Name: La cuantificación de la histidina quinasa bacteriana autofosforilación mediante un ensayo de nitrocelulosa Encuadernación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprende a cuantificar la autofosforilación de histidina quinasas bacterianas mediante un ensayo de unión a nitrocelulosa. Este método de alto rendimiento detecta picomoles de fosfohistidina y proporciona parámetros cinéticos precisos.

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Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Educación a través de la Asistencia Licenciado en Áreas de programa nacional de Necesidad (P200A100044).

Precaución: Este protocolo requiere una formación adecuada en el uso y manejo de materiales radiactivos. Utilice el equipo de protección personal requerido al realizar este ensayo, incluyendo protección contra la radiación beta. Los residuos radiactivos debe manejarse con cuidado, ya que se generan grandes cantidades de residuos durante la fase de lavado del experimento. Asegúrese de que los residuos se almacena en un recipiente en posición vertical, como un gran cubo o una botella que no va a ser volcado fácilmente o se derrama. Una vez concluido el experimento, transferir cuidadosamente todos los residuos líquidos de marcado, los contenedores de residuos radiactivos. Manejar todos los materiales con cuidado, y mantener un contador Geiger cerca para vigilar el espacio de trabajo para la contaminación. NOTA: Este protocolo es una versión revisada de un ensayo se informó anteriormente de nuestro grupo. 15 phosphohistidine estabilidad en H 3 PO 4 debe ser probado por cualquier histidina quinasa no caracterizado antes de utilizar este método. El phosphohistidine stprueba de la capacidad se ha descrito previamente. 15 Un control negativo que no contiene quinasa debe ser incluida. Esto es necesario con el fin de restar la señal de fondo de cada muestra, y asegúrese de que [γ- 32 P] -ATP se lava suficientemente de la membrana. 1. Preparación de Reactivos y materiales <ol><li> Purificar histidina quinasas de cultivo bacteriano antes de usar este ensayo. <ol><li> Se purifica una histidina quinasa (ID gen 1.189.383) a partir de Vibrio parahaemolyticus (EB101, ATCC 17802) para el desarrollo de este ensayo. Clonar la quinasa en el vector de expresión pET-23aHis-VET utilizando NdeI y sitios de restricción XhoI, y llevar a cabo la mutagénesis dirigida al sitio para producir el mutante construir Vp1876 D499A. </li><li> Transformar el plásmido en E. coli BL21 (DE3) pLysS, y hacer crecer las células en medio TB a 37 ° C. culturas suplemento con ampicilina (100 mg / ml) y cloranfenicol (34 mg / ml), y crecer con agitación(250 rpm) a un OD 600 de 0,6. </li><li> Inducir la expresión de proteína con IPTG a una concentración final de 25 mM, y crecer cultivos durante la noche a 16 ° C. Las células de la cosecha por centrifugación (5.000 xg), se lisan por sonicación, y se centrifuga para eliminar los restos celulares (18.000 xg). </li><li> Se purifica el quinasa marcada con His usando Ni-NTA agarosa. Confirmar pureza por SDS-PAGE. Optimizar la purificación para cada proteína, y confirmar la pureza antes de usar este ensayo. </li></ol></li><li> Preparar la solución de lavado mM H 25 3 PO 4. Para 1 L de agua desionizada destilada, añadir H 3 PO 4 a una concentración final de 25 mM. El pH de esta solución es aproximadamente 2,0. Coloca 25 mm de H 3 PO 4 en hielo. </li><li> Preparar una solución 13x social de 325 mm de H 3 PO 4, que se utiliza para apagar la reacción quinasa. El pH de esta solución es aproximadamente 1,5. Coloque 325 mm de H 3 PO 4 en hielo. NOTA: H 3 PO 4 </sub&gt; A una concentración final de 25 mM suficientemente apaga la reacción, y también ayuda a bloquear fosfato radiomarcado que no está unido a la histidina de la unión a la membrana de nitrocelulosa. </li><li> Preparar una solución de tampón de reacción de stock 4x que contiene mM Tris-HCl pH 8,0 160, KCl 600 mM, 16 mM MgCl 2, y 40% de glicerol. </li><li> Cuantificar la concentración de histidina quinasa de proteínas por métodos establecidos de concentración (Bradford, UV-Vis, etc.). 16,17 Preparar una solución de histidina quinasa con una concentración que es 4 veces la concentración final deseada. Para obtener la señal sea adecuada, la concentración final de proteína en la reacción debe ser idealmente al menos 5 micras. </li><li> Preparar una radiomarcado 4x [γ- 32 P] -ATP solución con la concentración 4x apropiada de ATP no marcado y etiquetado: relación no marcado para el experimento. NOTA: La cantidad de [γ- 32P] -ATP que debe ser incluida en esta mezcla depende de la cantidad de [^7; - 32 P] -ATP última instancia, se vio para cada reacción. Hemos obtenido señal adecuada con concentraciones finales que varían de entre 0,1 - 5 Ci por reacción. Es importante que la etiqueta: unlabeled relación ATP se mantiene constante para todas las reacciones en un experimento dado. Las diluciones en serie se deben hacer cuando se desean múltiples concentraciones de ATP, ya que esto así mantener el marcado: no marcado constante relación de ATP en todas las concentraciones. Las concentraciones finales de ATP típicamente varían de 10 M a al menos 1 mM, y cada concentración se deben ensayaron por triplicado para obtener datos cinéticos fiables. </li><li> 96- aparato de transferencia así punto <ol><li> Cortar un niño de 8 cm x 12 cm pedazo de membrana de nitrocelulosa (tamaño de poro de 0,2 micras). </li><li> nitrocelulosa posición en un aparato de transferencia de mancha, asegurándose de que la membrana se ajusta de tal manera que el aparato está sellado, y todos los pocillos están completamente cubiertos por la membrana. Si se ensambla correctamente, no debe haber ninguna fuga de aire cuando el vacío es aplIED. </li><li> Para recoger filtrado, conectar el aparato a un matraz de brazo lateral secundaria. Desde el vástago de la válvula, conectar la tubería adecuada tal que el aparato puede ser utilizado cómodamente sin inclinar el matraz secundaria. </li><li> Conectar el matraz de brazo lateral secundaria a la fuente de aspiración / vacío. </li><li> Prueba de que el aparato está completamente sellado mediante la aplicación