Identificación de quinasa dependiente de ciclina 1 sitios específicos de fosforilación por una quinasa In Vitro ensayo

El objetivo general de este ensayo de quinasa in vitro es identificar sitios de fosforilación en una proteína de interés que sean específicos para la quinasa quinasa dependiente de ciclina 1. La identificación de sitios de fosforilación específicos de CDK1 es importante, ya que proporciona información mecanicista sobre cómo CDK1 controla el ciclo celular. La regulación del ciclo celular es fundamental para la segregación cromosómica en fase completa y los defectos conducen a aberraciones cromosómicas y cáncer.

La principal ventaja de esta técnica es que se basa en proteínas purificadas, por lo que se puede aplicar a cualquier organismo modelo y produce resultados fiables, especialmente cuando se combina con estudios funcionales en células. Este método es importante ya que el número conocido de dianas de CDK1 es todavía bajo, a pesar de que CDK1 fosforila aproximadamente entre el 8 y el 13% del proteo. Aunque este método identifica sitios de fosforilación específicos de CDK1, puede modificarse para identificar sitios de fosforilación para otras quinasas, siempre que la quinasa purificada esté disponible.

Por lo general, los individuos nuevos en este método tendrán dificultades porque las condiciones para el ensayo de quinasa deben optimizarse para cada proteína objetivo para obtener una alta eficiencia de fosforilación. Preferiblemente 100%Utilice el software IGPS 3.0 y visite el servidor web para predecir los sitios de fosforilación específicos de CDK1 en la secuencia de la proteína diana CENP-F. Verifique los sitios de fosforilación con la secuencia de consenso de CDK1.

Iniciar la expresión de la proteína preparando un precultivo. Siguiendo las instrucciones del fabricante, transforme un microlitro del plásmido de expresión en 50 microlitros de células competentes para E. coli. Después de agregar el plásmido, incube las células en hielo durante 30 minutos.

A continuación, incubar las células durante 45 segundos a 42 grados centígrados. Después de la incubación, coloque las células en hielo durante un minuto, luego agregue 400 microlitros de LB a las células, luego incube el cultivo durante una hora a 37 grados centígrados mientras agita. A continuación, coloque 200 microlitros del cultivo en placas de agar LB, suplementadas con los antibióticos de interés, dependiendo de la construcción.

A continuación, incube las placas a 37 grados centígrados durante 12 a 20 horas sin agitar. A continuación, elija una colonia de la placa de agar LB e inocule la colonia en 50 mililitros de medio LB suplementado con la combinación de antibióticos deseada. Incubar el cultivo a 37 grados centígrados mientras se agita a 160 a 180 revoluciones por minuto durante 12 a 20 horas.

Por cada litro de medio LB añadir los antibióticos y 10 mililitros de 40% en peso por volumen de solución de glucosa filtrada estéril. A este medio se le añaden 20 mililitros de precultivo densamente cultivado. Luego incubar el cultivo a 37 grados centígrados mientras se agita a 160 a 180 revoluciones por minuto.

Compruebe la absorbancia del cultivo a 600 nanómetros a intervalos regulares. Una vez que la absorbancia alcanza de 0,5 a 0,6, induzca la expresión de proteínas mediante la adición de 0,2 milimolares de IPTG. Luego incubar el cultivo a 37 grados centígrados durante tres horas mientras se agita.

Después de tres horas, recoja las células por centrifugación a 4,100 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados, utilizando un rotor oscilante. Después de la centrifugación, expulse el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet celular en 20 mililitros de tampón de unión a GST para CENP-F y su tampón de unión de seis para carioferina alfa por cada litro de cultivo.

A continuación, almacene las células a menos 80 grados centígrados. Para purificar CENP-F, primero descongele las celdas con la construcción CENP-F. A continuación, ajuste el volumen a 20 mililitros con un tampón de enlace GST.

Una vez ajustado el volumen, añadir todos los reductores y los inhibidores de la proteasa uno tras otro para preparar la suspensión celular para su posterior lisis. A continuación, transfiera la suspensión de celdas a un vaso de precipitados de vidrio y sumerja el vaso de precipitados en un baño de agua helada. A continuación, sonicar la cultura.

Después de la sonicación, añada 250 micromolares PMSF al lisado, e inspeccione el lisado, que debería ser transparente en esta etapa. A continuación, centrifugar el lisado a 12.000 a 40.000 veces G durante 25 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, prepare la columna añadiendo dos mililitros de glutatión agarosa uno a uno a una columna de cromatografía desechable.

Para equilibrar la columna, lávela primero con 25 mililitros de agua ultrapura y luego con 25 mililitros de tampón aglutinante GST. Una vez finalizada la centrifugación, decantar el sobrenadante y luego filtrar el sobrenadante a través de un tamaño de vertido de 0,2 micrómetros. A continuación, vierta el lisado en la columna taponada para el paso de unión.

Tape la columna e incube a cuatro grados centígrados durante 30 minutos mientras nuta suavemente y evite la formación de espuma. Después de 30 minutos, transfiera la columna a una rejilla y deje que la resina se asiente. A continuación, recoja el flujo y lave la columna dos veces con 25 mililitros de tampón aglutinante GST.

Una vez finalizado el lavado, vuelva a taponar la columna. A continuación, añada a la columna 400 microlitros de tampón de unión a GST y 250 microlitros de caldo de proteasa PS con una actividad de 1000 unidades por miligramo. Vuelve a tapar la columna y gírala suavemente para volver a suspender la resina en el tampón, luego incuba la columna a cuatro grados centígrados durante 16 a 20 horas.

