Name: Las reconstrucciones de gran escala e imparcial La agrupación independiente, basada en métricas morfológicas para clasificar las neuronas en poblaciones selectivos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Aprende a reconstruir la morfología de neuronas marcadas con virus rabia modificado en primates. Este método permite análisis de agrupación imparcial para clasificar subclases neuronales distintivas con precisión.

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Nos gustaría agradecer a los Dres. Ed Callaway y Marty Usrey para permitirnos usar el tejido preparado como parte de un estudio previo y Libby Fairless y Shiyuan Liu para obtener ayuda con reconstrucciones neuronales. Este trabajo fue financiado por el NIH (NEI: EY018683) y la Fundación de Whitehall.

<ol><li>Cajal, S. R. y <a target="_blank" href="https://archive.org/details/b2129592x_0001">Histologie du systeme nerveaux de l'homme et des vertebres</a>. , Maloine. (1911).</li>
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<li>Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transneuronal+circuit+tracing+with+neurotropic+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Transneuronal circuit tracing with neurotropic viruses.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18, 1-7 (2009).</li>
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<li>Briggs, F., Kiley, C. W., Callaway, E. M., Usrey, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+substrates+for+parallel+streams+of+corticogeniculate+feedback+originating+in+both+V1+and+V2+of+the+macaque+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Morphological substrates for parallel streams of corticogeniculate feedback originating in both V1 and V2 of the macaque monkey.</a> Neuron. 90, 388-399 (2016).</li>
<li>Cauli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+fusiform+neocortical+interneurons+based+on+unsupervised+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering.</a> PNAS. 97, 6144-6149 (2000).</li>
<li>Bragg, E. M., Fairless, E. A., Liu, S., Briggs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+visual+sector+thalamic+reticular+neurons+in+the+macaque+monkey+sugests+retinotopically-specialized%2C+parallel+stream-mixed+input+to+the+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Morphology of visual sector thalamic reticular neurons in the macaque monkey sugests retinotopically-specialized, parallel stream-mixed input to the lateral geniculate nucleus.</a> J. Comparative Neurology. 525 (5), 1273-1290 (2017).</li>
<li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/neuron/abstract/S0896-6273(11)00600-3">New rabies virus varients for monitoring and manipulating activity and gene expression in defined neural circuits.</a> Neuron. 71, 617-631 (2011).</li>
<li>Callaway, E. M., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+circuit+tracing+with+glycoprotein-deleted+rabies+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic circuit tracing with glycoprotein-deleted rabies viruses.</a> Journal of Neuroscience. 35, 8979-8985 (2015).</li>
<li>Nhan, H. L., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+superior+colliculus-+and+middle+temporal+area-projecting+neurons+in+primate+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Morphology of superior colliculus- and middle temporal area-projecting neurons in primate primary visual cortex.</a> J. Comparative Neurology. 520, 52-80 (2012).</li>
<li>Pinault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thalamic+reticular+nucleus%3A+structure%2C+function+and+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">The thalamic reticular nucleus: structure, function and concept.</a> Brain Research Reviews. 46, 1-31 (2004).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. 65, e3564(2012).</li>
<li>Wong-Riley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+visual+system+of+monocularly+sutured+or+enucleated+cats+demonstrable+with+cytochrome+oxidase+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry.</a> Brain Research. 171, 11-28 (1979).</li>
<li>Gerfen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+neuroanatomical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Basic neuroanatomical methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. Chapter 1, Unit 1.1(2003).</li>
<li>Thorndike, R. L. <a target="_blank" href="http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/summary?doi=10.1.1.177.7605">Who belongs in the family?</a> Psychometrika. 18, 267-276 (1953).</li>
<li>Talebi, V., Baker, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Categorically+distinct+types+of+receptive+fields+in+early+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Categorically distinct types of receptive fields in early visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 115, 2556-2576 (2016).</li>
<li>Helmstaedter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connectomic+reconstruction+of+the+inner+plexiform+layer+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina.</a> Nature. 500, 168-174 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los estudios neuroanatómicos han seguido siendo un pilar de la neurociencia y la reciente interés en conectómica y relaciones estructura-función ha renovado entusiasmo por la caracterización morfológica detallada de las poblaciones neuronales selectivas. Tradicionalmente, los estudios neuroanatómicos han basado en las clasificaciones cualitativas de las neuronas en clases morfológicamente distintos de neuronas definidas por neuroanatomistas expertos. Con los avances en las técnicas para la reconstrucción de las neuronas...