de vacío al aparato. Si el aparato está montado correctamente, un fuerte vacío estará presente en todos los pozos. Todas las conexiones de los tubos pueden ser envueltos en Parafilm o Saran Wrap para asegurar un sellado hermético. </li><li> Opcionalmente, para poner a prueba el vacío, pipeta de 100 l de tampón de reacción en un pocillo. El vacío debe ser lo suficientemente fuerte como para extraer todo el líquido a través del pozo y sobre la membrana. </li><li> Desactivar el vacío hasta que todas las muestras están listas para ser visto en la membrana. </li></ol></li></ol> 2. reacción de iniciación y el temple <ol><li> Mezcla de componentes de la reacción <ol><li> Antes de Initiación, preparar los cuatro componentes de la reacción como soluciones madre 4x: tampón de reacción (ver sección 1.4), histidina quinasa (1.5), [γ- 32P] -ATP (1,6), y ddH2O </li><li> Mezclar volúmenes iguales de tampón de reacción, histidina quinasa, y ddH 2 O. permitir que estos componentes de la reacción se equilibren a temperatura ambiente durante un corto tiempo (10 min). Nota: El volumen final de reacción depende de si el experimento es dependiente del tiempo, enzima dependiente de, o dependiente de sustrato. reacciones dependientes del tiempo deben ser más grandes, como múltiples alícuotas se toman de la misma reacción y templan en el punto de tiempo deseado. El volumen de reacción dependerá del número de puntos de tiempo deseados. El ensayo se optimiza para cada punto de la membrana de nitrocelulosa para contener 30 l de la reacción. Por lo tanto, si se desean 10 puntos de tiempo, el volumen de reacción debe ser de al menos 300 l (un volumen mayor tal como 330 l sería preferible en el caso de los errores de pipeteo).La enzima y el sustrato experimentos dependiente requieren volúmenes de reacción más pequeños. El volumen de reacción para estos experimentos puede ser tan pequeño como 30 l, ya que este es el volumen final que va a ser detectado en la membrana de nitrocelulosa. </li><li> Para iniciar la reacción, añadir un volumen de solución [γ- 32P] -ATP a la reacción y mezclar pipeteando arriba y abajo. Seguimiento de tiempo de reacción transcurrido con un temporizador y permitir que la reacción tenga lugar durante el tiempo deseado. </li><li> Para detener la reacción, agregar 1/13 del volumen de reacción total de 325 mM H 3 helada PO 4 a la reacción y la mezcla pipeteando arriba y abajo. Alternativamente, añadir una parte alícuota de la reacción a 325 mm de H 3 PO 4. NOTA: La concentración final de H 3 PO 4 debe ser de 25 mM para saciar suficientemente la reacción. Por ejemplo, añadir 2,5 l de 325 mM de H 3 PO 4 a 30 l de reacción, o añadir 30 l de reacción de 2,5 l de 325 mM de H 3 PO &lt;sub&gt; 4. El pH final de la reacción es de aproximadamente 4,0. Esta concentración de H 3 PO 4 ha sido probado y confirmado para detener la reacción quinasa en este tampón sin degradar fosfohistidina. <ol><li> Por ejemplo, la mezcla de 7,5 l de tampón de reacción 4x, 7,5 l de 4x histidina quinasa, y 7,5 l ddH2O iniciar la reacción con 7,5 l [γ- 32P] -ATP. Se detiene la reacción con 2,5 l 325 mM H 3 PO 4. </li></ol></li><li> Colocar inmediatamente reacciones enfriadas en hielo hasta que todas las reacciones han sido terminados. NOTA: Para maximizar la eficiencia, es aconsejable para iniciar una reacción se inician cada 15 o 20 s hasta que todas las reacciones, y una vez que ha pasado el tiempo de reacción deseado, apagar una reacción cada 15 o 20 s hasta que todos se apaga. Para aquellos que están usando el ensayo por primera vez, un intervalo más largo puede ser más manejable. </li></ol></li></ol> 3. Spotting oReacciones f templado en nitrocelulosa <ol><li> Comience vacío en bien de 96 aparatos de transferencia de puntos <ol><li> Colocar el aparato de transferencia de puntos de 96 pocillos pre-ensamblado (sección 1.7) en un recipiente secundario. Este recipiente debe ser lo suficientemente grande para que el aparato pueda ser desmontada fácilmente en, como el aparato y la membrana serán radioactivo después de su uso. </li><li> Aplicar vacío al aparato de transferencia de puntos de 96 pocillos. </li><li> Una vez que el aparato está en vacío, pipetear cuidadosamente la reacción se inactivó directamente sobre la membrana de nitrocelulosa en cada pocillo. Repetir hasta que todas las reacciones se cargan en la membrana. Dado que la capacidad de unión de nitrocelulosa (75 a 110 g / cm 2) es mayor que la cantidad de histidina quinasa que está manchado, se puede suponer que casi la totalidad de la quinasa se une a la membrana cuando se cargan correctamente. NOTA: En función del aparato utilizado, se debe tener cuidado de no perforar la nitrocelulosa. Observe que toda la reacción ha hecho contacto con THe nitrocelulosa. Es fácil para algunos o la totalidad de la reacción a pegarse a las paredes del pozo, y no llegan a la nitrocelulosa. </li><li> Lavar los pocillos con 100 l de 25 mM H 3 PO 4 enfriado con hielo. Esto permitirá que cualquier volumen de reacción que pueda haber quedado atrapado en el pozo para llegar a la membrana, asegurando la carga completa de todas las reacciones. Permitir que todo el volumen fluya a través de la membrana. </li></ol></li><li> desmontaje Aparato y la transferencia de membrana de nitrocelulosa <ol><li> Con cuidado, desmontar el aparato antes de apagar el vacío. Se informa de que tanto el aparato y la membrana de nitrocelulosa son radiactivos en este momento. No quite ninguna componentes del aparato desde el recipiente secundario en este momento. </li><li> Con unas pinzas, transferir cuidadosamente la membrana de nitrocelulosa desde el aparato a un contenedor de aproximadamente 200 ml 25 mM enfriado con hielo H 3 PO 4. Colocar una tapa sobre el envase, como el lavado será radioactive. En este momento, el vacío puede ser apagado. </li></ol></li></ol> 4. Procesamiento de nitrocelulosa <ol><li> lavado de nitrocelulosa <ol><li> Coloque el recipiente con la membrana de lavado en un eje de balancín. Deje que la membrana hasta el rock suavemente durante 20 minutos. </li><li> Después de 20 minutos, decantar cuidadosamente la solución de lavado utilizado en un gran cubo que se utiliza para el almacenamiento temporal de residuos. Añadir 200 ml de helado 25 mM de H 3 PO 4 a la membrana y repetir. NOTA: Por lo menos tres 20 min lavados son necesarias para eliminar de fondo [γ- 32 P] -ATP señal de la membrana. Después del tercer lavado, probar la solución de lavado usado para la radiación con un contador Geiger. Continuar el lavado de la membrana como se describe anteriormente hasta que no hay señal presente en la solución de lavado. </li></ol></li><li> secado de nitrocelulosa <ol><li> Después de que la membrana se lava suficientemente, permitir que la membrana se seque al aire brevemente. Esto suele tardar 5 minutos o menos.