Las reconstrucciones de gran escala e imparcial La agrupación independiente, basada en métricas morfológicas para clasificar las neuronas en poblaciones selectivos
15 de febrero de 2017
Este protocolo describe reconstrucciones a gran escala de poblaciones neuronales selectivas, etiquetadas después de la infección retrógrada con un virus de la rabia modificado expresan marcadores fluorescentes, y analiza, racimo imparcial independiente que permiten la caracterización completa de las métricas morfológicas entre subclases neuronales distintas.
Los objetivos de este protocolo son describir los pasos para reconstruir la morfología de neuronas marcadas con virus y realizar análisis de agrupamiento independientes y sin sesgo sobre poblaciones de neuronas marcadas, con el fin de permitir una caracterización exhaustiva de las métricas morfológicas a lo largo de subclases neuronales distintas. Describimos un enfoque novedoso para recolectar y analizar datos neuroanatómicos que facilita un muestreo más completo y una clasificación imparcial de tipos neuronales morfológicamente únicos dentro de una población neuronal selectiva. La principal ventaja de esta técnica es que permite un análisis a gran escala de la morfología neuronal y utiliza métodos sin sesgo para clasificar subclases neuronales distintas.
Los aspectos más difíciles de las reconstrucciones morfológicas son seleccionar neuronas bien aisladas para reconstruir, asignar la profundidad z adecuada y alinear las arborizaciones para continuar las reconstrucciones a través de secciones de tejido adyacentes. Comience una reconstrucción seleccionando una lámina que contenga una sección de tejido cerebral de 50 micrones teñida, procedente de un primate inyectado estereotácticamente con un virus de la rabia modificado que expresa EGFP. Coloque la lámina en el portaobjetos del microscopio y enfoque una sola sección de interés utilizando un objetivo de baja magnificación.
Asegúrese de que la imagen de la cámara sea visible en la imagen en vivo mediante el posicionamiento adecuado del obturador de la cámara. Elija una neurona marcada razonablemente aislada dentro de la estructura cerebral de interés para permitir una reconstrucción inequívoca de la arborización dendrítica. Cambie a un aumento de 10x y enfoque la zona.
Seleccione preferentemente neuronas si el cuerpo celular está completamente dentro de una sola sección para estimar con precisión su área y redondez. Una vez elegida una neurona bien teñida y bien aislada, haga clic en el botón de nueva sección en el software para agregar la sección principal que contiene el cuerpo celular al administrador de secciones. Ingrese el número de secciones que se incluirán en la reconstrucción.
Se recomienda insertar dos o tres secciones para comenzar. Asigne un grosor de sección de 50 micrones. Seleccione el objetivo de 2x y luego haga clic en el botón de contorno en la barra de herramientas superior y elija el tipo de contorno desde el menú desplegable.
Siga el contorno de la estructura diana utilizando el mouse para hacer clic en puntos a lo largo del contorno. Cuando termine de trazar el contorno, haga clic con el botón derecho del mouse y seleccione cerrar contorno en el menú para cerrar el contorno. A continuación, con la vista aún en dos x, haga clic en el símbolo de marcador deseado en la barra de herramientas izquierda.
Luego, haga clic en el centro de la estructura diana para colocar el marcador. Una vez que los contornos estén completos, seleccione el objetivo de 40x o 60x para trazar el contorno del cuerpo celular. A continuación, seleccione el botón de trazado de neuronas en la barra de herramientas superior y elija la estructura neuronal a trazar, en este caso el cuerpo celular, en el menú desplegable.
Trace el cuerpo celular haciendo clic en puntos alrededor de la extensión más grande del cuerpo celular, ajustando la profundidad en z según sea necesario para enfocar el cuerpo celular. Haga clic con el botón derecho del ratón para finalizar el contorno del cuerpo celular. A continuación, coloque un marcador de estilo diferente en el centro del contorno del cuerpo celular, asegurándose de que el marcador esté aproximadamente en el centro en profundidad en z.
Es fundamental establecer la profundidad z correcta en la sección inicial, así como en las secciones adyacentes, antes de comenzar cada trazado, para que los valores del eje z sean precisos. Para comenzar el trazado de las arborizaciones dendríticas, seleccione «dendrita» en el menú desplegable superior.
