La cuantificación rápida de Blastogénesis inducida por mitógeno de linfocitos T para identificar fármacos inmunomoduladores

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la potencia de los fármacos inmunomoduladores mediante un contador celular automatizado mediante la medición de la blastogénesis de los linfocitos T o la transformación del blasto. Este ensayo proporciona un método rápido para cuantificar la activación de los linfocitos T utilizando un contador de células automatizado que está equipado para medir los diámetros de las células. La principal ventaja de esta técnica es que permite la medición rápida, sencilla y directa a partir de células individuales, a diferencia de los ensayos comunes de proliferación de linfocitos T.

El tratamiento de los linfocitos con fármacos inmunomoduladores aumentará o disminuirá la tasa y la extensión de la blastogénesis celular. Utilizando el ensayo de contador de células, el alcance de esta blastogénesis se puede medir en aproximadamente cuatro minutos por muestra. Dentro de los diez minutos posteriores al sacrificio, rocíe el abdomen del ratón con etanol al 70 por ciento y use unas tijeras para hacer una incisión en el pelaje y la piel del lado izquierdo del animal.

Mantenga la piel separada y hacia atrás para revelar el peritoneo. Luego aplique clorhexidina al cuatro por ciento en el sitio de la incisión. Con un segundo juego de tijeras y fórceps, haga un corte de dos a tres centímetros a lo largo del abdomen central para abrir el peritoneo.

Luego, retire las inserciones viscerales y el exceso de grasa que rodea el bazo y transfiera el tejido a un recipiente de DPBS. A continuación, agregue diez mililitros de medio RPMI 1640 completo a una placa de cultivo de diez centímetros y triture los bazos entre dos portaobjetos de vidrio esmerilado esterilizados. Filtre la suspensión de tejido a través de un colador de células de nailon estéril de 40 micras en una nueva placa de cultivo de diez centímetros para eliminar los tejidos conectivos y los desechos y transferir la suspensión de una sola célula a un tubo cónico de 50 mililitros para la centrifugación.

Vuelva a suspender el pellet en 20 mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos. Después de diez minutos a temperatura ambiente con un balanceo suave, recoja las células con otra centrifugación y vuelva a suspender el pellet en diez mililitros de medio fresco. A continuación, vuelva a centrifugar las células para su resuspensión en dos mililitros de 37 grados centígrados en medio completo.

Para purificar las células T, primero lave una o dos columnas de lana de nailon por bazo dos veces con cinco mililitros de RPMI completo y coloque las columnas en una incubadora de cultivo celular a 37 grados Celsius y cinco por ciento de dióxido de carbono durante una hora. Al final de la incubación, cargue dos mililitros de la suspensión de esplenocitos aislados en la parte superior de cada columna y permita que las células pasen a través de la columna hasta que el líquido llegue a la parte superior de la lana. A continuación, agregue dos mililitros de medio completo fresco de 37 grados centígrados a la parte superior de las columnas y deje que el medio pase a través de la lana de nailon hasta que el líquido en la parte superior de la columna llegue a la parte superior de la lana.

Ahora cubra la lana con tres mililitros de medio completo a 37 grados centígrados y devuelva la columna a la incubadora de cultivo celular para que todas las células B, fibroblastos y células accesorias se adhieran a las fibras de lana. Después de una hora, en un tubo cónico nuevo de 50 mililitros, lavar la columna dos veces con cinco mililitros de medio completo fresco para eluir las células T no adherentes. A continuación, recoja las células por centrifugación.

Después de lavar las células T una vez con diez mililitros de medio completo, vuelva a suspender el pellet en dos mililitros de medio completo fresco. A continuación, cuente las células y diluya la suspensión a una concentración de 0,5 veces diez a seis células por mililitro en medio fresco y completo para sembrar en una placa de cultivo celular de seis o 24 pocillos, según sea apropiado experimentalmente. Dentro de las 24 horas posteriores a su aislamiento, activar las células T aisladas en columna de lana de nailon con el estímulo adecuado y el fármaco experimental de interés.

Después de 12 a 72 horas, use una pipeta de un mililitro para mezclar suavemente las células tratadas activadas para eliminar cualquier grumo. Para medir los diámetros de las celdas mediante el contador de células automatizado, transfiera un mililitro de las células tratadas de cada pocillo a tazas de muestra individuales y coloque las tazas de muestra en el carrusel de muestras del contador de celdas automatizado. Introduzca el ID de muestra y la información del tipo de celda para registrar las muestras y comenzar a ejecutarlas.

Después de mezclar el azul de tripán con la suspensión celular, las células se pasan a través de un campo de imágenes hasta que se recolectan aproximadamente 100 imágenes celulares de cada muestra. El software dibuja un círculo alrededor de cada célula detectada con y sin tinción con azul de tripán para determinar el diámetro de la célula. Cuando se han medido todas las celdas, los datos se exportan a una hoja de cálculo que muestra los resultados como los recuentos totales y viables de celdas para cada diámetro medido.

A continuación, los datos se pueden presentar como histogramas. Después de dos días de estimulación con PMA e ionomicina, se observa un cambio significativo en la mediana de la distribución de frecuencias hacia diámetros de células más grandes con el número de células T con diámetros más pequeños reducido en consecuencia. A una concentración fija de ionomicina de 250 nanomolares, el efecto PMA no cambia significativamente al elevar la concentración del estímulo de activación de dos a 250 nanogramos por mililitro.

Tampoco se observa una diferencia apreciable en la proliferación de linfocitos T. Los fármacos inhibidores de la calcineurina suprimen parcialmente tanto la blastogénesis como la proliferación de las células T. El tratamiento de células T con compuestos inmunosupresores que se dirigen al factor nuclear de calcineurina de las células T activadas inhibe la respuesta blastogénica en casi un 72 por ciento.

La rapamicina y FTY720 muestran efectos moderados pero estadísticamente significativos sobre la blastogénesis. Mientras que TRAM34 aparentemente no afecta la proliferación de células T murinas, incluso a concentraciones de 700 nanomolares. Cuando la rapamicina y la ciclosporina A se usan juntas, la blastogénesis se inhibe completamente.

Se observan resultados similares con los linfocitos T murinos activados con perlas magnéticas conjugadas anti-CD3 y anti-CD28. Este ensayo se puede utilizar para cuantificar con éxito los efectos de varios fármacos inmunomoduladores, lo que proporciona una mejor evaluación de la potencia del fármaco en comparación con los ensayos de proliferación típicos que también incluyen contribuciones de células apoptóticas y necróticas. Con este método, se pueden medir hasta 15 muestras de entrada y salida, lo que permite la cuantificación simultánea y posterior de las tasas de blastogénesis y proliferación.

Ocasionalmente, las burbujas de aire pueden entrar en la celda de flujo haciendo que la medición sea inutilizable, por lo tanto, todas las imágenes deben examinarse en busca de burbujas de aire antes de que los datos de cada ensayo se acepten para su análisis. Una limitación de este procedimiento es que si hay demasiados residuos en la muestra, la medición puede tratar los restos como células viables. Con las modificaciones adecuadas, este ensayo tiene el potencial de adaptarse para estudiar el cambio de tamaño celular en neutrófilos y hepatocitos.