</li></ol></li></ol> 5. La exposición a la pantalla de almacenamiento de fósforo Nota: Esta sección es opcional. La exposición de la membrana a una pantalla de fósforo es beneficioso en que permite la visualización de la intensidad de la quinasa radiomarcado en cada punto de la membrana. La intensidad relativa de estas manchas es directamente proporcional a la cantidad de histidina quinasa fosforilada en cada punto. La intensidad se puede cuantificar con el software de procesamiento de imágenes, y estos resultados se puede comparar con los generados de la sección 7. Además, este paso permite el control de calidad. Las anomalías observadas en este análisis podrían explicar los resultados irregulares obtenidos de recuento de centelleo. <ol><li> preparación pantalla de fósforo <ol><li> Antes de exponer la membrana a la pantalla de almacenamiento de fósforo, exponer la pantalla de fósforo a la luz blanca durante al menos 5 min. Esto asegura que cualquier imagen residual que pueda estar en manos de la pantalla se borra. </li><li> Asegúrese de que la pantalla está limpiay seco. Si es necesario, limpie suavemente la pantalla con una solución de limpieza pantalla de fósforo aprobado por el fabricante de la pantalla, y seque. </li></ol></li><li> preparación de membrana de nitrocelulosa <ol><li> envolver con cuidado la membrana de nitrocelulosa seca en una delgada envoltura de plástico para evitar que la humedad residual de dañar la pantalla de fósforo. Asegúrese de que no queden arrugas o burbujas. </li></ol></li><li> La exposición a la pantalla de fósforo <ol><li> Colocar la membrana de nitrocelulosa envuelto en el casete de pantalla de fósforo de almacenamiento, coloque la pantalla boca abajo sobre la membrana, y cerrar el casete. No abra el casete o mover la membrana hasta que sea tiempo para escanear la pantalla de fósforo, como el desplazamiento de la membrana durante la exposición hará que una imagen doble o manchada para ser capturado. </li><li> Exponer durante al menos 4 h, o siempre que el fabricante de la pantalla de fósforo sugiere. </li><li> Una vez que se completa la exposición, escanear la pantalla de fósforo y la captura de la imagen con un escáner de fósforo. </li></ol></li></ol> 6. Preparación de nitrocelulosa de membrana para recuento de centelleo <ol><li> Ponceau S tinción y la decoloración <ol><li> Brevemente sumergir la membrana de nitrocelulosa en solución de tinción Ponceau S (0,1% Ponceau S (w / v) en 5% de ácido acético) para 1 - 2 min. Mojar toda la membrana con la mancha antes de la decoloración. </li><li> Decantar el exceso de Ponceau S de la membrana. </li><li> Enjuague la membrana con ddH2O hasta que sólo las manchas de la histidina quinasa están manchadas. Tenga en cuenta que este procedimiento sólo funcionará si todos los lugares contienen cantidades detectables de proteína. NOTA: Este paso es necesario para confirmar que la quinasa se une a la nitrocelulosa, y que la carga de proteína es incluso a lo largo de todos los puntos. También permite la quinasa manchado a cortar fácilmente hacia fuera de la membrana. </li></ol></li><li> Recorte de las manchas <ol><li> Con unas tijeras, corte cada punto de la membrana de nitrocelulosa. No es necesario cortar perfectamente along del borde de la mancha manchado; si la membrana se lavó suficientemente, de fondo debido a la variación del tamaño de los puntos cortados será insignificante. Sólo es importante que cortar todo el lugar para cada reacción. </li><li> Con unas pinzas, transferir cuidadosamente cada punto en viales de centelleo. Sin cóctel de centelleo es necesario ya que el P32 es fácilmente detectable por la radiación de Cherenkov. NOTA: Como alternativa, el punto se puede cortar a cabo mediante una sonda afilada. Retire cada punto de la nitrocelulosa con el perforador de corcho, y empujarlo en un vial de centelleo con un alfiler. Con este método, la membrana no tiene que ser tocado, minimizando aún más la exposición de radiación. </li></ol></li><li> La determinación de CPM / pmol de solución de [γ- 32P] -ATP <ol><li> Contado varias diluciones de [γ- 32P] -ATP solución (sección 1.5) a 1 cm x 1 cm cuadrados de nitrocelulosa. seca brevemente al aire. </li><li> Con unas pinzas, transferir cuidadosamente cada cuadrado en centelleoviales. No cóctel de centelleo es necesario. Estas muestras se utilizaron para generar una curva estándar para determinar el CPM / pmol de la solución de ATP. </li></ol></li></ol> Recuento de centelleo 7. <ol><li> Cargar todos los viales de centelleo en casetes contador de centelleo. casetes de carga en un contador de centelleo. </li><li> Ejecutar programa de recuento de centelleo para medir la RPC para cada vial. Estos datos, junto con el CPM / pmol de la mezcla de ATP radiomarcado (de la sección 6.3), se pueden utilizar para calcular la cantidad de histidina quinasa fosforilada presente en cada punto, y por lo tanto la velocidad de autofosforilación. 18,19 </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El ensayo de unión de nitrocelulosa que hemos descrito tiene muchas ventajas sobre los métodos previamente usados ​​para caracterizar histidina quinasas. En comparación con / autorradiografía basado-PAGE SDS tradicional, nuestro método es un mayor rendimiento y menos tiempo. La membrana de nitrocelulosa es más fácil de manejar que los geles de SDS, y no necesita ser fijado. Ponceau tinción de la nitrocelulosa permite que las manchas de proteínas para ser visualizadas. Esto proporciona una manera fácil de cortar cada pun...