Luego, siga cada dendrita comenzando desde el cuerpo celular. Cuando una dendrita se ramifica, haga clic con el botón derecho del ratón y seleccione nodo bifurcado o nodo trifurcado para colocar un nodo en este punto de ramificación. Asegúrese de ajustar la profundidad en z durante todo el trazado para capturar con precisión el ángulo y la dirección de la dendrita.
Al final del dendrito en esta sección, haga clic con el botón derecho del ratón y seleccione finalización en el menú desplegable. Cuando se hayan trazado todas las arborizaciones dendríticas en la sección principal, identifique aquellas terminaciones dendríticas que probablemente continúen en la sección adyacente. Lleve estas al enfoque adecuado en la profundidad z apropiada en la imagen del microscopio a 20x.
Incluya puntos de referencia principales cercanos, como vasos sanguíneos o patrones o haces de dendritas fácilmente reconocibles en la imagen del microscopio. A continuación, tome una fotografía de la imagen en vivo utilizando una cámara digital sostenida manualmente frente a la pantalla del ordenador. Luego cambie el objetivo del microscopio a dos aumentos y muévase a la sección adyacente del portaobjetos.
Luego, alinee los contornos de la sección previamente trazada en la vista del software con los límites del NGL y el TRN en la nueva sección. Regrese a 20x y realice el alineamiento utilizando los puntos de referencia. A continuación, con ayuda de la foto de los terminales dendríticos de la sección previamente trazada, mueva el trazado para alinear las dendritas, seleccionando primero la reconstrucción con la herramienta de flecha.
Luego, haga clic con el botón derecho y seleccione mover en el menú desplegable, y mueva el trazado en consecuencia. Para rotar el trazado, haga clic con el botón derecho y seleccione rotar en el menú desplegable, y rote el trazado según sea necesario. Alternativamente, seleccione la herramienta de coincidencia en el menú desplegable de herramientas superior y seleccione el número de puntos a coincidir.
Luego, haga clic en el extremo de la reconstrucción y en el punto de continuación correspondiente en la imagen en vivo para emparejar los extremos dendríticos con sus inicios. Una vez que el trazado de la sección anterior esté alineado con las dendritas en la nueva sección, agregue una nueva sección al administrador de secciones como antes. Alternativamente, simplemente seleccione la sección adyacente creada previamente y ajuste la profundidad en z de la misma manera.
Asegúrese de que la nueva sección correspondiente esté seleccionada en el administrador de secciones haciendo clic en la sección actual. Luego, después de aumentar la magnificación a 40x o 60x, seleccione la dendrita usando la flecha. Haga clic con el botón derecho del ratón en el extremo de la dendrita de la sección anterior y seleccione agregar al final en el menú desplegable.
Un mensaje preguntará si la continuación está en una nueva sección. Haga clic en sí. Luego, siga la continuación de la dendrita utilizando el ratón como herramienta de dibujo.
Tome imágenes de los extremos en preparación para alinearlos con la siguiente sección. Luego, agregue continuaciones a los trazados dendríticos hasta que se hayan trazado al menos tres secciones para la neurona o hasta que ya no se puedan seguir o encontrar las dendritas. Utilizando un programa de extracción asociado con el sistema de reconstrucción neuronal, abra un archivo de reconstrucción completado.
En el menú desplegable de edición, seleccione seleccionar todos los objetos. Seleccione análisis de estructura de ramas en la barra de herramientas de análisis superior y luego haga clic en cada pestaña y seleccione las opciones de análisis deseadas en cada una. Extraiga todos los datos deseados haciendo clic en el botón Aceptar en la ventana de análisis y guárdelos en un formato de hoja de cálculo haciendo clic derecho en las ventanas de salida y seleccionando exportar a Excel para análisis posteriores.
Esta fotografía muestra una única sección coronal a través del LGN dorsal de un animal. La tinción de citocromo oxidasa se utiliza para visualizar las capas del LGN. Y la tinción de GFP marca el sitio de inyección del virus.