Neuroanatomía es uno de los fundamentos de la neurociencia 1 y el interés reciente en &quot;conectómica&quot; ha renovado el entusiasmo para la comprensión de la diversidad morfológica de poblaciones neuronales y las conexiones entre las neuronas específicas 2. Los métodos para el etiquetado y la reconstrucción de las neuronas han mejorado en gran medida con las innovaciones recientes, incluyendo el trazado de circuito y genética mediada por virus enfoques 3, 4, lo que permite estudios morfológicos más amplios de poblaciones neuronales 5. Además de las mejoras en el etiquetado de las neuronas individuales, técnicas de análisis de datos cuantitativos también han surgido que permiten la clasificación independiente e imparcial de las neuronas en distintas subpoblaciones en base a los datos morfológicos 5, 6. Estas técnicas son imparciales una mejora sobre más TRADICIONAl métodos cualitativos de clasificación que han sido la norma en el campo durante más de un siglo. El objetivo de este estudio es describir, paso a paso, la combinación de etiquetado mediada por virus de las neuronas dentro de una población selectiva, reconstrucciones a gran escala de una muestra amplia de estas neuronas, y el análisis de datos cuantitativos basados ​​en la agrupación independiente evaluación estadística. Mediante la combinación de estos métodos, se describe un nuevo enfoque hacia la recopilación y el análisis de los datos neuroanatómicos para facilitar la toma de muestras completa y una clasificación no sesgada de tipos neuronales morfológicamente únicos dentro de una población neuronal selectiva. Como ejemplo de estos métodos, se describe el análisis de una gran población de neuronas dentro de un solo sector del núcleo reticular talámico (TRN) del mono macaco. Estos datos son de un estudio previo 7. Métodos para marcar selectivamente las neuronas TRN que se proyectan hacia el latera dorsall geniculado núcleo del tálamo (dLGN) mediante inyección quirúrgica del virus de la rabia modificado que codifica la EGFP 4, 8 (véase la Tabla de materiales específicos / Equipos, fila 2) se describen. Este virus de la rabia modificada carece del gen que codifica una proteína de la cubierta esencial, la eliminación de movimiento trans-sináptica del virus. Una vez que el virus entra en terminales de los axones en el sitio de inyección, que actúa como un trazador retrógrado tradicional con la ventaja importante de dirigir la expresión de EGFP en toda la arborización dendrítica completa de las neuronas infectadas 5, 9, 10. Por consiguiente, este virus de la rabia eliminado G-puede ser utilizado para infectar y etiquetar cualquier población neuronal después de la inyección y transporte retrógrado selectivamente. Con el fin de realizar un análisis exhaustivo de una población neuronal específica, es importante tomar muestras deuna amplia distribución de las neuronas dentro de la población. Debido a que la técnica de etiquetado mediada por virus produce intracelular completa, &quot;Golgi-like&quot; llena de muchas neuronas con axones en el sitio de la inyección del virus, es posible reconstruir una muestra muy grande de las neuronas dentro de la extensión completa de una estructura cerebral. Además, debido a que el virus de la rabia modificado es tan eficaz en infectar y etiquetado de un gran número de neuronas, es posible reconstruir cientos de neuronas por animal. Los procedimientos para el muestreo de 160 neuronas en todo el sector visual de la TRN 11 con el fin de generar una muestra completa de dLGN proyectan neuronas TRN se describen. Se describe el proceso de reconstrucción de las neuronas individuales utilizando un sistema de reconstrucción de las neuronas incluyendo un microscopio, cámara y software de reconstrucción. También se describen métodos para determinar las posiciones de las neuronas individuales dentro de una estructura del cerebro (en este caso dentro de la TRN) y para verificar el virus de la inyección sitel volumen de correo y la ubicación dentro de una estructura (en este caso dentro de la dLGN) usando reconstrucciones volumétricas de contorno. Pasos para exportar los datos morfológicos y realizar agrupación independiente de análisis basados ​​en métricas se describen morfológicos medidos para cada neurona. Existen limitaciones en los métodos de agrupamiento y también hay una variedad de diferentes algoritmos de agrupación disponibles. En consecuencia, se describen estas opciones y las ventajas de algunos de los algoritmos más comúnmente utilizados. El análisis de conglomerados no proporciona una verificación estadística de la singularidad de las agrupaciones. Por lo tanto, los pasos adicionales se describen para verificar la agrupación óptima, así como las relaciones entre los datos morfológicos dentro ya través de las agrupaciones. Métodos estadísticos para evaluar las agrupaciones para el conjunto de datos TRN para confirmar que las neuronas TRN se agrupan en tres grupos únicas basadas en 10 mediciones morfológicas independientes están descritas. Por lo tanto, delineando los pasos para el etiquetado de forma selectiva, La reconstrucción, y el análisis de datos morfológicos de una población neuronal específica, se describen los métodos para la cuantificación de las diferencias morfológicas entre las neuronas dentro de una población. hallazgos previos de tipos neuronales distintas dentro del sector de la visual de la TRN mono macaco se confirman con métodos distintos de evaluación estadística. Juntos, esperamos que estas técnicas serán ampliamente aplicable a conjuntos de datos neuroanatómicos y ayudar a establecer la clasificación cuantitativa de la diversidad de las poblaciones neuronales a través del cerebro.

