Name: La cuantificación rápida de Blastogénesis inducida por mitógeno de linfocitos T para identificar fármacos inmunomoduladores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Aprende a cuantificar la blastogénesis de linfocitos T mediante un contador celular automatizado para evaluar fármacos inmunomoduladores. Este método rápido mide diámetros celulares directamente en muestras individuales.

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Agradecemos a Lucile Wrenshall por el uso del lector de placas, a Nancy Bigley por su útil discusión, y a Tom Brown por el regalo de los ratones ICR. Este trabajo fue financiado por la subvención 1R01AI114804 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas y por los fondos de Desarrollo Docente de WSU (a J.A.K.). J.N.G. fue financiado en parte por la subvención del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales R25GM090122.

Todos los experimentos se llevan a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por la Junta Universitaria Laboratorio Cuidado de Animales y el empleo Comisión de Revisión Institucional y el estado de Wright. NOTA: PBMCs humanos se aíslan por el gradiente de densidad método de centrifugación Ficoll 5. 1. Bazo cosecha <ol><li> Casa adultos ratones hembra ICR en condiciones de laboratorio estándar con los alimentos, agua, ropa de cama y los requisitos específicos para la especie. NOTA: Los animales tenían una edad media de 2,9 meses y un peso promedio de 30.4 g en el momento de la eutanasia. </li><li> En la fecha de aislamiento (DOI), la eutanasia a los animales de forma individual sin otros animales conspecific presentes. Hacer todos los esfuerzos para garantizar un mínimo de estrés para el ratón. La eutanasia utilizando CO 2 con dislocación cervical secundaria para asegurar la muerte. <ol><li> Colocar el animal, aún dentro de la jaula de transferencia, en la cámara de CO 2 y stata el flujo de gas a 5 L / min. Esta velocidad de flujo desplaza el oxígeno en el recomendado 10 a 30% por min. </li><li> Después de que el animal está inconsciente, aumentar la velocidad de flujo de CO 2 a 15 L / min. Compruebe el animal para el cese de la respiración y dejar en la cámara durante 2 minutos adicionales. </li><li> Aplicar dislocación cervical con fuerza de distracción para asegurar la muerte. </li></ol></li><li> Se recoge el bazo del animal utilizando una técnica aséptica dentro de 10 min de la muerte. <ol><li> Esterilizar dos juegos de tijeras y pinzas para la extracción del bazo en un autoclave horno antes de su uso. Esterilizar la superficie de la disección mediante la aplicación de 70% de etanol. </li><li> Aplicar 70% de etanol en el abdomen del ratón. El uso de un conjunto de tijeras y pinzas, hacer un corte en el pelaje y la piel desde el lado izquierdo del abdomen, a continuación, tire de distancia y remueva la piel para revelar el peritoneo. Una vez expuesto, aplicar la solución de clorhexidina al 4% antes de abrir el peritoneo. </li><li> El uso de la segunda serie de cienciassors y fórceps, hacen un corte de 2 a 3 cm a lo largo del abdomen central. Abrir el peritoneo y extirpar el bazo mediante el corte de los archivos adjuntos y el exceso de grasa visceral. Coloque el bazo en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS). </li></ol></li></ol> 2. Preparación de esplenocitos primas NOTA: Realizar todos los pasos bajo un gabinete de flujo laminar de bioseguridad mediante una técnica aséptica. <ol><li> Remojar los bazos recolectadas en 10 ml de H desionizada estéril 2 O durante 5 minutos en una placa de cultivo de 10 cm para lisar los eritrocitos de la superficie. Nota: Este paso se puede omitir si el bazo fue dañada durante el aislamiento. </li><li> Para liberar los esplenocitos, aplastar los bazos entre dos portaobjetos de vidrio esterilizados (lado esmerilado frente al bazo) a través de una placa de 10 cm de cultivo fresco. Mezclar con 10 ml de RPMI-1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino, 2 mM L-glutamina, 50 UI / ml de penicilina y 50 mg / ml de estreptomicina (a continuación se refiere a unas RPMI completo). </li><li> Filtrar las células a través de una 40 micras filtro de células de nylon estéril en una nueva placa de cultivo de 10 cm para eliminar el tejido conjuntivo y los residuos. </li><li> Lyse los eritrocitos restantes mediante la adición de 20 ml de tampón de lisis RBC compuestos por 155 mM NH 4 Cl, 10 mM NaHCO 3, y EDTA 0,1 mM a pH 7,4 y ~ 300 mOsm / L. NOTA: La osmolalidad se mide por un punto de congelación o un osmómetro de presión de vapor. <ol><li> Transferencia de las células de la placa de 10 cm a un tubo cónico de 50 ml y centrifugar a 250 xg durante 10 min (4 ° C). </li><li> Eliminar el sobrenadante, añadir 20 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos, y volver a suspender las células sedimentadas con la pipeta. </li><li> Incubar a temperatura ambiente en el tampón de lisis durante 10 minutos con agitación suave. </li><li> Centrifugar durante 10 min a 250 xg (4 ° C) para sedimentar las células. Retirar el tampón de lisis. </li><li> células Vuelva a suspender en 10 ml de RPMI completo y se centrifuga de nuevo (250 xg, 10 min, 4 ° C). DesctARD El sobrenadante. </li></ol></li><li> Vuelva a suspender los esplenocitos en 2 ml de RPMI completo se calentó a 37 ° C para la transferencia a la columna de la fibra de lana de nylon. </li></ol> 3. Purificación de los linfocitos T <ol><li> Lavar las columnas de lana de nylon dos veces con 5 ml de RPMI completo. Incubar a 37 ° C en un CO 2 incubadora de cultivo celular 5% durante 1 hora. NOTA: Es imprescindible para mantener la lana de nylon húmedo durante la duración del experimento y utilizar RPMI completo calentó a 37 ° C para todos los pasos de aislamiento de lana de nylon. </li><li> Añadir esplenocitos aislados a la columna y se incuba durante 1 hora para permitir que las células B, fibroblastos, y células accesorias a que se adhieran a la lana de nylon. <ol><li> Añadir 2 ml de RPMI que contienen los esplenocitos en la columna y pasar a través hasta que se alcance la parte superior de la lana de nylon. </li><li> Añadir 2 ml de RPMI completo se calentó a 37 ° C en la parte superior de la lana de nylon y pasar el medio a través de la lanahasta que el nivel del líquido alcanza la superficie superior. </li><li> Añadir 3 ml de calentamiento RPMI completo a la columna para cubrir completamente la lana de nylon. </li><li> Incubar la columna cargada sin problemas en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora de cultivo celular durante 1 hora. </li></ol></li><li> Eluir las células por lavado de la columna dos veces con 5 ml de RPMI completo. Realizar un lavado adicional de las células eluidas mediante centrifugación. <ol><li> Llenar la columna a la parte superior 2 veces con RPMI completo y permitir que la solución en la columna fluya a través en un tubo cónico estéril de 50 ml. NOTA: Evitar tocar o golpear la columna, que se pueden desprender las células B, células accesorias, y los fibroblastos se adhieren a la lana de nylon. </li><li> Recoger la fracción de flujo a través y centrifugado a 250 xg durante 10 min (4 ° C) para sedimentar las células. Lavar una vez con 10 ml de RPMI completo. Sedimentar las células de nuevo (250 xg, 10 min, 4 ° C) y volver a suspender en 2 ml de RPMI completo. </li><li> Medir la c<html> densidad ell usando un hemocitómetro y se diluye en RPMI completo a 0,5 x 10 6 células / ml. </li><li> Seed 1 o 2 ml alícuotas de células en cada pocillo de una placa de cultivo celular de 24 ó 6 pocillos, respectivamente, y cultivar las células a 37 ° C con 5% de CO 2. NOTA: 1 