La cuantificación de la histidina quinasa bacteriana autofosforilación mediante un ensayo de nitrocelulosa Encuadernación

El objetivo general de este protocolo es cuantificar la autofosforilación de quinasas de histidina bacterianas purificadas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la señalización de dos componentes, como el efecto de los estímulos cognados en las interacciones proteína-proteína sobre la autofosforilación de las quinasas de histidina.

Las principales ventajas de esta técnica son que es un método de alto rendimiento que puede utilizarse para detectar con precisión picomoles de fosfohistidina formados y obtener parámetros cinéticos para quinasas de histidina. Como investigador posdoctoral, utilizo la filtración sobre membranas de nitrocelulosa para cuantificar ligandos radiactivos unidos a proteínas. Por consiguiente, resultó lógico desarrollar una técnica similar para cuantificar la fosforilación de histidina en quinasas bacterianas de histidina.

Comience este procedimiento con la preparación de reactivos y materiales según se describe en el protocolo escrito. Para montar el aparato de dot-plot de 96 pocillos, corte un trozo de membrana de nitrocelulosa de ocho centímetros por doce centímetros. Coloque la nitrocelulosa en el aparato de dot-plot.

Asegúrese de que la membrana encaje de manera que el aparato quede sellado y que todos los pocillos estén completamente cubiertos por la membrana. Para recoger el filtrado, conecte el aparato a un matraz aforado secundario. Desde el tubo de válvula, conecte un tubo adecuado para permitir el uso cómodo del aparato sin volcar el matraz secundario.

Luego, conecte el matraz del brazo secundario a una fuente de vacío de aspirador. Compruebe que el aparato esté completamente sellado aplicando un vacío al sistema. Si el aparato está ensamblado correctamente, habrá un vacío fuerte en todos los pocillos.

Todas las conexiones de tubos pueden envolverse con Parafilm o papel transparente para garantizar un sello hermético. Antes de comenzar, prepare los cuatro componentes de la reacción como soluciones stock X, según se describe en el protocolo escrito. Mezcle volúmenes iguales de tampón de reacción, quinasa de histidina y agua doblemente destilada.

Deje que estos componentes de la reacción se equilibren a temperatura ambiente durante un breve período. Para iniciar la reacción, agregue un volumen de solución de gamma-32 P ATP y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Registre el tiempo transcurrido de la reacción con un temporizador y deje que la reacción continúe durante el tiempo deseado.

Detenga la reacción. Añada una alícuota de la reacción a ácido fosfórico 325 milimolar. Coloque inmediatamente las reacciones detenidas en hielo hasta que todas las reacciones hayan finalizado.

Coloque el aparato de dot-plot de 96 pocillos previamente ensamblado en un recipiente secundario. Este recipiente debe ser lo suficientemente grande como para que el aparato pueda desmontarse fácilmente, ya que el aparato y la membrana serán radiactivos después de su uso. Aplique vacío al aparato de dot-plot de 96 pocillos.

Una vez que el aparato esté bajo vacío, pipetee cuidadosamente la reacción apagada directamente sobre la membrana de nitrocelulosa en cada pocillo. Repita este proceso hasta que todas las reacciones hayan sido cargadas sobre la membrana. Dado que la capacidad de unión de la nitrocelulosa es mayor que la cantidad de quinasa de histidina inmovilizada, se puede asumir que casi toda la quinasa se une a la membrana cuando se carga correctamente.

Dependiendo del aparato utilizado, tenga cuidado de no perforar la nitrocelulosa. Asegúrese de que toda la reacción haya tenido contacto con la nitrocelulosa. Es común que parte de la reacción se adhiera a las paredes del pocillo.

Lave los pocillos con 100 microlitros de ácido fosfórico frío de 25 milimolar. Esto permitirá que cualquier volumen de reacción que pudiera haber quedado atrapado en el pocillo alcance la membrana, asegurando la carga completa de todas las reacciones. Permita que todo el volumen pase a través de la membrana.

Desarme cuidadosamente el aparato antes de apagar el vacío. Tenga en cuenta que tanto el aparato como la membrana de nitrocelulosa están radiactivos en este momento. No retire ningún componente del aparato del recipiente secundario.