<table><tbody><tr><td>SAD&Delta; G-EGFP</td><td>E.M. Callaway Laboratory, Instituto</td><td></td> Salk <td>preparado por el Dr. F. Osakada. Virus de la rabia eliminado por G disponible a través del Instituto Salk Núcleo viral</td></tr><tr><td>Electrodo de registro: platino/iridio o tungsteno</td><td>FHC</td><td>UEPSGGSE1N2M</td><td>Visite el sitio web (www.fh-co.com) para conocer las especificaciones de pedidos alternativos</td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummod Scientific</td><td>3-000-204, 110V</td><td>Alternativas: picospritzer, jeringa Hamilton</td></tr><tr><td>Microtomo de congelación</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5905-50TAB</td><td>3,3'-Diaminobenzigidina tetraclorhidrato, comprimido, 10 mg de sustrato por comprimido. Precaución: cancerígeno: debe blanquearse antes de desechar</td></tr><tr><td>Citocromo C</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2037-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Catalasa</td><td>Sigma-Aldich</td><td>C9322-5G</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFP</td><td>Life Technologies/Thermo Fisher</td><td>#A-11122&nbsp;</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>Vector anti-conejo de cabra biotinilado</td><td>Laboratories</td><td>#BA-1000</td><td>Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>Neurolucida System&nbsp;</td>Software <td>MicroBrightField</td><td></td><td>para el rastreo y análisis de neuronas. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida</td></tr><tr><td>Neurolucida Explorer</td><td>MicroBrightField</td><td></td><td>Software de exportación de datos</td></tr><tr><td>Microfire Camera&nbsp;</td><td>Cámara microscópica Optronics</td><td>de 2 megapíxeles</td><td></td> en color verdadero.</tr><tr><td>http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf Microscopio Nikon E800</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td>Microscopio de investigación biológica. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The MathWorks Inc.&nbsp;</td><td></td><td>Software de matemáticas computacionales basado en matrices. http://www.mathworks.com</td></tr><tr>Programa de <td>hojas de cálculo</td> de <td>Microsoft</td><td></td><td>Office Excel</td></tr></tbody></table>

las reconstrucciones de gran escala e imparcial la agrupación independiente, basada en métricas morfológicas para clasificar las neuronas en poblaciones selectivos

Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations

Este protocolo describe reconstrucciones a gran escala de las neuronas en combinación con el uso de la agrupación independiente e imparcial análisis para crear un estudio exhaustivo de las características morfológicas observadas entre una población neuronal selectiva. La combinación de estas técnicas constituye un enfoque novedoso para la recogida y análisis de datos neuroanatómicos. En conjunto, estas técnicas permiten a gran escala, y por lo tanto más amplio, el muestreo de poblaciones neuronales selectivos y establecer métodos cuantitativos para describir imparciales clases neuronales morfológicamente únicos dentro de una población. El protocolo se describe el uso de virus de la rabia modificado para etiquetar selectivamente las neuronas. G-elimina actos virus de la rabia como un trazador retrógrado tras la inyección estereotáxica en una estructura cerebral diana de interés y sirve como un vehículo para el suministro y la expresión de EGFP en las neuronas. Un gran número de neuronas están infectadas usando estetécnica y expresar GFP a través de sus dendritas, la producción de rellenos &quot;Golgi&quot; completos de las neuronas individuales. Por consiguiente, el método de rastreo retrógrado mediada por virus mejora sobre las técnicas tradicionales de rastreo retrógrado con base de tinte mediante la producción de rellenos intracelulares completas. Individuales neuronas bien aisladas que abarcan todas las regiones de la zona del cerebro en estudio se seleccionan para la reconstrucción con el fin de obtener una muestra representativa de las neuronas. El protocolo describe los procedimientos para reconstruir los cuerpos celulares y completar los patrones de arborización dendrítica de neuronas marcadas que abarcan múltiples cortes de tejido. Los datos morfológicos, incluyendo posiciones de cada neurona dentro de la estructura del cerebro, se extraen para su posterior análisis. funciones de programación estándares se utilizaron para llevar a cabo agrupación independiente de análisis y evaluaciones de racimo basados ​​en métricas morfológicas. Para comprobar la utilidad de estos análisis, la evaluación estadística de un análisis de conglomerados performado en 160 neuronas reconstruidas en el núcleo reticular del tálamo del tálamo (TRN) del macaco fue hecho. Tanto el análisis de conglomerados original y las evaluaciones estadísticas realizadas aquí indican que las neuronas TRN se dividen en tres subpoblaciones, cada una con características morfológicas únicas.

Hemos demostrado previamente que las reconstrucciones de gran escala de las neuronas dentro de una población selectiva es factible la inyección siguiente de virus de la rabia modificado en el dLGN 5. Recientemente, se utilizó el mismo tejido para reconstruir 160 neuronas en el sector visual de la TRN (Bragg et al, en opinión;. Figura 2A-B) siguiendo los pasos metodológicos detallados descritos anteriormente. En el estudio TRN, tres grupos par...

Este protocolo describe reconstrucciones a gran escala de poblaciones neuronales selectivas, etiquetadas después de la infección retrógrada con un virus de la rabia modificado expresan marcadores fluorescentes, y analiza, racimo imparcial independiente que permiten la caracterización completa de las métricas morfológicas entre subclases neuronales distintas.

Las reconstrucciones de gran escala e imparcial La agrupación independiente, basada en métricas morfológicas para clasificar las neuronas en poblaciones selectivos

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a ...