respuesta de adaptación es crucial para la supervivencia bacteriana. Con el fin de detectar y responder a los cambios ambientales, las bacterias utilizan un sistema de estímulo-respuesta conocida como señalización de dos componentes. 1,2 En un sistema de dos componentes típico, la histidina quinasa detecta un estímulo cognado, autophosphorylates su residuo de histidina conservado, a continuación, transfiere el fosfato a un residuo de aspartato conservado en el dominio receptor de una proteína de regulador de la respuesta. 3 Este evento desencadena un cambio en la actividad del regulador de la respuesta, que estimula un efecto aguas abajo. 4,5 Por lo tanto, las bacterias son capaces de sentir y adaptarse a los cambios en el medio ambiente local. Algunos sistemas de señalización de dos componentes se desvían de este arquetipo. En algunos casos, el dominio sensorial de la histidina quinasa es una proteína independiente, que detecta directamente la entrada sensorial y modifica la actividad de quinasa a través de una interacción proteína-proteína. 6 - 8 Sin embargo, el fondoamental proceso y el papel global del sistema sigue siendo el mismo. señalización de dos componentes es un sistema de estímulo-respuesta omnipresente que es esencial para la supervivencia bacteriana, y histidina quinasas juegan un papel crítico en la transducción de la señal. 9 A pesar de la importancia de la histidina quinasas a la biología bacteriana, siguen siendo mal caracterizado. Esto es debido a la inestabilidad inherente de fosfohistidina, y la falta de un método práctico para la medición de la autofosforilación. Fosfohistidina es más lábil que fosfoserina, fosfotreonina y fosfotirosina. 10 Por lo tanto, las técnicas que se utilizan comúnmente para analizar quinasas Ser / Thr / Tyr no son aplicables para histidina quinasas. 11 ensayos in vitro para el estudio de histidina quinasas en gran medida se han limitado a autorradiografía SDS-PAGE. 12,13 En este método, [γ- 32 P] -ATP se incuba con la quinasa, y la fosforilación de la quinasa se analiza por polelectroforesis en gel de yacrylamide (PAGE) seguido por autorradiografía del gel. Este método puede ser usado para monitorear la autofosforilación de la quinasa, así como phosphotransfer de la quinasa a un regulador de la respuesta. Sin embargo, este método tiene notables deficiencias. Los ensayos basados ​​en páginas son de bajo rendimiento y consume mucho tiempo. Tales limitaciones no son propicias para la caracterización de una proteína y la determinación de sus parámetros cinéticos. Un método alternativo para el estudio de quinasas de histidina que fue publicado recientemente utiliza anticuerpos fosfohistidina para detectar la autofosforilación. 14 Si bien este método tiene la ventaja de distinguir entre 1-fosfohistidina y 3-fosfohistidina, dependiendo de la instrumentación utilizada para la detección, este método puede no ofrecer una amplia gama dinámica o límite superior alto de detección. Por lo tanto, hay una necesidad para un ensayo más rápido, menos laborioso y más sensible que puede ser utilizado para estudiar estas proteínas importantes. A continuación, describimos ydemonstrate un ensayo de unión de nitrocelulosa cuidadosamente desarrollado que se puede utilizar para cuantificar la autofosforilación de histidina quinasas bacterianas purificadas in vitro. Este ensayo es un mayor rendimiento y menos tiempo que los ensayos basados ​​en páginas. El método también utiliza la radiación Cherenkov para la cuantificación fosfohistidina, que ofrece un alto límite superior de detección y un gran rango dinámico. El ensayo se puede usar para determinar los parámetros cinéticos para la histidina quinasas.

