La creación de dos dimensiones con dibujos sustratos para el confinamiento de proteínas y células

El objetivo general del siguiente experimento es desarrollar un sustrato con patrones bidimensionales para el control de la absorción de proteínas y el crecimiento celular. Esto se logra mediante el uso de fotolitografía para fabricar un patrón maestro, que se utiliza para producir el sello A-P-D-M-S para la impresión por micro contacto. Como segundo paso, se prepara el sustrato de oro estampado, que implica la impresión por microcontacto para producir un patrón con regiones que absorben y resisten la proteína.

A continuación, se añaden proteínas y células al sustrato para visualizar el patrón y estudiarlo. Se obtienen resultados de crecimiento y comportamiento celular que muestran un buen confinamiento proteico y celular en estos sustratos de patrón basados en fluorescencia y microscopía de contraste facial. La principal ventaja de esta técnica sobre otros métodos existentes, como la impresión de proteínas MicroCon, es que la monocapa terminada en glicol resiste la absorción de proteínas y células inespecíficas en el fondo del patrón.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se debe optimizar la técnica de estampado adecuada para cada patrón impreso. Para comenzar la preparación del centro maestro con patrón, la oblea de silicio en el codificador de giro, y durante el paso inicial del programa de giro de dos ciclos, enjuague la oblea con acetona. Durante el segundo paso del programa de centrifugado, la acetona se evaporará dejando una oblea limpia y seca al comienzo del centrifugado, aplicará fotorresistencia a la oblea y luego aplicará una capa de centrifugado utilizando las condiciones descritas anteriormente.

Hornee suavemente la oblea recubierta fotorresistente a 110 grados centígrados durante dos minutos con una placa calefactora de alta uniformidad. Siguiente patrón de foto. La oblea recubierta fotorresistente utiliza un sistema de alineadores de mascarilla y una mascarilla adecuada.

Primero, coloque el sustrato en el camión de vacío del alineador de mascarillas. A continuación, inserte la mascarilla en la bandeja de soporte y encienda la aspiradora para mantener la mascarilla en su lugar y confirmar un buen contacto entre la mascarilla y el sustrato. Levanta el sustrato hasta que se encuentre con la mascarilla.

Utilice la óptica del alineador para confirmar que se ha producido un buen contacto. Por último, encienda la lámpara para exponer el sustrato a la luz ultravioleta a través de la máscara litográfica. Revele la oblea estampada en revelador durante un minuto y 45 segundos con una agitación suave.

Enjuague a fondo con agua desionizada de grado semiconductor y seque con un chorro de nitrógeno gaseoso Desarrollo de patrones de verificación usando un microscopio con un filtro UV. Comience este procedimiento preparando un endurecedor de resina de 10 a uno por peso. Mezcla de cigarro 180 2 completamente.

Cubra la oblea con el patrón fotográfico con la mezcla en una placa de Petri desechable en un desecador al vacío Degas, el maestro cubierto con PDMS hasta que no se vean burbujas. Después de asegurarse de que el maestro esté en el fondo del plato, deje que el sello se cure en un horno a 65 grados centígrados durante 1,5 horas. Cuando el sello PDMS esté curado, corte el sello del maestro y recórtelo al tamaño apropiado.

Guarde la estampilla en un recipiente tapado con la característica hacia arriba para protegerlo del polvo y los desechos. Para preparar los sustratos para la deposición de metal, primero trate los cubreobjetos redondos de vidrio con plasma de oxígeno durante 10 minutos. Luego enjuague los cubreobjetos dos veces con agua desionizada secando con el chorro de gas nitrógeno entre los enjuagues después de enjuagar con agua, enjuague dos veces con etanol nuevamente secando con el chorro de gas nitrógeno entre enjuagues.

Utilizando un sistema de deposición de haz de electrones de bolsillo múltiple, deposite 50 angstroms de titanio seguidos de 150 angstroms de oro. No coloque el evaporador entre la deposición de la capa de titanio y la capa de oro. Enjuague el sello PDMS con etanol y seque bien.

Con gas nitrógeno, aplique la solución de estampado al sello gota a gota hasta que esté completamente cubierto. Seque bien el sello con gas nitrógeno. La impresión por microcontacto de la lima HEXA Decane depende de las características del sello PDMS y es uno de los aspectos más difíciles de este procedimiento.

El estampado exitoso requiere el desarrollo de una buena técnica que aplique una presión uniforme. Durante el estampado. Para la impresión convencional por microcontacto en el aire, presione suavemente el sello sobre el sustrato de oro y deje que se forme la monocapa durante 15 segundos.