Los objetivos de este protocolo son describir los pasos para reconstruir la morfología de neuronas marcadas con virus y realizar análisis de agrupamiento independientes y sin sesgo sobre poblaciones de neuronas marcadas, con el fin de permitir una caracterización exhaustiva de las métricas morfológicas a lo largo de subclases neuronales distintas. Describimos un enfoque novedoso para recolectar y analizar datos neuroanatómicos que facilita un muestreo más completo y una clasificación imparcial de tipos neuronales morfológicamente únicos dentro de una población neuronal selectiva. La principal ventaja de esta técnica es que permite un análisis a gran escala de la morfología neuronal y utiliza métodos sin sesgo para clasificar subclases neuronales distintas.Los aspectos más difíciles de las reconstrucciones morfológicas son seleccionar neuronas bien aisladas para reconstruir, asignar la profundidad z adecuada y alinear las arborizaciones para continuar las reconstrucciones a través de secciones de tejido adyacentes. Comience una reconstrucción seleccionando una lámina que contenga una sección de tejido cerebral de 50 micrones teñida, procedente de un primate inyectado estereotácticamente con un virus de la rabia modificado que expresa EGFP. Coloque la lámina en el portaobjetos del microscopio y enfoque una sola sección de interés utilizando un objetivo de baja magnificación.Asegúrese de que la imagen de la cámara sea visible en la imagen en vivo mediante el posicionamiento adecuado del obturador de la cámara. Elija una neurona marcada razonablemente aislada dentro de la estructura cerebral de interés para permitir una reconstrucción inequívoca de la arborización dendrítica. Cambie a un aumento de 10x y enfoque la zona.Seleccione preferentemente neuronas si el cuerpo celular está completamente dentro de una sola sección para estimar con precisión su área y redondez. Una vez elegida una neurona bien teñida y bien aislada, haga clic en el botón de nueva sección en el software para agregar la sección principal que contiene el cuerpo celular al administrador de secciones. Ingrese el número de secciones que se incluirán en la reconstrucción.Se recomienda insertar dos o tres secciones para comenzar. Asigne un grosor de sección de 50 micrones. Seleccione el objetivo de 2x y luego haga clic en el botón de contorno en la barra de herramientas superior y elija el tipo de contorno desde el menú desplegable.Siga el contorno de la estructura diana utilizando el mouse para hacer clic en puntos a lo largo del contorno. Cuando termine de trazar el contorno, haga clic con el botón derecho del mouse y seleccione cerrar contorno en el menú para cerrar el contorno. A continuación, con la vista aún en dos x, haga clic en el símbolo de marcador deseado en la barra de herramientas izquierda.Luego, haga clic en el centro de la estructura diana para colocar el marcador. Una vez que los contornos estén completos, seleccione el objetivo de 40x o 60x para trazar el contorno del cuerpo celular. A continuación, seleccione el botón de trazado de neuronas en la barra de herramientas superior y elija la estructura neuronal a trazar, en este caso el cuerpo celular, en el menú desplegable.Trace el cuerpo celular haciendo clic en puntos alrededor de la extensión más grande del cuerpo celular, ajustando la profundidad en z según sea necesario para enfocar el cuerpo celular. Haga clic con el botón derecho del ratón para finalizar el contorno del cuerpo celular. A continuación, coloque un marcador de estilo diferente en el centro del contorno del cuerpo celular, asegurándose de que el marcador esté aproximadamente en el centro en profundidad en z.Es fundamental establecer la profundidad z correcta en la sección inicial, así como en las secciones adyacentes, antes de comenzar cada trazado, para que los valores del eje z sean precisos. Para comenzar el trazado de las arborizaciones dendríticas, seleccione «dendrita» en el menú desplegable superior.Luego, siga cada dendrita comenzando desde el cuerpo celular. Cuando una dendrita se ramifica, haga clic con el botón derecho del ratón y seleccione nodo bifurcado o nodo trifurcado para colocar un nodo en este punto de ramificación. Asegúrese de ajustar la profundidad en z durante todo el trazado para capturar con precisión el ángulo y la dirección de la dendrita.Al final del dendrito en esta sección, haga clic con el botón derecho del ratón y seleccione finalización en el menú desplegable. Cuando se hayan trazado todas las arborizaciones dendríticas en la sección principal, identifique aquellas terminaciones dendríticas que probablemente continúen en la sección adyacente. Lleve estas al enfoque adecuado en la profundidad z apropiada en la imagen del microscopio a 20x.Incluya puntos de referencia principales cercanos, como vasos sanguíneos o patrones o haces de dendritas fácilmente reconocibles en la imagen del microscopio. A continuación, tome una fotografía de la imagen en vivo utilizando una cámara digital sostenida manualmente frente a la pantalla del ordenador. Luego cambie el objetivo del microscopio a dos aumentos y muévase a la sección adyacente del portaobjetos.Luego, alinee los contornos de la sección previamente trazada en la vista del software con los límites del NGL y el TRN en la nueva sección. Regrese a 20x y realice el alineamiento utilizando los puntos de referencia. A continuación, con ayuda de la