<table><tbody><tr><td>Ácido fosfórico</td><td>VWR</td><td>AAAA18067-AP</td><td>Para reacciones de enfriamiento y lavado de nitrocelulosa</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>RPI</td><td>T60040-5000.0</td><td>Tris-HCl pH 8.0, para tampón de reacción de quinasa</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>RPI</td><td>P41000-2500.0</td><td>Para tampón de reacción de quinasa</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>RPI</td><td>M24000-500.0</td><td>Para tampón</td></tr> <tr><td>de reacción de quinasaGlicerol</td><td>RPI</td><td>G22020-4000.0</td><td>Para tampón de reacción de quinasa</td></tr><tr><td>5'-ATP</td><td>Promega</td><td>E6011</td><td>Sustrato de quinasa</td></tr><tr><td>[&gamma;-32P]-5'-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG002Z250UC&nbsp;</td><td>6.000 Ci/mmol</td></tr><tr><td>Aparato de transferencia de puntos de 96 pocillos</td><td>Bio-rad</td><td>1706545</td><td>Para reacciones de detección</td></tr><tr><td>Nitrocelulosa</td><td>Whatman</td><td>32-10401396-PK</td><td>Para reacciones de detección</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma aldrich</td><td>P3504-50G</td><td>Para tinción de nitrocelulosa</td></tr></tbody></table>

