Las reconstrucciones de gran escala e imparcial La agrupación independiente, basada en métricas morfológicas para clasificar las neuronas en poblaciones selectivos

Este protocolo describe reconstrucciones a gran escala de poblaciones neuronales selectivas, etiquetadas después de la infección retrógrada con un virus de la rabia modificado expresan marcadores fluorescentes, y analiza, racimo imparcial independiente que permiten la caracterización completa de las métricas morfológicas entre subclases neuronales distintas.

Los objetivos de este protocolo son describir los pasos para reconstruir la morfología de las neuronas marcadas con virus y realizar análisis de conglomerados independientes e imparciales en poblaciones de neuronas marcadas para permitir una caracterización completa de las métricas morfológicas a lo largo de distintas subclases neuronales. Describimos un enfoque novedoso para recopilar y analizar datos neuroanatómicos para facilitar un muestreo más completo y una clasificación imparcial de tipos neuronales morfológicamente únicos dentro de una población neuronal selectiva. La principal ventaja de esta técnica es que permite el análisis a gran escala de la morfología neuronal y utiliza métodos imparciales para clasificar distintas subclases neuronales.

Los aspectos más desafiantes de las reconstrucciones morfológicas son la selección de neuronas bien aisladas para reconstruir, la asignación de la profundidad z adecuada y la alineación de los ejes para continuar las reconstrucciones a través de secciones de tejido adyacentes. Comience una reconstrucción seleccionando un portaobjetos que lleve una sección de tejido cerebral teñida de 50 micras de un primate inyectado estereotáxicamente con el virus de la rabia modificado que expresa EGFP. Coloque el portaobjetos en el soporte del microscopio y concéntrese en una sola sección de interés utilizando un objetivo de bajo aumento.

Asegúrese de que la imagen de la cámara sea visible en la imagen en vivo colocando correctamente el obturador de la cámara. Elija una neurona marcada razonablemente aislada dentro de la estructura cerebral de interés para permitir la reconstrucción inequívoca de la arborización dendrítica. Cambie a un aumento de 10x y enfoque el área.

Elija preferentemente las neuronas si el cuerpo de la célula está completamente dentro de una sola sección para estimar con precisión su área y redondez. Una vez que se elige una neurona bien teñida y aislada, haga clic en el botón de nueva sección en el software para agregar la sección de inicio que contiene el cuerpo de la célula al administrador de sección. Introduzca el número de secciones que se incluirán en la reconstrucción.

Recomiende insertar dos o tres secciones para comenzar. Asigne un espesor de sección de 50 micras. Elija el objetivo dos x, luego haga clic en el botón de contorno en la barra de herramientas superior y elija el tipo de contorno en el menú desplegable.

Traza el contorno de la estructura de destino utilizando el ratón para hacer clic en los puntos a lo largo del contorno. Cuando termine de trazar el contorno, haga clic con el botón derecho del ratón y seleccione cerrar contorno en el menú para cerrar el contorno. A continuación, con la vista aún en dos x, haga clic en el símbolo de marcador deseado en la barra de herramientas de la izquierda.

A continuación, haga clic en el centro de la estructura de destino para colocar el marcador. Una vez que los contornos estén completos, seleccione el objetivo 40x o 60x para trazar el contorno del cuerpo de la célula. A continuación, seleccione el botón de trazado de neuronas en la barra de herramientas superior y seleccione la estructura de la neurona a trazar, en este caso, el cuerpo de la célula, en el menú desplegable.

Traza el cuerpo de la célula haciendo clic en los puntos alrededor de la mayor extensión del cuerpo de la célula, ajustando la profundidad z según sea necesario para enfocar el cuerpo de la célula. Y hacer clic con el botón derecho del ratón para finalizar el contorno del cuerpo de la célula. A continuación, coloque un marcador de estilo diferente en el centro del contorno del cuerpo de la célula, asegurándose de que el marcador esté aproximadamente en el centro en profundidad z.

Es fundamental establecer la profundidad z correcta en la sección de inicio, así como en las secciones adyacentes, antes de comenzar cada trazado para que los valores del eje z sean precisos. Para comenzar a trazar árboles dendríticos, seleccione dendrita en el menú desplegable superior.

A continuación, traza cada dendrita empezando por el cuerpo de la célula. Cuando una dendrita se ramifica, haga clic con el botón derecho del ratón y seleccione nodo bifurcador o nodo trifurcador para colocar un nodo en este punto de bifurcación. Asegúrese de ajustar la profundidad z a lo largo del trazado para capturar con precisión el ángulo y la dirección de la dendrita.

Al final de la dendrita en esta sección, haga clic con el botón derecho del ratón y seleccione el final en el menú desplegable. Cuando se trazan todos los ejes dendríticos en la sección de inicio, identifique las terminaciones dendríticas que probablemente continuarán en la sección adyacente. Y enfóquelos a la profundidad z adecuada en la imagen del microscopio a 20x.