mM de 1,4-ditiotreitol (DTT) se puede añadir a cada pocillo en esta fase para mejorar la supervivencia de células T. </li><li> Opcional: Confirmar la eficiencia del protocolo de aislamiento por citometría de flujo. Este protocolo produce normalmente ~ 80% de los linfocitos T 23. Nota: las de lana purificado de nylon contienen aproximadamente 50% de células CD4 + y 23% de CD8 + células. Para purificar el CD4 + y CD8 + subpoblaciones más, una única etapa de agotamiento inmunomagnética se puede realizar utilizando ocho anticuerpos y perlas magnéticas 24. Alternativamente, más pura CD4 + y las poblaciones de células T CD8 + pueden aislarse mediante selección positiva o negativa con anticuerpos específicos. </li></ol></li></ol>_TITLE &quot;&gt; 4. La activación de los linfocitos T y la exposición al fármaco experimental <ol><li> Activar los linfocitos T dentro de 24 h de aislamiento a través de la adición de PMA y ionomicina sal de calcio o perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos anti-CD28 23,25,26 anti-CD3 y. Añadir fármacos experimentales (por ejemplo, ciclosporina, FK506, rapamicina, TRAM-34, y FTY720) en el momento de la activación. NOTA: Aquí, las concentraciones de PMA varió de 2 a 250 ng / ml, y la concentración ionomicina se mantuvo a 250 nM. Si es posible, las diluciones deben prepararse a partir de alícuotas del stock de cada fármaco de modo que el volumen añadido a cada pocillo de células es ≥1 l para asegurar la reproducibilidad. El perlas magnéticas anti-CD3 / anti-CD28-revestido se añaden en una proporción de 1: en perlas a célula 1. Aumentar el número de granos por célula (es decir, la proporción de grano a célula) aumentará la intensidad de la estimulación 25,26. Las perlas se lavaron y se resuspendieron en RPMI completo antes de su adición a las células. Tenga en cuenta que tripanoazul tiñe las perlas. </li><li> Cultivar las células durante 12-72 horas a 37 ° C con 5% de CO2 antes de analizar con el contador de células automatizado. </li></ol> 5. Automated Cell Collection Contador de datos <ol><li> Antes de ejecutar la muestra, asegúrese de que las células se mezclan suavemente con una pipeta serológica para evitar grumos. Esto es particularmente importante para los linfocitos activados por el aumento de la adhesividad. <ol><li> Para los cultivos que se activan con perlas anti-CD3 / CD28, después de pipetear, transferir la muestra a un tubo de centrífuga de 1,5 ml o 2 ml. Separar las perlas, manteniendo el tubo en un imán para 1-2 min. Usar el sobrenadante que contiene las células para el análisis. NOTA: analizar tanto las células en reposo y activadas dentro de 1 hr para dar cuenta de cualquier pre-activación de las células en reposo por el suero presentes en el medio de cultivo. Después de 12 h de PMA / ionomicina estimulación, un pequeño aumento en el tamaño celular era detectable (Figura 2 </strong&gt;). A 72 hr, ningún aumento significativo tamaño de la célula en comparación con se observó 48 horas (datos no mostrados). </li></ol></li><li> Se transfiere 1 ml de la suspensión de células en una cubeta de muestra y ejecutarlo a través del contador de células automatizado de acuerdo a las instrucciones del manual. NOTA: Para cada uno de los ensayos, un mínimo de 1 ml (un máximo de 2 ml) de cultivo celular se debe utilizar. El contador de células automatizado utiliza una jeringa para mezclar con azul de tripano con la suspensión de células y pasa la mezcla de azul de tripano de células sobre un campo que es imaginada y analizada por el software. El software detecta las células teñidas de azul de tripano, dibuja un círculo alrededor de cada célula, y determina el diámetro. 100 imágenes se recogen de cada muestra, y la viabilidad celular y se determinan los tamaños. El umbral de detección del contador de células usada aquí tiene un límite inferior de 5 micras. </li><li> Transferir datos de cada ejecución de una hoja de cálculo para su posterior análisis. </li><li> Calibrar el dispositivo sobre una base regular con un 1muestra ml de 6 micras y 8 micras perlas de poliestireno de diámetro. NOTA: Los tamaños de perlas reales medidos por el fabricante para cada lote se deben utilizar, no el tamaño nominal. 6 y 8 micras perlas son convenientes porque estos diámetros se encuentran cerca de los diámetros esperados de reposo y células T activadas (ver Figura 1). </li></ol> 6. datos y análisis estadístico <ol><li> Analizar los datos utilizando el software estadístico y la representación gráfica apropiada. NOTA: La hoja de cálculo para cada ejecución contiene el número de células con cada diámetro (rango: 5 micras a 70 micras). Las células por encima de un diámetro de 17 micras se eliminan del análisis para excluir las partículas de polvo y las pequeñas burbujas, que se pueden leer las células viables por el instrumento. </li><li> Realizar la prueba de hipótesis usando la prueba t de Welch para los conjuntos de datos con una varianza desigual; los resultados se consideraron estadísticamente significativos si p &lt;0,001. La fórmula utilizada fue, <img alt = &quot;Ecuación 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55212 / 55212eq1.jpg&quot; /&gt; dónde <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/55212/55212eq2.jpg" /> y <img alt="Ecuación 3" src="/files/ftp_upload/55212/55212eq3.jpg" /> son medias de la muestra, <img alt="Ecuación 4" src="/files/ftp_upload/55212/55212eq4.jpg" /> y <img alt="Ecuación 5" src="/files/ftp_upload/55212/55212eq5.jpg" /> son varianzas de las muestras, y <img alt="Ecuación 6" src="/files/ftp_upload/55212/55212eq6.jpg" /> y <img alt="Ecuación 7" src="/files/ftp_upload/55212/55212eq7.jpg" /> son los tamaños de muestra para cada conjunto de datos. El número de grados de libertad se estima de forma conservadora mediante el menor de los dos tamaños de muestra para cada comparación. Los gráficos de barras se presentan como la media ± SEM. </li></ol> 7. esplénica ensayo de proliferación de linfocitos T <ol><li> Medir la proliferación de células T usando un ensayo de proliferación de MTS- o lector de placas colorimétrico basado en MTT. NOTA: El ensayo es la based en el compuesto de tetrazolio MTS (reactivo de Owen) reducción al producto de formazán soluble, probablemente por la NADPH o NADH producido en las células metabólicamente activas por las enzimas deshidrogenasa. </li><li> Recuento de células T purificadas con un hemocitómetro y volver a suspender en RPMI-1640 completo a una densidad final de 1 x 10 6 células / ml. NOTA: 1 mM de DTT se puede añadir a las células en esta etapa. </li><li> Activar las células con PMA e ionomicina junto con fármacos de ensayo, si es necesario, y mezclar suavemente (similar al paso 4). </li><li> Plate 100 l de las células en cada pocillo de una placa tratada de cultivo celular de 96 pocillos y se incuba a 37 ° C con 5% de CO2 durante 48 hr. Añadir 100 l de medio RPMI-1640 sin células en un pocillo para obtener una lectura de la absorbancia de fondo. </li><li> Añadir 20 l de reactivo basado en MTS a cada pocillo y se incuba a 37 ° C con 5% de CO2 durante 4 hr. </li><li> Tomar mediciones de absorbancia a 490 nm usando un lector de placas. La Amediciones bsorbance corresponden al número de células metabólicamente activas en cada pocillo. NOTA: Restar los niveles de fondo si es necesario. Los valores de absorbancia de fondo dependen del tipo de medio de cultivo, suero, pH externo, y la duración de la exposición de reactivo MTS a la luz. reactivos basados ​​en MTS son sensibles a la luz, y la exposición a la luz durante varias horas pueden resultar en mayores valores de absorbancia de fondo. </li></ol>