la cuantificación de la histidina quinasa bacteriana autofosforilación mediante un ensayo de nitrocelulosa encuadernación

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Demostramos un método útil para cuantificar la autofosforilación de histidina quinasas bacterianas purificadas. Las histidina quinasas son conocidas por su participación en la transducción de señales de dos componentes, un sistema ubicuo a través del cual las bacterias detectan y responden a los estímulos ambientales. La señalización de dos componentes presenta la autofosforilación de una histidina quinasa, seguida de fosfotransferencia al dominio receptor de una proteína reguladora de la respuesta, que en última instancia conduce a una respuesta de salida. La autofosforilación de la histidina quinasa responde a la presencia de un estímulo ambiental afín, lo que proporciona a las bacterias un medio para detectar y responder a los cambios en el medio ambiente. A pesar de su importancia en la biología bacteriana, las histidina quinasas siguen siendo poco conocidas debido a la labilidad inherente de la fosfohistidina. Los métodos convencionales para el estudio de estas proteínas, como la autorradiografía SDS-PAGE, presentan importantes deficiencias. Hemos desarrollado un ensayo de unión a nitrocelulosa que se puede utilizar para caracterizar las histidina quinasas. El protocolo para este ensayo es simple y fácil de ejecutar. Nuestro método es de mayor rendimiento, requiere menos tiempo y ofrece un mayor rango dinámico que la autorradiografía SDS-PAGE.

<html> Un conjunto de datos representativo fue generado que ofrece una imagen capturada con un fósforo de imágenes (Figura 1), Ponceau S tinción de la membrana de nitrocelulosa (Figura 2), y los datos de recuento de centelleo (Figura 3). La figura 3A muestra las constantes cinéticas de la enzima en una representación de Lineweaver-Burk. Estos resultados se obtuvieron utilizando una histidina quinasa purificada de la espec...

Informamos y demostramos un ensayo de unión a nitrocelulosa optimizado que se puede utilizar para cuantificar la autofosforilación de histidina quinasas bacterianas purificadas. Nuestro método tiene varias ventajas sobre las técnicas tradicionales basadas en SDS-PAGE, proporcionando una alternativa valiosa para caracterizar estas importantes proteínas.

La cuantificación de la histidina quinasa bacteriana autofosforilación mediante un ensayo de nitrocelulosa Encuadernación

