y todos los pocillos estén completamente cubiertos por la membrana. Para recoger el filtrado, conecte el aparato a un matraz secundario de brazo lateral. Desde el vástago de la válvula, conecte el tubo adecuado para permitir que el aparato se use cómodamente sin inclinar el matraz secundario.

Luego, conecte el matraz secundario a una fuente de vacío del aspirador. Pruebe que el aparato esté completamente sellado aplicando un vacío al aparato. Si el aparato está correctamente ensamblado, habrá un fuerte vacío en todos los pozos.

Todas las conexiones de los tubos se pueden envolver en una envoltura Parafilm o Saran para garantizar un sellado hermético. Antes de iniciar el procedimiento, prepare los cuatro componentes de la reacción como cuatro soluciones madre X, como se describe en el protocolo de texto. Mezcle volúmenes iguales de tampón de reacción, histidina quinasa y agua destilada doble.

Deje que estos componentes de reacción se equilibren a temperatura ambiente durante un corto período de tiempo. Para iniciar la reacción, agregue un volumen de solución de gamma-32 P ATP y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Realice un seguimiento del tiempo de reacción transcurrido con un temporizador y permita que la reacción continúe durante el tiempo deseado.

Apaga la reacción. Añadir una alícuota de la reacción al ácido fosfórico 325 milimolar. Coloque inmediatamente las reacciones apagadas en hielo hasta que se hayan terminado todas las reacciones.

Coloque el aparato de diagrama de puntos preensamblado de 96 pocillos en un recipiente secundario. Este recipiente debe ser lo suficientemente grande para que el aparato se pueda desmontar fácilmente, ya que el aparato y la membrana serán radiactivos después de su uso. Aplique un vacío al aparato de diagrama de puntos de 96 pocillos.

Una vez que el aparato esté bajo vacío, pipetee cuidadosamente la reacción apagada directamente sobre la membrana de nitrocelulosa en cada pocillo. Repita este proceso hasta que todas las reacciones se carguen en la membrana. Dado que la capacidad de unión de la nitrocelulosa es mayor que la cantidad de histidina quinasa manchada, se puede suponer que casi toda la quinasa se une a la membrana cuando se carga correctamente.

Dependiendo del aparato utilizado, tenga cuidado de no perforar la nitrocelulosa. Observe que toda la reacción ha entrado en contacto con la nitrocelulosa. Es fácil que parte de la reacción se adhiera a las paredes del pozo.

Lavar los pocillos con 100 microlitros de ácido fosfórico 25 milimolar frío como hielo. Esto permitirá que cualquier volumen de reacción que pueda haber quedado atrapado en el pozo llegue a la membrana, asegurando la carga completa de todas las reacciones. Permita que todo el volumen fluya a través de la membrana.

Desmonte con cuidado el aparato antes de apagar la aspiradora. Tenga en cuenta que tanto el aparato como la membrana de nitrocelulosa son radiactivos en este momento. No retire ningún componente del aparato del contenedor secundario.

Con pinzas, transfiera cuidadosamente la membrana de nitrocelulosa del aparato a un recipiente de aproximadamente 200 mililitros de ácido fosfórico frío helado de 25 milimolares. Coloque una tapa en este recipiente, ya que el lavado será radiactivo. En este momento, es posible que se apague la aspiradora.

Coloque el recipiente con la membrana de lavado sobre una mecedora. Deje que la membrana se balancee suavemente durante 20 minutos. Después de 20 minutos, decantar cuidadosamente la solución de lavado usada en un balde grande para el almacenamiento temporal de desechos.

Agregue 200 mililitros de ácido fosfórico 25 milimolar frío a la membrana. Lave la membrana de esta manera al menos tres veces para eliminar la señal de fondo gamma-32 P ATP de la membrana. Después del tercer lavado, pruebe la solución de lavado usada para detectar la radiación con un contador Geiger.

Continúe lavando la membrana hasta que no haya señal en la solución de lavado. Después de que la membrana esté lo suficientemente lavada, deje que la membrana se seque brevemente al aire, lo que generalmente toma cinco minutos o menos. Después de la exposición de la nitrocelulosa a un verde de fósforo, como se describe en el protocolo de texto, prepárese para la tinción y decoloración de Ponceau S.

Sumerja brevemente la membrana de nitrocelulosa en la solución de tinción Ponceau S durante uno o dos minutos. Humedece toda la membrana con el tinte antes de quitar la tinción. A continuación, decantar el exceso de Ponceau S de la membrana.

Enjuague la membrana con agua destilada doble hasta que solo se manchen las manchas de la histidina quinasa. Tenga en cuenta que este procedimiento solo funcionará si todas las manchas contienen cantidades detectables de proteína. Con unas tijeras, corte cada punto de la membrana de nitrocelulosa.

No es necesario cortar perfectamente a lo largo del borde de la mancha. Si la membrana se lavó lo suficiente, el fondo debido al tamaño variable de los puntos de corte es insignificante. Solo es importante cortar toda la mancha para cada reacción.

Con pinzas, transfiera con cuidado cada punto a viales de centelleo. No es necesario un cóctel de centelleo, ya que el fósforo 32 es fácilmente detectable por la radiación de Cherenkov. A continuación, detecte varias diluciones de solución de gamma-32 P ATP en cuadrados de nitrocelulosa de un centímetro por un centímetro.

Con pinzas, transfiera con cuidado cada cuadrado a viales de centelleo sin cóctel de centelleo. Estas muestras se utilizarán para generar una curva estándar para determinar los recuentos por minuto por picomol de la solución de ATP. Aquí se muestra la tinción de Ponceau de la membrana de nitrocelulosa.

La tinción es uniforme en todas las muestras, lo que indica que todas las muestras están igualmente cargadas. Los resultados de la fluorografía de la membrana de nitrocelulosa muestran el nivel relativo de fosfohistidina radiomarcada en cada punto. La cuarta y octava fila son controles negativos que demuestran que el exceso de ATP se lava de la membrana de nitrocelulosa.

Aquí se muestran los resultados representativos de la cuantificación de la autofosforilación de la histidina quinasa. Estos datos se generan a partir del conteo de centelleo de cada punto cortado de la membrana. La curva estándar de recuentos por minuto por picomol de ATP que se muestra aquí también se genera a partir del conteo por centelleo y se utiliza para calcular los picomoles de fosfohistidina presentes en cada muestra.

Siguiendo este procedimiento, se pueden agregar al experimento otros métodos, como la introducción de estímulos afines o proteínas que se supone que modulan la actividad de la quinasa, para responder preguntas adicionales como el efecto de estos aditivos en la actividad de la quinasa. No olvide que trabajar con radiactividad puede ser extremadamente peligroso. Siempre se deben tomar precauciones como la capacitación adecuada en seguridad radiológica y el uso de equipo de protección personal y blindaje mientras se realiza este procedimiento.