foto de los terminales dendríticos de la sección previamente trazada, mueva el trazado para alinear las dendritas, seleccionando primero la reconstrucción con la herramienta de flecha.Luego, haga clic con el botón derecho y seleccione mover en el menú desplegable, y mueva el trazado en consecuencia. Para rotar el trazado, haga clic con el botón derecho y seleccione rotar en el menú desplegable, y rote el trazado según sea necesario. Alternativamente, seleccione la herramienta de coincidencia en el menú desplegable de herramientas superior y seleccione el número de puntos a coincidir.Luego, haga clic en el extremo de la reconstrucción y en el punto de continuación correspondiente en la imagen en vivo para emparejar los extremos dendríticos con sus inicios. Una vez que el trazado de la sección anterior esté alineado con las dendritas en la nueva sección, agregue una nueva sección al administrador de secciones como antes. Alternativamente, simplemente seleccione la sección adyacente creada previamente y ajuste la profundidad en z de la misma manera.Asegúrese de que la nueva sección correspondiente esté seleccionada en el administrador de secciones haciendo clic en la sección actual. Luego, después de aumentar la magnificación a 40x o 60x, seleccione la dendrita usando la flecha. Haga clic con el botón derecho del ratón en el extremo de la dendrita de la sección anterior y seleccione agregar al final en el menú desplegable.Un mensaje preguntará si la continuación está en una nueva sección. Haga clic en sí. Luego, siga la continuación de la dendrita utilizando el ratón como herramienta de dibujo.Tome imágenes de los extremos en preparación para alinearlos con la siguiente sección. Luego, agregue continuaciones a los trazados dendríticos hasta que se hayan trazado al menos tres secciones para la neurona o hasta que ya no se puedan seguir o encontrar las dendritas. Utilizando un programa de extracción asociado con el sistema de reconstrucción neuronal, abra un archivo de reconstrucción completado.En el menú desplegable de edición, seleccione seleccionar todos los objetos. Seleccione análisis de estructura de ramas en la barra de herramientas de análisis superior y luego haga clic en cada pestaña y seleccione las opciones de análisis deseadas en cada una. Extraiga todos los datos deseados haciendo clic en el botón Aceptar en la ventana de análisis y guárdelos en un formato de hoja de cálculo haciendo clic derecho en las ventanas de salida y seleccionando exportar a Excel para análisis posteriores.Esta fotografía muestra una única sección coronal a través del LGN dorsal de un animal. La tinción de citocromo oxidasa se utiliza para visualizar las capas del LGN. Y la tinción de GFP marca el sitio de inyección del virus.La flecha indica regiones de neuronas densas del núcleo reticular talámico marcadas de forma retrógrada. La orientación de la sección se corresponde con la brújula dorsal-ventral-medial-lateral ilustrada. La barra de escala se muestra en la esquina inferior izquierda.Esta imagen muestra los contornos del NGL en rojo y del NRT en marrón para todas las secciones que contienen la inyección del virus, indicadas por los contornos negros. Las estrellas amarillas indican los centros de los sitios de inyección. Esta imagen muestra la representación tridimensional de los contornos y del sitio de inyección.Este es un mapa de las ubicaciones de las neuronas del NTR reconstruidas, codificadas por colores según la asignación de clústeres dentro de un contorno agregado del NTR mostrado en marrón. La barra de escala representa 500 micrómetros. Esta imagen muestra los contornos agregados del NTR en negro y del GLN en gris, con cinco neuronas del NTR reconstruidas coloreadas desde tonos cálidos hasta fríos según su posición medial lateral dentro del NTR.La barra de escala representa 500 micrones. Estas fotografías muestran el detalle de los mismos cinco neuronas de la NTR con barras de escala en colores coincidentes que representan 100 micrones. Este árbol dendrograma jerárquico ilustra las distancias de vinculación entre 160 neuronas de la NTR reconstruidas según 10 métricas morfológicas independientes y muestra los resultados generales del análisis de agrupamiento.Tres grupos distintos de neuronas TRN se ilustran en azul, verde y rojo. Una vez dominadas estas técnicas de reconstrucción neuronal, se puede reconstruir completamente una sola neurona en una o dos horas. Es importante monitorear y ajustar constantemente la profundidad en z durante la reconstrucción de las neuronas.El protocolo descrito aquí representa una mejora respecto a los métodos tradicionales de análisis neuroanatómico, más sesgados, y permite a los investigadores explorar nuevas subclases de neuronas basándose en datos morfológicos a gran escala. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo reconstruir neuronas mediante secciones de tejido adyacentes y extraer datos morfológicos para análisis posteriores.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Hemos desarrollado un programa de computadora para analizar la morfología neuronal. En combinación con dos herramientas existentes de código abierto de análisis, nuestro programa realiza análisis de Sholl y determina el número de neuritas, los puntos de ramificación, y consejos de las neuritas. Los análisis se realizan para que los cambios locales en la morfología de las neuritas se puede observar.