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

El objetivo general de este protocolo es cuantificar la autofosforilación de quinasas de histidina bacterianas purificadas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la señalización de dos componentes, como el efecto de los estímulos cognados en las interacciones proteína-proteína sobre la autofosforilación de las quinasas de histidina.Las principales ventajas de esta técnica son que es un método de alto rendimiento que puede utilizarse para detectar con precisión picomoles de fosfohistidina formados y obtener parámetros cinéticos para quinasas de histidina. Como investigador posdoctoral, utilizo la filtración sobre membranas de nitrocelulosa para cuantificar ligandos radiactivos unidos a proteínas. Por consiguiente, resultó lógico desarrollar una técnica similar para cuantificar la fosforilación de histidina en quinasas bacterianas de histidina.Comience este procedimiento con la preparación de reactivos y materiales según se describe en el protocolo escrito. Para montar el aparato de dot-plot de 96 pocillos, corte un trozo de membrana de nitrocelulosa de ocho centímetros por doce centímetros. Coloque la nitrocelulosa en el aparato de dot-plot.Asegúrese de que la membrana encaje de manera que el aparato quede sellado y que todos los pocillos estén completamente cubiertos por la membrana. Para recoger el filtrado, conecte el aparato a un matraz aforado secundario. Desde el tubo de válvula, conecte un tubo adecuado para permitir el uso cómodo del aparato sin volcar el matraz secundario.Luego, conecte el matraz del brazo secundario a una fuente de vacío de aspirador. Compruebe que el aparato esté completamente sellado aplicando un vacío al sistema. Si el aparato está ensamblado correctamente, habrá un vacío fuerte en todos los pocillos.Todas las conexiones de tubos pueden envolverse con Parafilm o papel transparente para garantizar un sello hermético. Antes de comenzar, prepare los cuatro componentes de la reacción como soluciones stock X, según se describe en el protocolo escrito. Mezcle volúmenes iguales de tampón de reacción, quinasa de histidina y agua doblemente destilada.Deje que estos componentes de la reacción se equilibren a temperatura ambiente durante un breve período. Para iniciar la reacción, agregue un volumen de solución de gamma-32 P ATP y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Registre el tiempo transcurrido de la reacción con un temporizador y deje que la reacción continúe durante el tiempo deseado.Detenga la reacción. Añada una alícuota de la reacción a ácido fosfórico 325 milimolar. Coloque inmediatamente las reacciones detenidas en hielo hasta que todas las reacciones hayan finalizado.Coloque el aparato de dot-plot de 96 pocillos previamente ensamblado en un recipiente secundario. Este recipiente debe ser lo suficientemente grande como para que el aparato pueda desmontarse fácilmente, ya que el aparato y la membrana serán radiactivos después de su uso. Aplique vacío al aparato de dot-plot de 96 pocillos.Una vez que el aparato esté bajo vacío, pipetee cuidadosamente la reacción apagada directamente sobre la membrana de nitrocelulosa en cada pocillo. Repita este proceso hasta que todas las reacciones hayan sido cargadas sobre la membrana. Dado que la capacidad de unión de la nitrocelulosa es mayor que la cantidad de quinasa de histidina inmovilizada, se puede asumir que casi toda la quinasa se une a la membrana cuando se carga correctamente.Dependiendo del aparato utilizado, tenga cuidado de no perforar la nitrocelulosa. Asegúrese de que toda la reacción haya tenido contacto con la nitrocelulosa. Es común que parte de la reacción se adhiera a las paredes del pocillo.Lave los pocillos con 100 microlitros de ácido fosfórico frío de 25 milimolar. Esto permitirá que cualquier volumen de reacción que pudiera haber quedado atrapado en el pocillo alcance la membrana, asegurando la carga completa de todas las reacciones. Permita que todo el volumen pase a través de la membrana.Desarme cuidadosamente el aparato antes de apagar el vacío. Tenga en cuenta que tanto el aparato como la membrana de nitrocelulosa están radiactivos en este momento. No retire ningún componente del aparato del recipiente secundario.Con pinzas, transfiera cuidadosamente la membrana de nitrocelulosa desde el aparato a un recipiente con aproximadamente 200 mililitros de ácido fosfórico frío de 25 milimolar. Coloque una tapa en este recipiente, ya que el lavado será radiactivo. En este momento, se puede apagar el vacío.Coloque el recipiente con la membrana de lavado sobre un agitador. Deje que la membrana se agite suavemente durante 20 minutos. Después de 20 minutos, vierta cuidadosamente la solución de lavado usada en un cubo grande para su almacenamiento temporal como residuo.Añada 200 mililitros de ácido fosfórico 25 milimolar frío con hielo a la membrana. Lave la membrana de esta manera al menos tres veces para eliminar la señal de fondo de ATP gamma-32 P en la membrana. Después del tercer lavado, compruebe la solución de lavado usada en busca de radiación con un contador Geiger.Continúe lavando la membrana hasta que no haya señal presente en la solución de lavado. Una vez que la membrana se haya lavado suficientemente, deje que se seque al aire brevemente, lo cual generalmente toma cinco minutos o menos. Después de la exposición del nitrato de celulosa a un verde de fósforo, como se describe en el protocolo escrito, prepárese para la tinción y descoloración con Ponceau S.Somerga brevemente la membrana de nitrocelulosa en la solución de colorante Ponceau S durante uno o dos minutos. Humedezca completamente toda la membrana con el colorante antes de eliminarlo. A continuación, deseche el exceso de Ponceau S de la membrana.Lave la membrana con agua doblemente destilada hasta que solo queden teñidas las manchas provenientes de la histidina quinasa. Tenga en cuenta que este procedimiento solo funcionará si todas las manchas contienen cantidades detectables de proteína. Con tijeras, corte cada mancha de la membrana de nitrocelulosa.No es necesario cortar perfectamente siguiendo el borde de la mancha teñida. Si la membrana se lavó adecuadamente, el fondo debido al tamaño variable de las manchas recortadas es insignificante. Solo es importante recortar toda la mancha correspondiente a cada reacción.Utilizando pinzas, transfiera cuidadosamente cada punto a viales de centelleo. No es necesario ningún cóctel de centelleo, ya que el fósforo 32 es fácilmente detectable mediante la radiación de Cherenkov. A continuación, aplique varias diluciones de la solución de ATP gamma-32 P sobre cuadrados de un centímetro por un centímetro de nitrocelulosa.Utilizando pinzas, transfiera cuidadosamente cada cuadrado a viales de centelleo sin el cóctel de centelleo. Estas muestras se utilizarán para generar una curva patrón para determinar las cuentas por minuto por picomol de la solución de ATP. Aquí se muestra la tinción con Ponceau de la membrana de nitrocelulosa.La tinción es uniforme en todas las muestras, lo que indica que todas las muestras están cargadas por igual. Los resultados de la fluorografía de la membrana de nitrocelulosa muestran el nivel relativo de fosfohistidina radiomarcada en cada punto. La cuarta y la octava fila son controles negativos que demuestran que el exceso de ATP se ha eliminado mediante lavado de la membrana de nitrocelulosa.Se muestran aquí resultados representativos de la cuantificación de la autofosforilación de quinasas de histidina. Estos datos se generan mediante el recuento de centelleo de cada punto recortado de la membrana. La curva estándar de cuentas por minuto por picomol de ATP mostrada aquí también se genera mediante recuento de centelleo y se utiliza para calcular los picomoles de fosfohistidina presentes en cada muestra.Tras seguir este procedimiento, se pueden añadir otros métodos, como la introducción de estímulos o proteínas cognatos que se hipotetiza que modulan la actividad de la quinasa, al experimento para responder preguntas adicionales, como el efecto de estos aditivos sobre la actividad de la quinasa. No olvide que trabajar con radiactividad puede ser extremadamente peligroso. Siempre se deben tomar precauciones, como una formación adecuada en seguridad radiológica y el uso de equipo de protección personal y blindaje, al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este video muestra una técnica de cuantificación sensible de la fosforilación de proteínas utilizando un ensayo pull-down de una sola molécula. La funcionalización de la polietilenglicol-biotina y el uso de anticuerpos marcados aumenta la detección de tirosina fosforilada con especificidad.