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Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.

A continuación, describimos una técnica para la rápida detección y cuantificación de células T transformación blastogénica usando un contador de células automatizado. Bajo nuestras condiciones (250 ng / ml de PMA y 250 nM ionomicina estimulación), el área de la superficie celular se aumentó dos veces y el volumen tres veces después de 48 h de activación. El ensayo es suficientemente sensible para detectar la voladura durante la primera 12 h de activación, en el que el volumen de la célula aumentó sólo 1,25 veces en comparación con reposo (Figura 2D). Un mecanismo más fisiológicamente relevantes de la activación de células T utilizando anti-CD3 y perlas magnéticas recubiertas con anticuerpo anti-CD28 produjo una respuesta blastogénica significativa, con un aumento medio de 2,3 veces en el volumen (72 hr después de la activación, la Figura 3D). Células mononucleares humanas mostraron un cambio de 2,6 veces en volumen a PMA / ionomicina estimulación durante 48 horas (Figura 4). El diámetro medio de las células T del bazo del ratón ICR y el volumen se determinó que eran6,9 micras y 1,9 x 10 -4 nl, respectivamente. PBMCs humanos (de un donante sano) tenían un diámetro medio de 7,7 micras y un volumen promedio de 2,7 x 10 -4 nl. Usando este protocolo, también a prueba concentraciones crecientes de PMA por su capacidad para activar las células T. Estos resultados unicelulares fueron consistentes con los ensayos de proliferación realizados en concentraciones similares de EPM. Varios compuestos reportados para afectar la proliferación de células se ensayaron: FTY720 31,32; la inmunosupresores ciclosporina A, FK506, y rapamicina 27,28; y TRAM-34, un bloqueador de los canales de calcio activados por KCa3.1 33,35. Se encontró que, a las concentraciones ensayadas, los inhibidores más potentes de blastogénesis eran CsA y FK506. La rapamicina tenía un efecto supresor más pequeño pero estadísticamente significativo en la blastogénesis. TRAM-34, por otro lado, no afectó a la blastogénesis. CsA suprime tanto la blastogénesis y proliferation, pero no completamente (Figura 2B y 2C), lo que demuestra que la medición contador de células automatizado es una buena correlación de la eficiencia de drogas en la proliferación de células T. En presencia de rapamicina junto con CsA, blastogénesis se inhibió completamente, lo que sugiere que las vías mediadas por mTOR NFAT- y en combinación pueden dar cuenta plenamente para la ampliación de las células T a la estimulación mitogénica con PMA / ionomicina (Figura 3C). El rango dinámico de algunos ensayos de proliferación está limitada (véase la Figura 2). Los ensayos de proliferación, como la que hemos utilizado (Figura 2C), reportar una señal que incluye las contribuciones de células apoptóticas y necróticas. Las medidas automáticas de cambio de diámetro no tienen esa limitación, ya que las mediciones se refieren sólo a las células viables. La viabilidad celular se evaluó mediante la exclusión de tinción de azul de tripano de las células sanas, viables. En las mediciones de tamaño, utilizando adelantedispersión de la luz en citometría de flujo de células doblete discriminación puede ser problemático 22. En las mediciones de contador de células automatizado, sin población doblete se encontró (Figura 1). Además, la medición fue suficientemente preciso para distinguir entre los efectos de 100 y 200 nM ciclosporina (Tabla 1) y para detectar la blastogénesis dentro de 12 h de la estimulación mitogénica (Figura 2D). Este nuevo ensayo es particularmente útil para pequeñas cantidades de muestras. Hasta 15 muestras se pueden medir en 1 hr. Sin embargo, el ensayo tiene sus limitaciones, la mayoría de los cuales pueden ser mitigados. A pesar de que puede resolver con eficacia diferencia pequeña (&lt;1 m) de diámetro celular, el modelo de máquina que usamos tiene un umbral de detección inferior de 5 micras. Este límite puede causar la sobreestimación de tamaños muy pequeños de células, ya que excluye efectivamente todas las células con diámetros más pequeños. Sin embargo, los nuevos modelos de la contador de células tienen umbral de detecciónedad de ~ 2 micras, que debería aliviar este problema. Si hay demasiada escombros en la muestra, el instrumento las trata como células viables. Además, las burbujas de aire de vez en cuando pueden entrar en la celda de flujo y causar distorsiones en las imágenes captadas por las células de la máquina. La distorsión no parece afectar a la determinación de la viabilidad, pero puede afectar a los diámetros medidos. Por lo tanto, se recomienda que todas las imágenes ser revisados ​​por el experimentador haya burbujas de aire antes de aceptar los datos de cada ensayo para el análisis. Puesto que el software sólo se dibuja círculos alrededor de las células, los diámetros de las células no esféricas pueden ser sesgada hacia el eje largo, haciendo que el ensayo de menos adecuados para las células no esféricas. Este ensayo es rápido, teniendo aproximadamente 4 min por muestra, en comparación con los ensayos de proliferación, que requieren un par de horas. La recolección de datos es también bastante sencilla utilizando el software incluido con el dispositivo. El software puede exportar los datos de medición a un spreadsheet para el análisis. Finalmente, es una sola célula, en lugar de una población, la medición; tanto la blastogénesis y la proliferación se miden; y distingue entre las células viables y muertas al mismo tiempo. Se puede utilizar para evaluar varias cepas de ratón por su capacidad para montar una respuesta inmune. El ensayo también puede ser utilizado con éxito para la medición de la blastogénesis en las células T de donantes humanos (Figura 4), y también puede ser utilizado en otros tipos de células. Aumenta el volumen celular se sabe que contribuyen a la regulación del metabolismo: hinchazón celular estimula la síntesis de glucógeno inducida por la glutamina y la lipogénesis en los hepatocitos 36,37. Los neutrófilos muestran migración asociada a aumentos de volumen de 35-60%, mientras que los agentes quimiotácticos inducen inflamación 10-15% 38-40. El ensayo actual potencialmente se puede utilizar para estudiar estos procesos.

