Muestra mejorada Multiplexing de tejidos usando combinada Precursor isotópico etiquetado y isobárico Tagging (cPILOT)

El objetivo general de este método multiplex mejorado es aumentar el número de muestras de proteínas que pueden analizarse simultáneamente, a la vez que se reduce el error de la muestra y el tiempo del instrumento. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos del envejecimiento, las enfermedades neurodegenerativas, otras enfermedades relacionadas con la edad y el cáncer, que están vinculadas a la patogénesis, progresión, diagnóstico, pronóstico y dianas terapéuticas. La principal ventaja de esta técnica es que puede generarse una instantánea integral de los cambios proteicos en múltiples condiciones.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la enfermedad de Alzheimer en modelos de ratón, también se puede aplicar a muestras de tejido de pacientes con Alzheimer o una variedad de otros trastornos. En general, las personas nuevas en este método lo encontrarán desafiante porque hay varias muestras que deben manejarse simultáneamente en un período de tiempo corto. Tuvimos la idea inicial para este método cuando reconocimos que la acetilación podría combinarse con etiquetado isobárico para la nitroación de proteínas, lo que nos motivó a hacer que la técnica funcionara globalmente para todos los péptidos.

Este estudio analizará tejidos cerebrales, cardíacos y hepáticos de un modelo murino de enfermedad de Alzheimer y controles de tipo salvaje. Transfiera de 60 a 90 miligramos de cada muestra de tejido a un tubo de lisis y agregue 500 microlitros de PBS con ocho molar de urea. Homogenice las muestras utilizando un homogenizador mecánico.

Retire el homogenato tisular del tubo de lisis y transfiéralo a un tubo de microcentrifugadora. Enjuague el tubo de lisis con 100 a 500 microlitros de PBS con ocho molar de urea y combine la solución de enjuague con el homogenato tisular. Centrifugue el homogenato tisular durante 15 minutos.

Recupere el sobrenadante de cada muestra. Después de realizar el ensayo BCA para determinar la concentración de proteína, agregue 100 microgramos de proteína de cada muestra en tubos microcentrífugos etiquetados individualmente. Añada ditionitritol a cada muestra.

Y se incuba a 37 grados Celsius durante dos horas. Añada iodoacetamida, IAM, a cada muestra y se incuba en hielo y a oscuras durante dos horas. A continuación, añada L-cisteína a cada muestra y se incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Después de 30 minutos, agregue tampón Tris con cloruro de calcio para diluir la urea hasta una concentración final de dos molar. Añada tripsina tratada con L1 tosilimitotofeniletilcoler metil cetona a cada muestra y incube a 37 grados Celsius durante 24 horas.

Al día siguiente, detenga la digestión proteica mediante congelación rápida de la muestra en nitrógeno líquido y almacénela a menos 80 grados Celsius hasta su posterior procesamiento. Antes de la etiquetación con dimetilación, las muestras de péptidos se desaltingen, como se describe en el protocolo escrito, y se secan mediante centrifugación al vacío. Para iniciar el procedimiento de etiquetación con dimetilación, reconstituya los péptidos en ácido acético al 1 % disuelto en agua de grado HPLC o grado nanopura.

Retire una porción de 50 microgramos de cada muestra y colóquela en un nuevo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Almacene el resto de los péptidos reconstituidos a menos 80 grados Celsius para experimentos futuros. En los pasos que se demostrarán a continuación, es fundamental añadir los reactivos rápidamente para que las reacciones químicas se produzcan durante el mismo período de tiempo en todas las muestras.

Agregue ocho microlitros de una solución de formaldehído 60 milimolar a las muestras para la marcación con dimetilación ligera. Agregue ocho microlitros de una solución de formaldehído marcada con carbono 13 y deuterio 60 milimolar a las muestras para la marcación con dimetilación pesada. Agregue ocho microlitros de borohidruro de sodio 24 milimolar a las muestras marcadas con dimetilación ligera.

Añada ocho microlitros de cianoborohidruro de sodio 24 milimolar a las muestras etiquetadas con dimetilación pesada. Vortexee las muestras y luego agítelas suavemente en un agitador de tubos durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente. Detenga las reacciones añadiendo 16 microlitros de amoníaco al 1 % durante cinco minutos.

Reacidificar las mezclas de reacción añadiendo ocho microlitros de ácido fórmico al 5%. Combinar los péptidos dimetilados ligeros y pesados para generar un total de seis muestras. Realizar la desalación de las muestras según se describe en el protocolo del texto.

Y seque las muestras mediante centrifugación al vacío. Para iniciar el etiquetado isobárico de las muestras dimetiladas, primero, reconstituya 100 microgramos de péptidos dimetilados en tampón de bicarbonato de trietilamonio, o TEAB. A continuación, prepare los reactivos isobáricos según el protocolo del fabricante del kit de etiquetado isobárico.

Agregue el volumen adecuado, en este caso, 41 microlitros del reactivo de etiquetado isobárico solubilizado a cada una de las muestras de péptidos, y vortexee durante aproximadamente 10 segundos. Agite las muestras en un agitador para tubos de microcentrifugado durante aproximadamente una hora a temperatura ambiente. Para detener las reacciones, agregue 8 microlitros de hidroxilamina a cada muestra.

Y incubar las muestras durante 15 minutos a temperatura ambiente. Agrupar las seis muestras etiquetadas en una mezcla única y desalar. Preparar los péptidos para cromatografía líquida reconstituyendo los péptidos en agua de grado para espectrometría de masas con 0,1 % de ácido fórmico.

Agregue péptidos reconstituidos a un tubo de microcentrifugado que contenga un filtro de 0,65 micrómetros. Centrifugue a 12.000 ×g durante un minuto. Retire y deseche el filtro.

Transfiera los péptidos filtrados a un vial de muestreador automático. Inyecte seis microlitros de cada muestra de fracción de intercambio catiónico fuerte en una columna trampa. Empaquete dos centímetros con material de carbono 18.

Realice los métodos de separación analítica y adquisición de datos del espectrómetro de masas. Se llevó a cabo un análisis cPilot de 12 plex en tejidos de cerebro, corazón e hígado de un modelo murino de enfermedad de Alzheimer y controles de tipo salvaje. Los datos de los precursores mostraron péptidos dimetilados ligeros y pesados representados por los picos en m/z 643.854 y 647.875.

Estos péptidos fueron seleccionados, aislados independientemente y fragmentados mediante disociación inducida por colisión para generar estos espectros. Los resultados de la búsqueda indicaron que los picos pertenecían a un péptido de la proteína fosfoglicerato quinasa uno. Estos picos fueron aislados posteriormente para espectrometría de masas en tándem con disociación por colisión de mayor energía y los iones marcadores se observan como se muestra.

Se necesitan ambos conjuntos de espectros de espectrometría de masas en tres etapas para obtener información sobre las 12 muestras. En este ejemplo, las relaciones iónicas entre la enfermedad de Alzheimer y el control de tipo salvaje son similares en los dos réplicas biológicos para los tejidos de cerebro, hígado y corazón. Los valores de cambio de expresión para cada comparación sugieren que los niveles de fosfoglicerato quinasa uno en el cerebro y el corazón son más altos en ratones con enfermedad de Alzheimer, pero más bajos en el hígado.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente cinco horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar tener cuidado en el manejo de las muestras. Incorporados a este procedimiento, se pueden realizar métodos de separación como intercambio catiónico fuerte o fraccionamiento a pH alto con el fin de aumentar la profundidad y cobertura diarias.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo mejorar la multiplexación de muestras utilizando C-Pilot.