Ensayo pull-down de molécula única para el análisis de fosforilación de proteínas: una técnica de alto rendimiento para cuantificar la fosforilación de proteínas en el lisado celular

Este video demuestra la acción capilar radial diferencial del ensayo de ligandos, una técnica para el cribado sistemático de alto rendimiento de proteínas de unión a segundo mensajero de nucleótidos intracelulares. Esta técnica permite la unión directa de los mensajeros a la proteína diana sobreexpresada en el lisado celular, evitando la necesidad de purificación de la proteína.

Acción capilar radial diferencial del ensayo de ligando: una técnica de alto rendimiento para identificar proteínas intracelulares de unión a segundo mensajero de nucleótidos bacterianos

Describimos aquí un método para identificar múltiples fosforilaciones de una proteína intrínsecamente desordenada mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), utilizando la proteína Tau como caso de estudio. La Tau recombinante se enriquece isotópicamente y se modifica in vitro mediante una quinasa antes de la adquisición y el análisis de datos.

Nuclear espectroscopía de resonancia magnética para la identificación de múltiples fosforilaciones de proteínas intrínsecamente desordenadas

Las proteínas quinasas son enzimas de señalización altamente evolucionadas y andamios que son críticos para la transducción de señales inter e intracelulares. Se presenta un protocolo para medir la actividad quinasa mediante el uso de adenosina trifosfato radiomarcado ([γ- 32 P] ATP), un método fiable para ayudar a la elucidación de la regulación de señalización celular.

Ensayo de la actividad de proteína quinasa con ATP radiomarcado

Quinasa dependiente de ciclina 1 (Cdk1) está activado en la fase G2 del ciclo celular y regula muchas vías celulares. Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo de quinasa en vitro con Cdk1, que permite la identificación de sitios de fosforilación de Cdk1 específicos para establecer dianas celulares de esta quinasa importante.

Identificación de quinasa dependiente de ciclina 1 sitios específicos de fosforilación por una quinasa In Vitro ensayo

Aquí, describimos un método para purificar enzimas pyrophosphokinase etiqueta histidina y utilizando cromatografía en capa fina de sustratos marcados radiactivamente y productos para análisis de la actividad enzimática in vitro. El ensayo de actividad de la enzima es ampliamente aplicable a la quinasa, ciclasa de nucleótidos o reacción de transferencia de fósforo cuyo mecanismo incluye la hidrólisis de nucleótidos trifosfato.

Una purificación y análisis de actividad In Vitro de una (p) ppGpp sintetasa de Clostridium difficile

Las histona de clase 1 (HDACs) como la RpdA han cobrado importancia como posibles objetivos para tratar las infecciones fúngicas. Aquí presentamos un protocolo para el enriquecimiento específico de RpdA con etiqueta TAP combinado con un ensayo de actividad HDAC que permite la prueba in vitro de la eficacia de los inhibidores de la histona deacetilasa.

Enriquecimiento en un solo paso de una histona deacetilasa con etiqueta TAP del hongo filamentoso Aspergillus nidulans para la prueba de actividad enzimática

Caracterizamos una nueva proteína quinasa utilizando enfoques bioquímicos robustos: análisis de Western Blot con un anticuerpo específico específico específico específico en diferentes líneas y tejidos celulares, interacciones por experimentos de coinmunoprecipitación, actividad quinasa detectada por Western Blot usando un anticuerpo fosfo-específico y por el etiquetado ATP de32P.

Caracterización a nivel molecular utilizando enfoques bioquímicos robustos de una nueva proteína kinasa

Este protocolo describe un ensayo no radioactivo para medir la actividad quinasa de las quinasas de polinucleótidos (PNK) en sustratos pequeños de ADN y ARN.

Ensayo no radioactivo para medir la fosforilación de polinucleótido de sustratos de nucleótidos pequeños

El presente protocolo describe la preparación de muestras y el análisis de datos para cuantificar la fosforilación de proteínas utilizando un ensayo mejorado de extracción de una sola molécula (SiMPull).

Un ensayo optimizado de extracción de una sola molécula para la cuantificación de la fosforilación de proteínas

Los ensayos químicos rápidos y precisos para detectar inhibidores específicos son una herramienta importante en el arsenal de desarrollo de fármacos. Aquí, presentamos un ensayo químico escalable de acetil-clic para medir la inhibición de la actividad de acetilación de HAT1.

Un ensayo químico de acetil-clic para medir la acetilación de la acetil 1 de la histona acetiltransferasa 1

Aprende a cuantificar la autofosforilación de histidina quinasas bacterianas mediante un ensayo de unión a nitrocelulosa. Este método de alto rendimiento detecta picomoles de fosfohistidina y proporciona parámetros cinéticos precisos.

La cuantificación de la histidina quinasa bacteriana autofosforilación mediante un ensayo de nitrocelulosa Encuadernación

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