Incluya los principales puntos de referencia cercanos, como vasos sanguíneos o patrones o haces de dendritas fácilmente reconocibles en la imagen del microscopio. A continuación, tome una foto de la imagen en vivo con una cámara digital de mano en la pantalla de la computadora. A continuación, cambie el objetivo del microscopio a dos x y desplácese a la sección adyacente del portaobjetos.

A continuación, alinee los contornos de la sección trazada anteriormente en la vista de software con los límites de LGN y TRN en la nueva sección. Regrese a 20x y alinee usando puntos de referencia. Luego, con la ayuda de la foto de las terminaciones de las dendritas de la sección trazada anteriormente, mueva el trazado para alinear las dendritas usando primero la herramienta de flecha para seleccionar la reconstrucción.

A continuación, haga clic con el botón derecho del ratón y seleccione mover en el menú desplegable y mueva el trazado en consecuencia. Para rotar el trazado, haga clic con el botón derecho y seleccione rotar en el menú desplegable y gire el trazado en consecuencia. Alternativamente, seleccione la herramienta de coincidencia en el menú desplegable de herramientas superiores y seleccione el número de puntos que desea coincidir.

A continuación, haga clic en el final de la reconstrucción y en el punto de continuación correspondiente en la imagen en vivo para hacer coincidir los finales dendríticos con los comienzos. Una vez que el trazado de la sección anterior esté alineado con las dendritas de la nueva sección, agregue una nueva sección al administrador de secciones como antes. Alternativamente, simplemente seleccione la sección adyacente que se creó anteriormente y ajuste la profundidad z de la misma manera.

Asegúrese de que la nueva sección correspondiente esté seleccionada en el administrador de secciones haciendo clic en la sección actual. Luego, después de aumentar el aumento a 40x o 60x, seleccione la dendrita con la flecha. Haga clic con el botón derecho del ratón en el extremo de la dendrita de la sección anterior y seleccione agregar al final en el menú desplegable.

Un mensaje preguntará si la continuación está en una nueva sección. Haga clic en Sí. A continuación, trace la continuación de la dendrita utilizando el ratón como herramienta de dibujo.

Toma imágenes de los finales en preparación para alinearlos con la siguiente sección. A continuación, añada continuaciones a los trazados dendríticos hasta que se tracen al menos tres secciones para la neurona o hasta que las dendritas ya no puedan seguirse o encontrarse. Usando un programa de extracción asociado con el sistema de reconstrucción de neuronas, abra un archivo de reconstrucción completado.

En el menú desplegable de edición, selecciona seleccionar todos los objetos. Seleccione el análisis de la estructura de la rama en la barra de herramientas de análisis superior y, a continuación, haga clic en cada pestaña y seleccione las opciones de análisis deseadas en cada pestaña. Extraiga todos los datos deseados haciendo clic en el botón Aceptar en la ventana de análisis y guárdelos en formato de hoja de cálculo haciendo clic con el botón derecho en las ventanas de salida y seleccionando exportar a Excel para un análisis más detallado.

Esta fotografía muestra una sola sección coronal a través de la LGN dorsal de un animal. La tinción con citocromo oxidasa se utiliza para visualizar las capas de LGN. Y la tinción de GFP marca el sitio de inyección del virus.

La flecha indica regiones de neuronas del núcleo reticular talámico densas, marcadas retrógradamente. La orientación de la sección es de acuerdo con el compás lateral dorsal, ventral, medial ilustrado. La barra de escala se ilustra en la esquina inferior izquierda.

Esta imagen muestra los contornos del LGN en rojo y el TRN en granate para todas las secciones que contienen la inyección de virus, como lo indican los contornos negros. Las estrellas amarillas indican los centros de los sitios de inyección. Esta imagen muestra la representación en 3D de los contornos y el sitio de inyección.

Este es un mapa de las ubicaciones de las neuronas TRN reconstruidas codificadas por colores de acuerdo con la asignación de clústeres dentro de un solo contorno TRN agregado que se muestra en granate. La barra de escala representa 500 micras. Esta imagen muestra los contornos agregados de TRN en negro y LGN en gris con cinco neuronas TRN reconstruidas coloreadas de cálido a frío de acuerdo con su posición lateral medial dentro de la TRN.

La barra de escala representa 500 micras. Estas fotografías muestran el detalle de las mismas cinco neuronas TRN con barras de escala de colores iguales que representan 100 micras. Este árbol de dendrograma jerárquico ilustra las distancias de ligamiento entre 160 neuronas TRN reconstruidas en función de 10 métricas morfológicas independientes y muestra los resultados generales del análisis de conglomerados.

Tres grupos distintos de neuronas TRN se ilustran en azul, verde y rojo. Una vez que se dominan estas técnicas de reconstrucción neuronal, una sola neurona puede reconstruirse por completo en una o dos horas. Es importante monitorear y ajustar constantemente la profundidad z mientras se reconstruyen las neuronas.

El protocolo descrito aquí es una mejora de los métodos tradicionales de análisis neuroanatómico más sesgados y permite a los investigadores explorar nuevas subclases de neuronas basadas en datos morfológicos a gran escala. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo reconstruir neuronas a través de secciones de tejido adyacentes y extraer datos morfológicos para su posterior análisis.