Una vez finalizado el período de incubación, agregue cuatro mililitros de tampón de unión a GST para eluir el fragmento de CENP-F de la columna que se ha escindido proteolíticamente. A continuación, para eluir la etiqueta GST de nuevo, conecte la columna. A continuación, añada cuatro mililitros de tampón de elución GST que contenga glutatión a la columna.

A continuación, incube la columna durante 10 minutos para eluir la etiqueta GST enlazada. Después de 10 minutos, recoja el eluido. A continuación, realice la electroforesis en gel de poliacrilamida SDS para analizar las fracciones de elución de la proteasa PS y el glutatión.

A continuación, para concentrar la muestra de proteína, pipetee el eluido de la proteasa PS en el compartimento superior de una unidad de filtro centrífugo con un corte de peso molecular de tres kilodalton. A continuación, centrifugar el eluido a 4, 100 veces G en incrementos de 10 a 15 minutos a cuatro grados Celsius en un rotor oscilante, para concentrar la muestra. Después de cada incremento, mezcle la muestra de proteína en el filtro de concentración pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo para evitar la formación de un gradiente de concentración.

Para purificar CENP-F mediante filtración en gel, conecte una columna de filtración en gel a un sistema de cromatografía líquida rápida de proteínas. A continuación, equilibre la columna con un volumen de columna de tampón de filtración de gel. A continuación, centrifugar el fragmento de CENP-F en un tubo de microcentrífuga a 21.700 veces G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados.

Una vez finalizada la centrifugación, inyecte la muestra en la columna, luego eluya la columna con tampón de filtración en gel y recoja fracciones de 0,6 mililitros del fragmento CENP-F. A continuación, analice el perfil de filtración del gel y ejecute una SDS-PAGE de las fracciones máximas. Fracciones de piscina que contienen CENP-F puro.

A continuación, concentre el fragmento de CENP-F purificado a 3,3 miligramos por mililitro. Para determinar la concentración de proteína, diluya el fragmento de CENP-F en una proporción de uno a 100 con agua ultrapura. A continuación, registre el espectro de 220 a 300 nanómetros de longitud de onda en el espectrofotómetro.

A continuación, prepare alícuotas de 50 microlitros de CENP-F purificado en microtubos de 0,5 mililitros, luego congele rápidamente los tubos en nitrógeno líquido y almacene a menos 80 grados Celsius. Para el ensayo de quinasa, mezcle el fragmento de CENP-F con ATP y CDK1 ciclina B junto con otros tampones en un microtubo de 0,5 mililitros. A continuación, prepare una segunda muestra sin ciclina B CDK1 como control negativo.

A continuación, incubar las muestras en un baño de agua a 30 grados centígrados durante una a 16 horas. Para la identificación exitosa de los sitios de fosforilación por espectrometría de masas, es fundamental que la eficiencia de fosforilación sea lo más alta posible, preferiblemente 100%Para aumentar la eficiencia de fosforilación agregue más quinasa y aumente el tiempo de incubación a 16 horas. Luego agregue volúmenes iguales de solución de clorhidrato de guanidina de seis molares a la reacción de ensayo de quinasa restante y el control negativo y realice espectrometría de masas para identificar el sitio de fosforilación.

Para obtener datos de espectrometría de masas de alta calidad, también es importante que la muestra de proteína purificada sea altamente pura y homogénea. Se realiza el primer análisis SDS-PAGE que muestra un claro desplazamiento hacia arriba de la banda en el gel para el CENP-F fosforilado en comparación con el control negativo sin CDK1, lo que indica que el cNLS de CENP-F es un sustrato CDK1. A continuación, se realiza espectrometría de masas para analizar el número y la eficiencia de los sitios de fosforilación de CENP-F.

El espectro de masas de la trampa de iones ESI del CENP-F fosforilado in vitro intacto muestra que hay cinco picos, lo que indica cuatro sitios de fosforilación y el quinto pico es la proteína no fosforilada. A continuación, este perfil de elución por exclusión de tamaño muestra que el volumen de elución del pico alfa de carioferina cambia a una masa más alta al agregar el tipo salvaje CENP-F, lo que no se observa al agregar el mutante CENP-F. Esto indica que la versión fosfomimética S3048D de CENP-F debilita la interacción del cNLS de CENP-F con la carioferona alfa.

Finalmente, el análisis SDS-PAGE realizado muestra que el fragmento CENP-F de tipo salvaje con cNLS intacto coeluye con cariopherina alfa, lo que indica una fuerte interacción. Sin embargo, el mutante S3048D de CENP-F y la carioferina alfa eluyen en picos separados. Al intentar este procedimiento, es importante recordar verificar los sitios de fosforilación obtenidos con la secuencia de fosforilación de consenso de CDK1 y verificar que el sustrato identificado se localiza en el mismo compartimento celular que CDK1.

Después de este procedimiento, se debe realizar una verificación funcional en las células o modelos animales para confirmar que los sitios de fosforilación identificados tienen una función fisiológica. Hay una serie de herramientas disponibles para la verificación funcional, como inhibidores específicos de CDK1 y mutaciones fosfomiméticas. Debido al gran número de sustratos de CDK1 en el proteo, aún quedan muchos sustratos de CDK1 humanos por descubrir y el ensayo de quinasa in vitro será una herramienta importante para identificar, mapear y verificar estos sitios.

La identificación de estos sitios de fosforilación permite estudios mecanicistas de cómo CDK1 controla el ciclo celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar los sitios de fosforilación específicos de CDK1 y las proteínas diana mediante un ensayo de quinasa in vitro.