La flecha indica regiones de neuronas densas del núcleo reticular talámico marcadas de forma retrógrada. La orientación de la sección se corresponde con la brújula dorsal-ventral-medial-lateral ilustrada. La barra de escala se muestra en la esquina inferior izquierda.
Esta imagen muestra los contornos del NGL en rojo y del NRT en marrón para todas las secciones que contienen la inyección del virus, indicadas por los contornos negros. Las estrellas amarillas indican los centros de los sitios de inyección. Esta imagen muestra la representación tridimensional de los contornos y del sitio de inyección.
Este es un mapa de las ubicaciones de las neuronas del NTR reconstruidas, codificadas por colores según la asignación de clústeres dentro de un contorno agregado del NTR mostrado en marrón. La barra de escala representa 500 micrómetros. Esta imagen muestra los contornos agregados del NTR en negro y del GLN en gris, con cinco neuronas del NTR reconstruidas coloreadas desde tonos cálidos hasta fríos según su posición medial lateral dentro del NTR.
La barra de escala representa 500 micrones. Estas fotografías muestran el detalle de los mismos cinco neuronas de la NTR con barras de escala en colores coincidentes que representan 100 micrones. Este árbol dendrograma jerárquico ilustra las distancias de vinculación entre 160 neuronas de la NTR reconstruidas según 10 métricas morfológicas independientes y muestra los resultados generales del análisis de agrupamiento.
Tres grupos distintos de neuronas TRN se ilustran en azul, verde y rojo. Una vez dominadas estas técnicas de reconstrucción neuronal, se puede reconstruir completamente una sola neurona en una o dos horas. Es importante monitorear y ajustar constantemente la profundidad en z durante la reconstrucción de las neuronas.
El protocolo descrito aquí representa una mejora respecto a los métodos tradicionales de análisis neuroanatómico, más sesgados, y permite a los investigadores explorar nuevas subclases de neuronas basándose en datos morfológicos a gran escala. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo reconstruir neuronas mediante secciones de tejido adyacentes y extraer datos morfológicos para análisis posteriores.
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Descripción general
Este protocolo describe un método para reconstruir la morfología de neuronas marcadas mediante infección retrógrada con un virus de la rabia modificado. Se enfatizan análisis de agrupamiento imparciales para caracterizar subclases neuronales distintas basadas en métricas morfológicas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Neuroanatomía
- Biología celular
Antecedentes
- Comprender la morfología neuronal es fundamental para clasificar los tipos neuronales.
- Los métodos tradicionales pueden introducir sesgos en el análisis morfológico.
- El virus de la rabia modificado puede marcar eficazmente poblaciones neuronales específicas.
- Los análisis de agrupamiento imparciales mejoran la caracterización de las subclases neuronales.
Objetivo del estudio
- Reconstruir la morfología de neuronas marcadas con virus.
- Realizar análisis de agrupamiento imparciales en poblaciones de neuronas marcadas.
- Facilitar la caracterización exhaustiva de subclases neuronales distintas.
Métodos Utilizados
- Selección de neuronas bien aisladas para la reconstrucción.
- Asignación de la profundidad z adecuada para una representación morfológica precisa.
- Alineación de arborizaciones en secciones de tejido adyacentes.
- Uso de un microscopio para enfocar secciones de tejido cerebral teñidas.
Resultados Principales
- Análisis exitoso a gran escala de la morfología neuronal.
- Identificación de tipos neuronales morfológicamente únicos.
- Clasificación imparcial de subclases neuronales distintas.
- Mejor comprensión de la recopilación y el análisis de datos neuroanatómicos.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un marco robusto para la reconstrucción de la morfología neuronal.
- Los métodos imparciales mejoran la precisión en la clasificación de subclases neuronales.
- Este enfoque puede facilitar estudios neuroanatómicos futuros.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite la clasificación morfológica a gran escala e imparcial de poblaciones neuronales, apoyando la validación de objetivos en el descubrimiento de fármacos en neurociencia al reducir la ambigüedad mecanicista en la identificación de subtipos neuronales. El enfoque mejora la confianza predictiva en modelos preclínicos al proporcionar métricas cuantitativas y reproducibles para reducir los riesgos asociados a hipótesis sobre objetivos vinculados a la función de circuitos neuronales. Este método sitúa la fenotipificación morfológica como una herramienta escalable en la etapa de descubrimiento para priorizar objetivos con una fuerte continuidad translacional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofarmacéuticos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la clasificación imparcial de subclases neuronales basada en métricas morfológicas.