Los linfocitos T son las células primarias responsables de la inmunidad adaptativa en los mamíferos. Se sabe que responden a los péptidos antigénicos específicos presentados por moléculas MHC en la superficie de células presentadoras de antígeno. Tras la activación de un receptor de células T cognado (TCR), la célula aumenta de tamaño en un proceso denominado transformación blastogénica, o blastogénesis. Este proceso es detectable en la primera ~ 6 hr después del estímulo se aplica 1. Durante blastogénesis, los volúmenes de las células T individuales incremento de 2 a 4 veces 2-6. Los linfocitos comienzan a proliferar en un proceso llamado expansión clonal, el propósito de los cuales es el de generar el mayor número de clones de las células específicas de antígeno TCR que devengan como sea posible. Las células de la progenie a continuación, ejercen su función inmunológica por diferenciarse en citotóxicos (CD8 +) o helper (CD4 +) linfocitos T efectores. Por lo tanto, los linfocitos T vírgenes en la sangre humana o de ratón están en la fase G 0 (en reposo) de la célulaciclo y apoyo a la actividad metabólica mínima. Tras la exposición a antígenos o mitógenos, las células T vuelven a entrar en el ciclo celular, con una estimulación concomitante de la síntesis de la transcripción y de la proteína 7-10. Mitógenos, tales como forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) e ionomicina estimular los linfocitos a través de la activación de la proteína quinasa C (PKC) y Ca 2+ vías de señalización dependiente 1. La activación de las células T con PMA / ionomicina no pasa por los pasos de señalización de TCR. En la proliferación de ensayos in vitro son ampliamente utilizados para el propósito de evaluar la función de linfocitos y la respuesta a los estímulos. lecturas de proliferación se toman típicamente de uno a tres días después del comienzo de la estimulación de células T y reflejan el estado colectivo de cientos o miles de células. La potencia de varios mitógenos y fármacos inmunomoduladores in vitro puede ser evaluada por la simple medición de las tasas de proliferación en presencia de estos compuestos. Algunos de éstos unassays y sus limitaciones se discuten a continuación. Para el recuento del número de células directa, el procedimiento es mucho tiempo, con una alta probabilidad de errores de manejo. Para la síntesis de ADN, el ensayo de incorporación de 3H-timidina mide la síntesis de ADN, pero su principal limitación es su radiotoxicidad. Una alternativa no radiactiva es BrdU, pero el rango de respuesta lineal para el crecimiento celular es limitada, y no se requiere tratamiento de anticuerpos, lo que aumenta el número de pasos en el procedimiento 11,12. Para la actividad metabólica, las sales de tetrazolio (MTT, MTS, XTT, y WST-1) y resazurina ensayos colorimétricos basadas en colorantes informan del estado metabólico general de la división de las poblaciones de células. Sin embargo, MTT no es soluble en el medio de cultivo, lo que requiere pasos adicionales de lavado, incorporando así los errores en la medición; XTT necesita componentes adicionales para reducir de manera eficiente; MTS-, WST-1-, y mediciones basadas en resazurina son afectaed por el medio de cultivo y su pH componentes del suero, albúmina o rojo de fenol 13-16. Estos ensayos no miden el número real de células viables sino más bien estiman las actividades enzimáticas combinadas. Por lo tanto, la tasa de proliferación no puede determinarse con precisión mediante ensayos metabólicos debido a la correlación no lineal entre el número de células y la reducción de colorante 12,17. Para medir la concentración de ATP, de las células T aumenta la activación inducida en ATP se correlacionan con la proliferación. Sin embargo, la elevación de ATP intracelular es uno de los pasos iniciales de la activación de células T; muchos pasos atrás es la proliferación actual 17,18. Para el ensayo de dilución de colorante, colorante fluorescente CFSE tiñe las células mediante la unión covalente a las proteínas intracelulares. El colorante muestra una disminución dependiente de la proliferación en la intensidad de fluorescencia, que puede realizar el seguimiento del número de divisiones celulares. Sin embargo, debido etiquetado proteína covalente, las funciones de estoslas proteínas pueden ser comprometidas. El colorante es tóxico para las células en concentraciones más altas. En concentraciones de colorante más bajas, sin embargo, la intensidad inicial de la fluorescencia se reduce, disminuyendo el número de divisiones celulares que pueden ser seguidos. Además, después de marcar con CFSE, hay una proliferación independiente de ~ 50% de pérdida de la fluorescencia inicial durante el primer período de 24 a 48 hr, lo que limita el rango dinámico de este ensayo 19,20. La mayoría de estos ensayos reflejan el estado colectivo de grandes números de células y requieren el tratamiento de las células con tintes fluorescentes. Las células necróticas y apoptóticas también podrían contribuir a estas medidas, a menos que se eliminan del análisis por tinción con productos químicos o anticuerpos. Blastogénesis de linfocitos puede ser evaluada por una variedad de métodos, tales como la microscopía óptica o citometría de flujo 4,21,22. A continuación, describimos un método rápido para la medición de tamaños de células T usando unan automatizado contador de células, que recoge imágenes de células en tiempo real que se almacenan y se pueden volver a analizarse en un momento posterior. Además de las mediciones de tamaño, este dispositivo proporciona el número de células precisas y el porcentaje de células viables, como se determina por exclusión de tripan mancha azul. El dispositivo utilizado en este protocolo está disponible comercialmente, y el fabricante a prueba la precisión del instrumento usando tres instrumentos diferentes y varios controles de concentración y viabilidad. Los resultados de estos estudios demostraron un coeficiente de varianza que era generalmente inferior a 6%. Como se ha indicado en el protocolo, el dispositivo se calibra de forma regular con 6 micras y 8 micras perlas de poliestireno de diámetro. Las ventajas de utilizar un contador de células para diferenciar entre las células T en reposo y linfoblastos T a base de diámetro de la celda es la facilidad de uso y la naturaleza automatizada del análisis. El software es capaz de dibujar un círculo alrededor de cada célula y calcular el diámetro de la célula. Además, el imlas edades son visibles para el operador, que puede verificar la exactitud del instrumento en la identificación de las células y correcta de dibujar un círculo alrededor de ellos. En términos de limitaciones, el instrumento no es per se puede diferenciar entre los escombros y las células; por lo tanto, es importante que el operador ve cada imagen, ya que se está procesando. Hay un potencial para la incorporación de burbujas de aire, lo cual disminuirá el número de campos utilizables para el análisis; sin embargo, esto es raro si no se realiza el mantenimiento de lavado regular. En este estudio, los grupos de linfocitos T esplénicas se estimularon con ionomicina y concentraciones crecientes de PMA para 12 a 48 hr. concentraciones de PMA tan bajas como 2 ng tanto una respuesta blastogénica / ml inducida robusto y proliferación significativa. Las mediciones de los efectos de varios fármacos, como la inmunosupresores ciclosporina A (CsA), FK506 (tacrolimus), y rapamicina (sirolimus), así como bloqueadores de los canales de iones TRAM-34 y FTY720 (fingolimod), en blastogénesis demostró buena concordancia con los efectos descritos sobre la proliferación. La respuesta blastogénica de PBMCs humanos a la estimulación con PMA / ionomicina y murina de células T con anti-CD3 y anti-CD28 perlas recubiertas de anticuerpos magnéticos también se midieron. El ensayo contador de células cuantifica tanto blastogénesis y la tasa de proliferación (densidad celular) al mismo tiempo, pero por separado, a diferencia de los métodos antes mencionados, que se parecen a una combinación de estos efectos. El protocolo presentado proporciona una técnica rápida y robusta para la evaluación de la potencia de los agentes mitogénicos y inmunomoduladores.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BW12-702F</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m coladores de celdas de nylon&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>columnas de fibra de lana de nailon</td><td>Polysciences, Inc.&nbsp;</td><td>21759-1</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 50 ml&nbsp;</td><td>The Lab Depot</td><td>TLD431697</td><td></td></tr><tr><td>placas tratadas con cultivo celular de 6 pocillos</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>placas tratadas con cultivo celular de 96 pocillos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>Ensayo basado en MTS</td></tr><tr><td>Ciclosporina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30024</td><td></td></tr><tr><td>FK506</td><td>Compañía Química de las Islas Caimán</td><td>104987-11-3</td><td></td></tr><tr><td>Rapamicina</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3504</td><td></td></tr><tr><td>TRAM-34</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6700</td><td></td></tr><tr><td>FTY720</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0700</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Ratón T-Activador CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>11456D</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)&nbsp;</td><td>Acros Organics&nbsp;</td><td></td><td></td>356150010</tr><tr><td>Ionomicina sal de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>MP Biomedicals&nbsp;</td><td>ICN1670049</td><td>100x stock</td></tr><tr><td>Dulbecco' solución salina tamponada con fosfato (DPBS)&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30378.02</td><td>10x culata</td></tr><tr><td>1,4-ditiotreitol (DTT)&nbsp;</td><td>Research Products International</td><td>12/3/3483</td><td>agente reductor</td></tr><tr><td>8 &micro; m Estándar de tamaño de partícula micro &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84192-5ML-F</td><td>Actual&nbsp; 8.02 y micro; m</td></tr><tr><td>6 y micro; m Estándar de tamaño de partícula micro &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89756-5ML-F</td><td>Actual 6.084 &micro; m</td></tr><tr><td>Soporte de separación magnética simple para tubo de 1,5 - 2 ml</td><td>V& P Científico, Inc.</td><td></td><td></td>VP772F5</tr><tr><td>Incubadora de cultivos</td><td>celulares Forma Scientific&nbsp;</td><td>Lector híbrido 3110</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1&nbsp;</td><td>Analizador</td> de viabilidad celular Bio Tek <td>BTH1M</td><td></td></tr><tr><td>Vi-CELL&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>731050</td><td></td></tr></tbody></table>

