Ensayo basado en fluorescencia que utiliza linfocitos modificados genéticamente para el cribado de compuestos inmunomoduladores

Comience con una placa de múltiples pocillos compatible con fluorescencia que contenga una suspensión de linfocitos T transgénicos derivados de ratón.

Estos linfocitos contienen una proteína fluorescente verde o casete de expresión de GFP, controlada por el receptor de células T o la participación de TCR con compuestos inmunomoduladores.

Tratar cada pocillo con una solución que contenga compuestos inmunomoduladores con diferentes potenciales.

Durante la incubación, los compuestos inmunomoduladores interactúan con los TCR en los linfocitos T.

La interacción de TCR con un compuesto estimulante desencadena la activación del casete de genes, elevando la expresión de GFP.

Por el contrario, la interacción de TCR con un compuesto inhibidor inhibe el casete de genes y reduce la expresión de GFP.

A continuación, superponga las células con un tinte fluorescente de ácido nucleico para teñir los núcleos.

Centrifugue la placa para asentar las celdas para una medición precisa de la fluorescencia.

Bajo un microscopio de fluorescencia, los linfocitos T viables exhiben dos señales de fluorescencia correspondientes a núcleos celulares y proteínas fluorescentes verdes.

La fluorescencia verde intensificada significa una estimulación exitosa de los linfocitos T, mientras que una débil señal de fluorescencia verde intracelular confirma el efecto inhibidor de los compuestos inmunomoduladores sobre los linfocitos T.

Para el cribado de moléculas pequeñas de alto rendimiento, coloque 40 microlitros de células por pocillo en una placa de 384 pocillos y trate los pocillos apropiados con el fármaco o vehículo de su elección durante el período de tratamiento deseado en la incubadora de cultivos celulares.

30 minutos antes del análisis de GFP, tiña las células con la concentración adecuada de solución de Hoechst, distribuyendo completamente la tinción con un pipeteo suave. Cuando todos los pocillos hayan sido teñidos, centrifugue las placas para recolectar las células en el fondo de los pocillos y deje que las células descansen durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Cargue la placa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego, establezca el objetivo en 40X o más. Configure el número de cámara 4 para la lámpara UV y luego configure el número de cámara 1 para el láser 488. Cargue la placa en el sistema de cribado de alto contenido. A continuación, configure el sistema automatizado de detección confocal de alto contenido para leer de 6 a 10 campos por pocillo, con dos lecturas secuenciales por campo a 488 nanómetros y luz ultravioleta.