Muestra mejorada Multiplexing de tejidos usando combinada Precursor isotópico etiquetado y isobárico Tagging (cPILOT)

El objetivo general de este método multiplexado mejorado es aumentar el número de muestras de proteínas que se pueden analizar simultáneamente y, al mismo tiempo, disminuir el error de muestra y el tiempo del instrumento. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos del envejecimiento, las enfermedades neurodegenerativas, otras enfermedades relacionadas con la edad y el cáncer que están relacionadas con la patogénesis, la progresión, el diagnóstico, el pronóstico y los objetivos terapéuticos. La principal ventaja de esta técnica es que se puede generar una instantánea completa de los cambios en las proteínas en muchas condiciones.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la enfermedad de Alzheimer en un modelo de ratón, también se puede aplicar a muestras de tejido de pacientes con Alzheimer o una variedad de otros trastornos. Por lo general, las personas nuevas en este método lo encontrarán desafiante porque hay varias muestras para manejar simultáneamente en un corto período de tiempo. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos dimos cuenta de que la acetilación podía combinarse con el marcaje isorílico para la nitración de proteínas, lo que nos motivó a hacer que la técnica funcionara globalmente para todos los péptidos.

Este estudio analizará tejidos cerebrales, cardíacos y hepáticos de un modelo de ratón con enfermedad de Alzheimer y controles de tipo salvaje. Transfiera de 60 a 90 miligramos de cada muestra de tejido a un tubo de lisado y agregue 500 microlitros de PBS con urea de ocho molares. Homogeneizar las muestras mediante un homogeneizador mecánico.

Retire el homogeneizado de tejido del tubo de lisado y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga. Enjuague el tubo de lisado con 100 a 500 microlitros de PBS con urea de ocho molares y combine la solución de enjuague con el homogeneizado de tejidos. Centrifugar el tejido homogeneizado durante 15 minutos.

Agarre el sobrenadante de cada muestra. Después de realizar el ensayo de BCA para determinar la concentración de proteína, agregue 100 microgramos de proteína de cada muestra a tubos de microcentrífuga marcados individualmente. Agregue ditiotreitol a cada muestra.

E incubar a 37 grados centígrados durante dos horas. Agregue yodoacetamida, IAM, a cada muestra e incube en hielo en la oscuridad durante dos horas. A continuación, añada L-cisteína a cada muestra e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Después de 30 minutos, agregue tampón tris con cloruro de calcio para diluir la urea hasta una concentración final de dos molares. Agregue tripsina tratada con metil cetona L1 tosilimitotofenileticloro a cada muestra. E incubar a 37 grados centígrados durante 24 horas.

Al día siguiente, apague la digestión de proteínas mediante la congelación instantánea de la muestra en nitrógeno líquido y almacene a menos 80 grados centígrados hasta su posterior procesamiento. Antes del etiquetado de la dimetilación, las muestras de péptidos se desallan, como se describe en el protocolo de texto, y se secan por centrifugación al vacío. Para comenzar el procedimiento de etiquetado de dimetilación, reconstituya los péptidos en ácido acético al 1% disuelto en HPLC o agua de grado nanopuro.

Retire una porción de 50 microgramos de cada muestra y colóquela en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Almacene el resto de los péptidos reconstituidos a menos 80 grados centígrados para futuros experimentos. En los pasos que se demostrarán a continuación, es fundamental agregar reactivos rápidamente para que las reacciones químicas facilitadoras tengan lugar durante la misma cantidad de tiempo para todas las muestras.

Agregue ocho microlitros de una solución de formaldehído de 60 milimolares a las muestras para etiquetarlas con dimetilación ligera. Agregue ocho microlitros de una solución de formaldehído marcada con 13 deuterio de carbono 13 milimolar a las muestras para marcarlas con dimetilación pesada. Agregue ocho microlitros de cianoborohidruro de sodio de 24 milimolares a las muestras marcadas con dimetilación ligera.

Agregue ocho mircoliters de cianoborodudérida sódica de 24 milimolares a las muestras marcadas con dimetilación pesada. Agite las muestras en vórtice y luego agite suavemente en un agitador de tubo durante unos 10 minutos a temperatura ambiente. Apague las reacciones agregando 16 microlitros de amoníaco al 1% durante cinco minutos.

Reacidificar las mezclas de reacción añadiendo ocho microlitros de ácido fórmico al 5%. Combine los péptidos dimetilados ligeros y pesados para generar un total de seis muestras. Realice la desalinización de muestras como se describe en el protocolo de texto.

Y secar las muestras por centrifugación al vacío. Para el marcaje isobárico de las muestras dimetiladas, en primer lugar, reconstituir 100 microgramos de péptidos dimetilados y bicarbonato de trietilamonio, o tampón TEAB. A continuación, prepare los reactivos isobáricos de acuerdo con el protocolo del fabricante del kit de marcado isobárico.

Agregue el volumen apropiado, en este caso, 41 microlitros del reactivo de marcado isobárico solubilizado a cada una de las muestras de péptidos, y vórtice durante unos 10 segundos. Agite las muestras en un agitador de tubo de microcentrífuga durante aproximadamente una hora a temperatura ambiente. Para apagar las reacciones, agregue 8 microlitros de hidroxilamina a cada muestra.

E incubar las muestras durante 15 minutos a temperatura ambiente. Agrupe las seis muestras etiquetadas en una sola mezcla y desalar. Prepare los péptidos para la cromatocromía líquida reconstituyendo los péptidos en agua de grado de espectrometría de masas con ácido fórmico al 0,1%.

Agregue péptidos reconstituidos a un tubo de microcentrífuga que contenga un filtro de 0,65 micrómetros. Y centrifugar a 12, 000 veces g durante un minuto. Retire y deseche el filtro.

Transfiera los péptidos filtrados a un vial de muestreador automático. Inyecta seis microlitros de cada muestra de facción de intercambio catiónico fuerte en una columna trampa. Paquete de hasta dos centímetros con material de carbono 18.

Ejecute los métodos de espectrómetro de masas de separación analítica y adquisición de datos. Se realizó un análisis cPilot de 12 complejos de tejidos cerebrales, cardíacos y hepáticos de un modelo de ratón con enfermedad de Alzheimer y controles de tipo salvaje. Los datos de los precursores mostraron péptidos dimetilados ligeros y pesados representados por los picos en m/z 643.854 y 647.875.

Estos péptidos fueron seleccionados, aislados de forma independiente y fragmentados con disociación inducida por colusión para generar estos espectros. Los resultados de la búsqueda indicaron que los picos pertenecían a un péptido de la proteína fosfoglicerato quinasa uno. Estos picos se aislaron aún más para la espectrometría de masas en tándem de disociación colusoria de mayor energía y los iones reporteros se observan como se muestra.

Ambos conjuntos de espectros de espectrometría de masas de triple etapa son necesarios para obtener información sobre las 12 muestras. En este ejemplo, las proporciones de iones de control de la enfermedad de Alzheimer y el tipo salvaje son similares en las dos réplicas biológicas para los tejidos cerebrales, hepáticos y cardíacos. Los valores de cambio de pliegue para cada comparación sugieren que los niveles de fosfogliato quinasa uno en el cerebro y el corazón son más altos en los ratones con enfermedad de Alzheimer, pero más bajos en el hígado.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente cinco horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe tener cuidado con la manipulación de las muestras. Incorporados a este procedimiento, se pueden realizar métodos de separación como el intercambio catiónico fuerte o el fraccionamiento de pH alto para aumentar la profundidad y la cobertura de las dietas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo mejorar la multiplexación de muestras usando C-Pilot.