la cuantificación rápida de blastogénesis inducida por mitógeno de linfocitos t para identificar fármacos inmunomoduladores

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

La proliferación de linfocitos en respuesta a la estimulación antigénica o mitogénica es un fenómeno difícil de cuantificar útil para inmunomodulador prueba (es decir, inmunosupresor o inmunoestimulante) compuestos químicos y biológicos. Uno de los primeros pasos durante la mitogénesis es el agrandamiento celular o transformación blastogénica, después de lo cual el volumen de células se incrementa antes de la división. Por lo general es detectable en las primeras horas de la estimulación de linfocitos T. A continuación, describimos un método rápido para cuantificar la blastogénesis de los linfocitos T aisladas a partir de bazos de ratón y células mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs) utilizando un contador de células automatizado. Varios ensayos de proliferación utilizados comúnmente en su mayor parte son laboriosos y sólo reflejan el efecto de la población general en lugar de los efectos celulares individuales dentro de una población. En contraste, el ensayo contador de células automatizado presentado proporciona mediciones rápidas, directas y precisas de diámetros de células que pueden serutilizado para evaluar la eficacia de diversos mitógenos y fármacos inmunomoduladores in vitro.

Se utilizó este ensayo para comparar la formación de linfocitos explosión durante la estimulación con PMA, un éster de forbol y ionomicina, un ionóforo de calcio. La figura 1A muestra la distribución de frecuencias de diámetros de reposo y las células del bazo T activadas farmacológicamente. El tratamiento de las células con PMA / ionomicina durante ~ 2 días dio lugar a un cambio significativo en la mediana de la distribución hacia diámetros más grandes (véase, por ejemplo de referencia 4). El número de células con diámetros más pequeños se redujo en consecuencia. Con el fin de asegurarse de que nuestro dispositivo informó de los diámetros correctos, hemos realizado dos calibraciones con perlas de poliestireno de 6 micras y 8 micras de diámetro (véase la Tabla de Materiales). Las figuras 1B y 1C muestran las lecturas de las células T activadas superpuestas con un 8 micras células T en reposo estándar y superpuestas con un estándar de 6 micras. Figura1D muestra los tamaños de control de talón reportados por el fabricante representan frente a los diámetros medios medidos con nuestro contador de células automatizado. Parecía que el tamaño 6 micras fue ligeramente sobreestimada en nuestras mediciones, probablemente debido al umbral de medida del instrumento que tiene un límite inferior de 5 micras. Sin embargo, la desviación estándar de los diámetros del grano calculados a partir de las mediciones de contador de células estaba de acuerdo con la desviación estándar reportado por el fabricante. Llegamos a la conclusión de estos experimentos que este dispositivo se puede utilizar de forma fiable para comparar reposo y tamaños de células T de ratón estimuladas por mitógenos y que el dispositivo puede medir con precisión los diámetros celulares reales. a continuación, se procedió a probar la dependencia de la media de aumento de diámetro de la concentración de PMA y encontramos que, a una concentración fija de 250 nM ionomicina, el efecto de PMA no se ha modificado de manera significativa mediante la elevación de su concentración from 2 a 250 ng / ml (Figura 2A). Usando el ensayo basado en MTS, se midió la proliferación de células T en 50 y 250 ng PMA / ml y no se encontraron diferencias apreciables (Figura 2C), de acuerdo con nuestros datos del diámetro de la célula. El fármacos inhibidores de la calcineurina ciclosporina A (300 nM) y FK506 (1 nM) suprimió tanto blastogénesis (Figura 2B) y la proliferación (Figura 2C). La inhibición no fue completa en ambos casos, sin embargo. Las mediciones realizadas después de 12 hr PMA / ionomicina Además mostró un aumento de 7,2% y 6,8% en el diámetro de 50 ng / ml y 250 ng / ml de PMA, respectivamente (Figura 2D). Tamaño aumenta a estas dos concentraciones no fueron significativamente diferentes, como fue el caso para 48 estimulación hr (comparar con la Figura 2A). Los datos del diámetro de las células recogidas de reclinación y células T activadas después de 48 h de estimulación PMA / ionomicina se resumen en <strong&gt; Tabla 1. La zona media de la superficie y el volumen de células T en reposo del bazo de ratones ICR fueron 151,4 m 2 y 1,9 x 10 -4 nl, respectivamente. La zona media de la superficie y el volumen de las células T activadas eran 300,6 m 2 y 5,9 x 10 -4 nl, respectivamente. El aumento del diámetro promedio general para todas las células activadas fue 40,92% (Tabla 1). También hemos probado otros compuestos químicos reportados para ser inmunosupresores: CsA, FK506, rapamicina, FTY720, y TRAM-34. En la Figura 3, las mediciones de tamaño de celda obtenidos en reposo y células T activadas en ausencia y se muestran presencia de estos fármacos. CsA y FK506, que tienen como objetivo el factor nuclear calcineurina dependiente de células T activadas (NFAT) 27,28, eran los más potentes, la inhibición de la respuesta blastogénica en casi un 72% (Figura 3A y 3B). Curiosamente, conaumento de las concentraciones de PMA, la potencia de CsA y FK506 reducido ligeramente, a pesar de que no hubo ningún aumento adicional diámetro celular en ausencia de estos medicamentos (Figura 2A y 2B). La rapamicina, un inmunosupresor