Con pinzas, transfiera cuidadosamente la membrana de nitrocelulosa desde el aparato a un recipiente con aproximadamente 200 mililitros de ácido fosfórico frío de 25 milimolar. Coloque una tapa en este recipiente, ya que el lavado será radiactivo. En este momento, se puede apagar el vacío.

Coloque el recipiente con la membrana de lavado sobre un agitador. Deje que la membrana se agite suavemente durante 20 minutos. Después de 20 minutos, vierta cuidadosamente la solución de lavado usada en un cubo grande para su almacenamiento temporal como residuo.

Añada 200 mililitros de ácido fosfórico 25 milimolar frío con hielo a la membrana. Lave la membrana de esta manera al menos tres veces para eliminar la señal de fondo de ATP gamma-32 P en la membrana. Después del tercer lavado, compruebe la solución de lavado usada en busca de radiación con un contador Geiger.

Continúe lavando la membrana hasta que no haya señal presente en la solución de lavado. Una vez que la membrana se haya lavado suficientemente, deje que se seque al aire brevemente, lo cual generalmente toma cinco minutos o menos. Después de la exposición del nitrato de celulosa a un verde de fósforo, como se describe en el protocolo escrito, prepárese para la tinción y descoloración con Ponceau S.

Somerga brevemente la membrana de nitrocelulosa en la solución de colorante Ponceau S durante uno o dos minutos. Humedezca completamente toda la membrana con el colorante antes de eliminarlo. A continuación, deseche el exceso de Ponceau S de la membrana.

Lave la membrana con agua doblemente destilada hasta que solo queden teñidas las manchas provenientes de la histidina quinasa. Tenga en cuenta que este procedimiento solo funcionará si todas las manchas contienen cantidades detectables de proteína. Con tijeras, corte cada mancha de la membrana de nitrocelulosa.

No es necesario cortar perfectamente siguiendo el borde de la mancha teñida. Si la membrana se lavó adecuadamente, el fondo debido al tamaño variable de las manchas recortadas es insignificante. Solo es importante recortar toda la mancha correspondiente a cada reacción.

Utilizando pinzas, transfiera cuidadosamente cada punto a viales de centelleo. No es necesario ningún cóctel de centelleo, ya que el fósforo 32 es fácilmente detectable mediante la radiación de Cherenkov. A continuación, aplique varias diluciones de la solución de ATP gamma-32 P sobre cuadrados de un centímetro por un centímetro de nitrocelulosa.

Utilizando pinzas, transfiera cuidadosamente cada cuadrado a viales de centelleo sin el cóctel de centelleo. Estas muestras se utilizarán para generar una curva patrón para determinar las cuentas por minuto por picomol de la solución de ATP. Aquí se muestra la tinción con Ponceau de la membrana de nitrocelulosa.

La tinción es uniforme en todas las muestras, lo que indica que todas las muestras están cargadas por igual. Los resultados de la fluorografía de la membrana de nitrocelulosa muestran el nivel relativo de fosfohistidina radiomarcada en cada punto. La cuarta y la octava fila son controles negativos que demuestran que el exceso de ATP se ha eliminado mediante lavado de la membrana de nitrocelulosa.

Se muestran aquí resultados representativos de la cuantificación de la autofosforilación de quinasas de histidina. Estos datos se generan mediante el recuento de centelleo de cada punto recortado de la membrana. La curva estándar de cuentas por minuto por picomol de ATP mostrada aquí también se genera mediante recuento de centelleo y se utiliza para calcular los picomoles de fosfohistidina presentes en cada muestra.

Tras seguir este procedimiento, se pueden añadir otros métodos, como la introducción de estímulos o proteínas cognatos que se hipotetiza que modulan la actividad de la quinasa, al experimento para responder preguntas adicionales, como el efecto de estos aditivos sobre la actividad de la quinasa. No olvide que trabajar con radiactividad puede ser extremadamente peligroso. Siempre se deben tomar precauciones, como una formación adecuada en seguridad radiológica y el uso de equipo de protección personal y blindaje, al realizar este procedimiento.