Automatizado de Análisis de la morfología neuronal Sholl digitalizados en múltiples escalas

Aquí, se muestra cómo analizar enrutamiento dendríticas de las neuronas medulares de Drosophila en columnas y capas. El flujo de trabajo incluye una visualización dual técnica de imagen para mejorar la calidad de imagen y herramientas computacionales para el seguimiento, el registro de los cenadores dendríticas en la matriz de la columna de referencia y para el análisis de las estructuras dendríticas en el espacio 3D.

Analizando dendríticas morfología en las columnas y capas

Aquí describimos un procedimiento para tejido claro etiquetado fluorescente y a gran escala imagen de tejido de cerebro de ratón que, por lo tanto, permite la visualización de la organización tridimensional de tipos celulares en el neocortex.

Proyección de imagen tridimensional a gran escala de la organización celular en el Neocortex de ratón

Aquí, nos proporcionan un flujo de trabajo que permite la identificación de células sanas y patológicas basado en su forma de 3 dimensiones. Describimos el proceso de utilizar esquemas de proyección 2D basados en las superficies 3D para entrenar un mapa de auto-organización que ofrecerá la agrupación objetiva de las poblaciones celulares investigados.

Distinción basada en la morfología entre sanas y patológicas de las células utilizando transformadas de Fourier y mapas de auto-organización

El protocolo que aquí describe el análisis de la inmunofluorescencia, recuperación de biocitina y reconstrucciones de alta calidad de interneuronas de CA2 hipocampales siguiendo los registros electrofisiológicos intracelulares in vitro, permitiendo neuronal caracterización y finalmente fina anatomía neuronal para ser estudiado.

Recuperación de biocitina y reconstrucciones 3D de interneuronas lleno Hippocampal CA2

La tubería descrita está diseñada para la segmentación de conjuntos de datos de microscopía electrónica mayores que gigabytes, para extraer morfologías de células enteras. Una vez que las células se reconstruyen en 3D, el software personalizado diseñado en torno a las necesidades individuales se puede utilizar para realizar un análisis cualitativo y cuantitativo directamente en 3D, también utilizando la realidad virtual para superar la oclusión de la vista.

Un método para la reconstrucción 3D y el análisis de realidad virtual de células gliales y neuronales

Presented es una herramienta computacional que permite la medición automática simple y directa de las orientaciones de las ramas dendríticas neuronales a partir de imágenes de fluorescencia 2D.

Identificación automática de ramas dendríticas y su orientación

El protocolo proporciona un método detallado de imágenes neuronales en cortes cerebrales utilizando un método de limpieza de tejidos, ScaleSF. El protocolo incluye la preparación del tejido cerebral, la clarificación del tejido, el manejo de rodajas despejadas y la microscopía de escaneo láser confocal de las estructuras neuronales desde los niveles mesoscópicos hasta los microscópicos.

Un método de limpieza de tejidos para imágenes neuronales de escalas mesoscópicas a microscópicas

Este protocolo describe métodos para realizar imágenes de resonancia magnética, limpieza e inmunoetiquetado de cerebros de ratones intactos utilizando iDISCO+, seguido de una descripción detallada de imágenes utilizando microscopía de hoja de luz y análisis posteriores utilizando NuMorph.

Imágenes unicelulares de todo el cerebro y análisis de cerebros de ratones neonatales intactos mediante resonancia magnética, limpieza de tejidos y microscopía de hoja de luz

Los ensayos de excrecencia de neuritas proporcionan un valor cuantitativo sobre los procesos neuronales regenerativos. La ventaja de este software semiautomático es que segmenta los cuerpos celulares y las neuritas por separado mediante la creación de una máscara y mide varios parámetros, como la longitud de las neuritas, el número de puntos de ramificación, el área del grupo de cuerpos celulares y el número de grupos celulares.

Estandarización de un novedoso software semiautomático para la medición del crecimiento de neuritas 

Aprende a reconstruir la morfología de neuronas marcadas con virus rabia modificado en primates. Este método permite análisis de agrupación imparcial para clasificar subclases neuronales distintivas con precisión.

Las reconstrucciones de gran escala e imparcial La agrupación independiente, basada en métricas morfológicas para clasificar las neuronas en poblaciones selectivos (Video) | JoVE Journal

Las reconstrucciones de gran escala e imparcial La agrupación independiente, basada en métricas morfológicas para clasificar las neuronas en poblaciones selectivos

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