que inhibe la diana de mamífero de la rapamicina (mTOR) 29,30, tuvo un efecto moderado, pero estadísticamente significativo (Figura 3A, 3B y 3C). FTY720 es una esfingosina agonista del receptor de 1-fosfato que inhibe la salida de linfocitos en circulación 31 y se ha descubierto recientemente para inhibir TRPM7, un canal catiónico altamente expresado en los linfocitos T 32. Tanto FTY720 y rapamicina tuvieron un efecto comparable sobre la blastogénesis, reduciéndolo de la media de un incremento de 52% en el diámetro a aproximadamente 34% (Figura 3A y 3B). TRAM-34 es un bloqueador del canal de potasio activado por calcio KCa3.1 33. Probado a 700 nm, TRAM-34 era ineficaz en las células T murinas, in acuerdo con un estudio reciente proliferación de células T humana; su potencia puede depender de la naturaleza y la fuerza de la estimulación mitogénica 34 (Figura 3A y 3B). 700 nM TRAM-34 fue eficaz en el bloqueo de canales KCa3.1 en nuestros experimentos de electrofisiología de pinzamiento zonal (datos no mostrados). Esta comparación se hizo entre en reposo y las células expuestas a los fármacos en múltiples ensayos en el mismo experimento en 48 hr. Cuando la rapamicina y la CsA se utilizaron juntos, blastogénesis se inhibió completamente (Figura 3C). La activación de las células T murinas con perlas magnéticas anti-CD28-revestido anti-CD3 / 72 hr para producir un aumento del 27% en el diámetro medio, que se redujo a 5% en presencia de CsA (Figura 3D). células mononucleares humanas sobre PMA activación / ionomicina durante 48 h aumentó el diámetro por 33%, y la activación en presencia de CsA disminuyó la respuesta al 23% ( <strong&gt; Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55212/55212fig1.jpg" /> Figura 1: Distribución de frecuencias de diámetros de células T esplénicas murinas. (A) Columnas negras indican reposo y columnas rojas indican las células activadas PMA / ionomicina (48 hr). (B) Las distribuciones de las células T esplénicas activadas superpuestas en un estándar de calibración del tamaño de partícula de 8 micras. (C) Distribución de células T en reposo superpuestas en un estándar de calibración de 6 micras. El número de células y los granos utilizados se indican en cajas. (D) La mediana de diámetro medido por el contador de células traza contra el diámetro del grano informado por el fabricante. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55212/55212fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> dentro-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55212/55212fig2.jpg" /> Figura 2: Dependencia de murino activación de las células T de la concentración de PMA. (A) diámetros medios de las células T sin tratar o tratados con 2, 50, y 250 ng / ml de PMA a una concentración fija ionomicina (250 nM). Mediciones (B) contador de células de reposo y (2, 50, 250 ng / ml de PMA) de las células T activadas en ausencia y presencia de CsA 300 nM o 1 nM de FK506. (C) ensayo de proliferación MTS en 50 y 250 ng / ml de PMA con 250 ionomicina nM en ausencia y en presencia de 300 nM CsA. diferencias significativas (p &lt;0,001) se indican con asteriscos. n es el número total de ensayos. Los datos proceden de las células aisladas a partir de 3 ratones. (D) diámetros celulares de reposo y células T activadas (250 ng / ml de PMA y 250 nM ionomicina) 12 hr después de la activación en ausencia y en presencia de 300 nM CsA.<html> pload / 55212 / 55212fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55212/55212fig3.jpg" /> Figura 3: Efectos de la CsA, FK506, FTY720, rapamicina, y TRAM-34 en el tamaño de la celda. (A y C) diámetros medios de reposo y células T activadas murino ionomicina por PMA / en ausencia y en presencia de las drogas. Las concentraciones se muestran en el cuadro. (B) Los datos de un expresa como el porcentaje de incremento sobre el diámetro de las células T en reposo. la activación de linfocitos se realizó con 250 ng / ml de PMA y 250 nM ionomicina, y se tomaron las mediciones después de 48 hr. (D) Mediciones de contador de células de reposo y anti-CD3 / CD28 células T activadas, 72 hr después de la activación en ausencia y en presencia de 300 nM CsA.rge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55212/55212fig4.jpg" /> Figura 4: Blastogénesis en PBMCs humanos tras la estimulación por mitógenos. (A) Columnas negras indican reposo y columnas rojas indican las PBMC activadas. (B) diámetros medios de reposo y PBMCs activadas en ausencia y en presencia de 300 nM de CsA. Las células se activaron con 250 ng / ml de PMA y 250 nM ionomicina, y se tomaron las mediciones después de 48 h de activación. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55212/55212fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> column1 </td><td> de descanso </td><td> Activado </td><td> CsA 100 nM </td><td> CsA 200 nM </td></tr><tr><td> diámetro medio </td><td> 6,94 micras </td><td> 9,78 micras </td><td> 8.19 micras </td><td> 7,92 micras </td></tr><tr><td> Aumento medio en diámetro </td><td></td><td> 40.92% </td><td> 17.88% </td><td> 14.09% </td></tr><tr><td> Superficie media </td><td> 151.37 μm² </td><td> 300.61 μm² </td><td> 210.56 μm² </td><td> 197.22 μm² </td></tr><tr><td> Aumento medio en Superficie </td><td></td><td> 98,59% </td><td> 39.00% </td><td> 30.16% </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Resumen del diámetro de celda promedio y aumentos relativos de área de superficie. Las mediciones se realizaron 48 horas después de la activación con 250 ng / ml de PMA y ionomicina 250 nM.