Alternativamente, para patrones compuestos por características muy pequeñas y relaciones de aspecto altas, coloque el sustrato de oro en una placa de Petri que contenga 18.2 mega om de agua desionizada, asegurándose de que el sustrato esté sumergido. A continuación, presiona suavemente el sello sobre el sustrato dorado y deja que se forme la capa mono A durante 15 segundos. A continuación, enjuague el sustrato estampado dos veces con etanol secando con gas nitrógeno.

Después de cada enjuague, coloque el sustrato en una placa de Petri y cubra el sustrato con una solución de relleno. Selle el plato con param para evitar la evaporación. Deje que la monocapa de fondo se forme en la oscuridad durante 12 a 14 horas.

Finalmente, retire el cubreobjetos estampado de la solución de relleno posterior y enjuague dos veces con etanol y secado con gas nitrógeno después de cada enjuague. Para aplicar proteínas al cubreobjetos estampado, colóquelo en una pequeña placa de Petri o en una cubierta de cámara de cultivo celular con 500 microlitros por un mililitro de solución salina tamponada con fosfato delcos. El DPBS debe cubrir completamente el sustrato durante la incubación de la proteína.

Para garantizar una cobertura uniforme de proteínas, añada una solución concentrada de proteínas al DPBS y mezcle la solución pipeteando varias veces. Incubar la mezcla de proteínas con el sustrato a 37 grados centígrados durante una hora. Después de la incubación, enjuague bien el sustrato con DPBS para eliminar la proteína no unida, teniendo cuidado de no secar el sustrato ni pasarlo a través de la interfaz aire-agua.

Después de tres enjuagues, aspire el DPBS. A continuación, añada aproximadamente 500 microlitros de medios de crecimiento celular completos para mantener un sustrato húmedo. Reemplace el medio de crecimiento utilizado para enjuagar el sustrato.

Con medios frescos, el sustrato ahora está listo para el recubrimiento con celdas. Por lo general, se colocan de 30 a 200 celdas por milímetro cuadrado en el sustrato. Esta imagen muestra el sello A-P-D-M-S visualizado bajo un microscopio colocando la característica del sello con el lado hacia abajo en un deslizamiento de cubierta de vidrio, la barra de escala es de 100 micrómetros.

El estampado adecuado da como resultado un patrón de proteína nítido y claro que se puede visualizar mediante la aplicación de una proteína marcada con fluorescencia, como la fibronectina marcada con LOR 6 47. Aquí se muestra el confinamiento de las células chk one al patrón de proteínas. Las barras de escala son de 100 micrómetros en estas imágenes.

Alternativamente, se puede utilizar la inmunohistoquímica para visualizar el patrón de la proteína después de la fijación de SU. Aquí, se utiliza el anticuerpo antilaminado conjugado LOR three 50 para visualizar un laminado con patrón sembrado con neuronas del hipocampo de ratón E 18 que se muestran a los cuatro días in vitro Las neuronas del hipocampo de ratón E 18 teñidas con MIT tracker red five 80 muestran que el crecimiento celular está bien confinado al patrón de proteínas. Si bien esta técnica es fácil de dominar, pueden surgir varios problemas comunes, como lo ilustran estas preparaciones de sustrato patrón visualizadas por la absorción de fibronectina conjugada LOR 6 47.

La aplicación de proteínas sin una mezcla suficiente de la solución de proteínas concentrada en el DPBS puede dar lugar a patrones de proteínas desiguales. Un estampado incorrecto puede provocar una transferencia parcial del patrón o el colapso del sello. Además, la exposición al aire del sustrato patrón que contiene la proteína absorbida puede alterar la monocapa y provocar una disminución de la resistencia.

En segundo plano, el patronaje sumergido puede producir patrones con pequeñas características que son difíciles de imprimir mediante la impresión convencional por microcontacto y aire. Estas dos imágenes muestran diferentes regiones del mismo patrón impreso con el mismo sello PDMS en aire o agua desionizada, las líneas de soporte se muestran en la imagen de la izquierda para demostrar que solo las pequeñas características del patrón no se han podido imprimir correctamente. Las barras de escala son de 20 micrómetros Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 18 a 24 horas si se realiza correctamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar un sustrato de patrón. Producir sello A-P-D-M-S. Utilice la impresión por microcontacto para preparar un sustrato de oro de patrón y visualice este patrón utilizando proteínas y células.