- Valor operativo: Apoya la reducción de riesgos biológicos al establecer criterios cuantitativos para distinguir poblaciones neuronales funcionalmente distintas.
- Valor predictivo: Mejora la confianza en los objetivos al vincular la singularidad morfológica con una posible respuesta diferencial a fármacos en poblaciones neuronales selectivas.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Prepara sistemas neuronales validados para el desarrollo de ensayos posteriores mediante la definición de subclases morfológicamente distintas para modelos celulares consistentes.
- Valor operativo: Aborda la estandarización y reproducibilidad de ensayos mediante la extracción de datos morfológicos cuantitativos adecuados para plataformas de cribado de alto contenido.
- Escalabilidad: Permite la reutilización de la plataforma en diferentes poblaciones neuronales mediante el establecimiento de un flujo de trabajo transferible para la reconstrucción y agrupación a gran escala.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Apoya la modelización de sistemas relevantes para enfermedades al permitir la clasificación de tipos neuronales en regiones cerebrales de primates relacionadas con objetivos de trastornos neuropsiquiátricos.
- Alineación Preclínica: Facilita decisiones de avance ajustadas al riesgo al proporcionar biomarcadores morfológicos que se correlacionan con la activación de vías específicas de subtipos neuronales.
- Reducción de Riesgo Mecanicista: Reduce el riesgo biológico en etapas avanzadas al validar la selectividad del objetivo mediante un perfilado morfológico exhaustivo de poblaciones neuronales fuera del objetivo.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la prueba inicial de hipótesis sobre dianas hasta la identificación de compuestos líderes, donde la clasificación morfológica orienta el cribado de compuestos en sistemas neuronales relevantes para la enfermedad.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir la identificación imparcial de subclases neuronales que podrían modular diferencialmente circuitos relevantes para la enfermedad.
- Selección: Mejora la preparación del ensayo al proporcionar resultados morfológicos cuantitativos que aseguran la consistencia en los modelos neuronales utilizados para la evaluación de compuestos.
- Análisis: Ofrece análisis estadísticos de agrupamiento y métricas morfológicas que permiten la comparación de poblaciones neuronales entre diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica mediante el perfilado morfológico en sistemas neuronales de primates con relevancia para dianas cerebrales humanas.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad de perfilado neuroanatómico reutilizable, aplicable a múltiples poblaciones neuronales y regiones cerebrales para la validación de dianas en toda la cartera.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de dianas mediante la reducción de la ambigüedad mecanicista en la clasificación de subtipos neuronales.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad de la generación de datos morfológicos entre laboratorios y estudios.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de avance o interrupción al permitir la eliminación temprana de riesgos asociados a las dianas basándose en la especificidad de la subclase neuronal, reduciendo así el riesgo de fracaso biológico en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo de las decisiones de avance mediante la clasificación objetiva de poblaciones neuronales según su morfología en modelos preclínicos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en trazado neuroanatómico, microscopía confocal y software de reconstrucción 3D para capturar con precisión la morfología neuronal.
- Depende de una infraestructura de microscopía capaz de realizar secciones en z y de imágenes fluorescentes de cortes de tejido gruesos, junto con herramientas computacionales para la extracción morfológica y el análisis de agrupaciones.
- Necesita una estandarización entre equipos de los protocolos de trazado y de las definiciones de métricas morfológicas para garantizar la reproducibilidad entre diferentes sitios y operadores.
- Requiere consideraciones de adaptación al aplicar el método a diferentes poblaciones neuronales, regiones cerebrales o especies debido a las variaciones en la morfología y en la eficiencia de marcado.
- Las limitaciones prácticas incluyen la naturaleza intensiva en tiempo del trazado manual y la dependencia de un marcado viral de alta calidad y de la preservación adecuada del tejido para obtener reconstrucciones confiables.