La mitogénesis de los linfocitos T se acompaña de una transformación blastogénica, tras lo cual el volumen celular aumenta antes de la división celular. Aquí, describimos un método para cuantificar la blastogénesis en linfocitos T utilizando un contador celular automatizado con la capacidad de medir diámetros celulares.

La cuantificación rápida de Blastogénesis inducida por mitógeno de linfocitos T para identificar fármacos inmunomoduladores

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la potencia de fármacos inmunomoduladores mediante un contador celular automatizado, midiendo la blastogénesis o transformación en blastos de linfocitos T. Este ensayo proporciona un método rápido para cuantificar la activación de linfocitos T utilizando un contador celular automatizado que puede medir los diámetros celulares. La principal ventaja de esta técnica es que permite una medición rápida, sencilla y directa a partir de células individuales, a diferencia de los ensayos comunes de proliferación de linfocitos T.El tratamiento de los linfocitos con fármacos inmunomoduladores aumentará o disminuirá la tasa y el grado de blastogénesis celular. Mediante el ensayo de conteo celular, se puede medir el grado de esta blastogénesis en aproximadamente cuatro minutos por muestra. Dentro de los diez minutos posteriores al sacrificio, rocíe el abdomen del ratón con etanol al 70 por ciento y use tijeras para realizar una incisión en el pelaje y la piel del lado izquierdo del animal.Sujete la piel separada y hacia atrás para exponer el peritoneo. A continuación, aplique clorhexidina al cuatro por ciento en el sitio de la incisión. Utilizando un segundo juego de tijeras y pinzas, realice un corte de dos a tres centímetros a lo largo del abdomen central para abrir el peritoneo.A continuación, retire los ligamentos viscerales y la grasa excesiva que rodean el bazo y transfiera el tejido a un recipiente con DPBS. Luego, agregue diez mililitros de medio RPMI 1640 completo a una placa de cultivo de diez centímetros y triture los bazos entre dos portaobjetos de vidrio esmerilado esterilizados. Filtre la suspensión tisular a través de un filtro estéril de nylon de 40 micrones hacia una nueva placa de cultivo de diez centímetros para eliminar los tejidos conectivos y los restos celulares, y transfiera la suspensión de células individuales a un tubo cónico de 50 mililitros para la centrifugación.ReSuspender el sedimento en 20 mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos. Después de diez minutos a temperatura ambiente con agitación suave, recoger las células mediante otra centrifugación y resuspender el sedimento en diez mililitros de medio fresco. Luego, centrifugar las células nuevamente para resuspenderlas en dos mililitros de medio completo a 37 grados Celsius.Para purificar las células T, lave primero una o dos columnas de lana de nailon por bazo dos veces con cinco mililitros de RPMI completo e introduzca las columnas en un incubador de cultivo celular a 37 grados Celsius y cinco por ciento de dióxido de carbono durante una hora. Al final de la incubación, cargue dos mililitros de la suspensión de esplenocitos aislados en la parte superior de cada columna y permita que las células pasen a través de la columna hasta que el líquido alcance la parte superior de la lana. A continuación, agregue dos mililitros de medio completo fresco a 37 grados Celsius en la parte superior de las columnas y permita que el medio pase a través de la lana de nailon hasta que el líquido en la parte superior de la columna alcance la parte superior de la lana.Ahora cubra la lana con tres mililitros de medio completo a 37 grados Celsius y devuelva la columna al incubador de cultivo celular para permitir que las células B, los fibroblastos y las células accesorias se adhieran a las fibras de lana. Después de una hora, en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros, lave la columna dos veces con cinco mililitros de medio completo fresco para eluir las células T no adherentes. Luego recoja las células mediante centrifugación.Después de lavar los linfocitos T una vez con diez mililitros de medio completo, resuspenda el sedimento en dos mililitros de medio completo fresco. Luego cuente las células y diluya la suspensión hasta una concentración de 0,5 × 10⁶ células por mililitro en medio completo fresco, para sembrarlas en una placa de cultivo celular de seis o 24 pocillos según lo requiera el experimento. Dentro de las 24 horas posteriores a su aislamiento, active los linfocitos T aislados mediante columna de lana de nailon con el estímulo adecuado y el fármaco experimental de interés.Después de 12 a 72 horas, utilice una pipeta de un mililitro para mezclar suavemente las células tratadas activadas y eliminar cualquier agregado. Para medir los diámetros celulares mediante un contador celular automatizado, transfiera un mililitro de las células tratadas de cada pocillo a vasos de muestra individuales y coloque los vasos de muestra en el carrusel de muestras del contador celular automatizado. Ingrese el ID de la muestra y la información del tipo celular para registrar las muestras e iniciar el análisis de las mismas.Después de mezclar el azul de tripano con la suspensión celular, las células pasan por un campo de imagen hasta que se recopilan aproximadamente 100 imágenes celulares de cada muestra. El software dibuja un círculo alrededor de cada célula detectada, teñida y no teñida con azul de tripano, para determinar el diámetro celular. Cuando se han medido todas las células, los datos se exportan a una hoja de cálculo que muestra los resultados como recuentos totales y viables de células para cada diámetro medido.Los datos pueden presentarse entonces como histogramas. Después de dos días de estimulación con PMA e ionomicina, se observa un desplazamiento significativo de la mediana de la distribución de frecuencias hacia diámetros celulares mayores, con una reducción correspondiente en el número de linfocitos T con diámetros menores. A una concentración fija de ionomicina de 250 nanomolar, el efecto del PMA no cambia significativamente al aumentar la concentración del estímulo de activación de dos a 250 nanogramos por mililitro.Tampoco existe una diferencia apreciable en la proliferación de linfocitos T observada. Los fármacos inhibidores de la calcineurina suprimen parcialmente tanto la blastogénesis como la proliferación de linfocitos T. El tratamiento de linfocitos T con compuestos inmunosupresores que tienen como diana al factor nuclear de linfocitos T activados dependiente de calcineurina inhibe la respuesta blastogénica en casi un 72 por ciento.La rapamicina y el FTY720 exhiben efectos moderados pero estadísticamente significativos sobre la blastogénesis. Aunque el TRAM34 aparentemente no afecta la proliferación de linfocitos T murinos, incluso a concentraciones de 700 nanomolares. Cuando se usan juntas la rapamicina y la ciclosporina A, la blastogénesis se inhibe completamente.Se observan resultados similares con linfocitos T de ratón activados con microesferas magnéticas conjugadas con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28. Este ensayo puede utilizarse para cuantificar con éxito los efectos de diversos fármacos inmunomoduladores, proporcionando una evaluación más precisa de la potencia del fármaco en comparación con los ensayos de proliferación típicos, que también incluyen contribuciones de células apoptóticas y necróticas. Con este método, se pueden medir hasta 15 muestras simultánea y sucesivamente, permitiendo la cuantificación simultánea y posterior de las tasas de blastogénesis y proliferación.Ocasionalmente, pueden introducirse burbujas de aire en la celda de flujo, lo que hace que la medición sea inutilizable; por lo tanto, todas las imágenes deben examinarse en busca de burbujas de aire antes de aceptar los datos de cada ensayo para su análisis. Una limitación de este procedimiento es que, si hay demasiados residuos en la muestra, la medición podría interpretar los residuos como células viables. Con modificaciones adecuadas, este ensayo tiene el potencial de adaptarse para estudiar el cambio en el tamaño celular en neutrófilos y hepatocitos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este vídeo muestra el cribado de compuestos inmunomoduladores mediante un ensayo basado en fluorescencia. Los linfocitos T transgénicos derivados de ratones con casetes de expresión de proteínas fluorescentes verdes se tratan con estos compuestos. Las señales de GFP aumentadas y reducidas permiten identificar los efectos estimulantes e inhibidores de los compuestos, respectivamente.

Ensayo basado en fluorescencia que utiliza linfocitos modificados genéticamente para el cribado de compuestos inmunomoduladores

El video muestra un método inmunológico para monitorear in vivo la producción de linfocitos T citotóxicos o CTL inducidos por adyuvantes. A un ratón se le inyectan previamente linfocitos T CD8+ de donantes modificados genéticamente, teñidos con colorante proliferativo. La inyección subcutánea de ovoalbúmina con adyuvantes genera linfocitos T CD8+ citotóxicos que se identifican después de la cosecha mediante inmunotinción y citometría de flujo.

Una técnica inmunológica para monitorizar la generación de linfocitos T citotóxicos mediados por adyuvantes

Novel generaciones de ensayos funcionales tales como el interferón gamma (IFN-γ) ELISPOT, que detectan la producción de citoquinas en el nivel de células individuales y proporcionar tanto la caracterización cuantitativa y cualitativa de las respuestas de células T pueden ser usados ​​para evaluar las respuestas inmunes mediadas por células dirigidas contra la varicela zoster (VZV).

Desarrollo de un Varicela-Zoster inmunidad mediada por células específicas del virus de IFN-γ ELISPOT ensayo para evaluar la raíz del cordón umbilical de Trasplante de Sangre

Los linfocitos son los principales actores en las respuestas inmunitarias adaptativas. En este trabajo se presenta un protocolo de purificación de linfocitos para determinar las funciones fisiológicas de las moléculas deseadas en la activación de linfocitos in vitro e in vivo. Los procedimientos experimentales descritos son adecuados para comparar las capacidades funcionales entre linfocitos control y modificados genéticamente.

Aislamiento y activación de los linfocitos murinos

Presentamos en el estudio actual un ensayo basado en fluorescencia novela usando linfocitos derivados de un ratón transgénico. Este ensayo es adecuado para la selección de alto rendimiento (HTS) de moléculas pequeñas dotados de la capacidad de cualquiera de inhibición o promoción de la activación de linfocitos.

Una de linfocitos ensayo basado en la fluorescencia adecuado para el cribado de alto rendimiento de pequeñas moléculas

Aquí presentamos una aplicación de una técnica inmunológica estándar (CFSE manchado OT-I proliferación) pretende monitorear rápidamente mediada por el adyuvante de linfocitos T citotóxicos (CTL) generación en vivo. Esta estimación rápida de la capacidad CTL es útil para el desarrollo de vacunas profilácticas contra patógenos intracelulares así como vacunas contra el cáncer terapéutico.

Rápida In Vivo evaluación de las capacidades de generación de linfocitos T citotóxicos de coadyuvante para el desarrollo de una vacuna

Aquí, presentamos un protocolo para la determinación de en vivo de la activación de las células (células T) CD4 T ingenua, proliferación y diferenciación de Th1 inducida por el GM-CSF de la médula (BM)-derivado de las células dendríticas (DCs). Además, este protocolo describe aislamiento del BM y del T-cell, la generación de C.C. y transferencia adoptiva de DC y del T-cell.

Un modelo de ratón In Vivo a medida ingenuo CD4 células T activación, proliferación y diferenciación de Th1 inducida por las células dendríticas derivadas de la médula ósea

Aquí, describimos protocolos de validación genética y química de c-Fos y Dusp1 como una diana farmacológica en leucemia usando modelos de ratón humanizado y genética in vitro e in vivo. Este método puede ser aplicado a cualquier objetivo de validación genética y desarrollo terapéutico.

Métodos para evaluar el papel de c-Fos y Dusp1 en dependencia del oncogén

Aquí se presenta un protocolo para medir las células CD4+ T proliferantes en respuesta a proteínas antigénicas o péptidos mediante dilución de tinte. Este ensayo es particularmente sensible a las células T específicas del antígeno poco frecuente y se puede modificar para facilitar la clonación de células específicas del antígeno.

Cuantificación de células CD4+ T específicas de antígenos humanos que utilizan éster de succinidilo de carboxifluoresceína

La bioenergética de las células T CD8 se puede interrogar mediante la prueba de esfuerzo de Mito. Esta metodología se puede utilizar para estudiar la programación metabólica aguda y crónica. Este protocolo describe enfoques para examinar las relaciones entre la biología de los receptores de células T y el análisis bioenergético.

Medición de la función mitocondrial de los linfocitos T CD8 vírgenes y efectores

Describimos un procedimiento para evaluar la capacidad de los agentes farmacológicos para generar células dendríticas tolerogénicas a partir de células dendríticas derivadas de monocitos naïve in vitro y validar su potencia mediante la generación de células T reguladoras autólogas.

Un método simple y eficiente para probar agentes inmunomoduladores para la generación de células dendríticas tolerogénicas a partir de monocitos CD14+ humanos

Aprende a cuantificar la blastogénesis de linfocitos T mediante un contador celular automatizado para evaluar fármacos inmunomoduladores. Este método rápido mide diámetros celulares directamente en muestras individuales.

La cuantificación rápida de Blastogénesis inducida por mitógeno de linfocitos T para identificar fármacos inmunomoduladores

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