Name: Preparación automatizada de muestras para el análisis multiplexado de modificaciones posttraduccionales de histonas unicelulares (sc-hPTM2) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Aprende a preparar muestras automatizadas para análisis multiplexado de modificaciones postraduccionales de histonas unicelulares. Este protocolo mejora la reproducibilidad y sensibilidad en estudios de heterogeneidad cromatínica.

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<ol><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Res. 21 (3), 381-395 (2011).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Sidoli, S., Bhanu, N. V., Karch, K. R., Wang, X., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+workflow+for+analysis+of+histone+post-translational+modifications+using+bottom-up+mass+spectrometry%3A+from+histone+extraction+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Complete workflow for analysis of histone post-translational modifications using bottom-up mass spectrometry: from histone extraction to data analysis.</a> J Vis Exp. (111), e54112(2016).</li>
<li>Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCoPE-MS%3A+mass+spectrometry+of+single+mammalian+cells+quantifies+proteome+heterogeneity+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation.</a> Genome Biol. 19 (1), 161(2018).</li>
<li>Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+protein+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell protein analysis by mass spectrometry.</a> Curr Opin Chem Biol. 60 (1), 1-9 (2021).</li>
<li>Leduc, A., Khoury, L., Cantlon, J., Khan, S., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+sample+preparation+for+multiplexed+single-cell+proteomics+using+nPOP%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Massively parallel sample preparation for multiplexed single-cell proteomics using nPOP.</a> Nat Protoc. 19 (12), 3750-3776 (2024).</li>
<li>Lund, P. J., Kori, Y., Zhao, X., Sidoli, S., Yuan, Z. F., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopic+labeling+and+quantitative+proteomics+of+acetylation+on+histones+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isotopic labeling and quantitative proteomics of acetylation on histones and beyond.</a> Methods Mol Biol. 1977 (1), 43-70 (2019).</li>
<li>Cutler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+profiling+of+single-cell+histone+post-translational+modifications+to+dissect+chromatin+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based profiling of single-cell histone post-translational modifications to dissect chromatin heterogeneity.</a> Nature Communications. , (2025).</li>
<li>Davie, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+histone+deacetylase+activity+by+butyrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Inhibition of histone deacetylase activity by butyrate.</a> J Nutr. 133 (7 Suppl), 2485S-2493S (2003).</li>
<li>Stransky, S., Cutler, R., Aguilan, J., Nieves, E., Sidoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+reversible+histone+acetylation+and+dynamics+in+gene+expression+regulation+using+3D+liver+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Investigation of reversible histone acetylation and dynamics in gene expression regulation using 3D liver spheroid model.</a> Epigenetics Chromatin. 15 (1), 35-35 (2022).</li>
<li>Stransky, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+phenotypic+analysis+of+functional+3D+spheroid+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Semi-automated phenotypic analysis of functional 3D spheroid cell cultures.</a> J Vis Exp. (1), e65086(2023).</li>
<li>Yuan, Z. F., Sidoli, S., Marchione, D. M., Simithy, J., Janssen, K. A., Szurgot, M. R., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiProfile+2.0%3A+a+computational+platform+for+processing+epi-proteomics+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data.</a> J Proteome Res. 17 (7), 2533-2541 (2018).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubos microcentrífugas de 1,5 mL</td><td>Bio-Rad</td><td>2239480</td><td></td></tr><tr><td>1000 y micro; Puntas de pipeta de calibre ancho en L</td><td>Fisher Scientific</td><td>14222703</td><td></td></tr><tr><td>200 y micro; Puntas de pipeta de calibre ancho en L</td><td>Fisher Scientific</td><td>14222730</td><td></td></tr><tr><td>Placa PCR de 384 pozos Lo Bind&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30129547</td><td></td></tr><tr><td>Colector de vacío de 96 pozos</td><td>Millipore</td><td>MAVM0960R</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo, grado Optima LC-MS/MS</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>Láminas adhesivas de placas PCR</td><td>Thermo Fisher</td><td>AB0626</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo anhidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA42311AK</td><td>Solución de stock de etiquetas para granel</td></tr><tr><td>Arg-C Ultra, grado espectrometría de masas</td><td>Promega</td><td>VA1831</td><td></td></tr><tr><td>Agua de grado de cultivo celular</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>CellenVIALs</td><td>SCIENION</td><td>/</td><td>El número de catálogo viene acompañado de una cita</td></tr><tr><td>DMSO, anhidro</td><td>Thermo Fisher</td><td>D12345</td><td>Solución de stock de etiquetas</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632-5G</td><td></td></tr><tr><td>Eagle's Medium Modificado (DMEM) de Dulbecco</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT17205CV</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Termodinámica</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico 98%&ndash; 100% para LC-MS LiChropur</td><td>Sigma</td><td>5330020050</td><td></td></tr><tr><td>La solución salina equilibrada de Hank (HBSS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21022CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (Ultra Puro)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo de grado HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Agua de calidad HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>Solución de hidroxilamina 50% en H2O</td><td>Sigma</td><td>438227-50ML</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25015CI</td><td></td></tr><tr><td>Detergente n-Dodecil-beta-Maltoside (DDM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BN2005</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro de Masas Orbitrap Exploris 480</td><td>Thermo Fisher</td><td>BRE725539</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído 16% de solución acuosa de grado EM</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>PDC-CM (recubrimiento tipo 2)</td><td>SCIENION</td><td>/</td><td>El número de catálogo viene acompañado de una cita</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT3002CI</td><td></td></tr><tr><td>Solución fisiológica tamponada (PBS), 10x, pH 7,4, libre de RNasa</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido de perforación (DMSO), grado LC-MS</td><td>Thermo Fisher</td><td>85190</td><td></td></tr><tr><td>Pistola de pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>Z666467 (Milipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>Anhídrido propiónico &ge; 99%</td><td>Sigma</td><td>240311-50G</td><td></td></tr><tr><td>Anhídrido propiónico-d10 & ge; 98 átomo % D, &ge; 99% (CP)</td><td>Sigma</td><td>615692-1G</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Termodinámica</td><td>75-217-420</td><td></td></tr><tr><td>Deslizadores de vidrio recubiertos SciCHIP H1</td><td>SCIENION</td><td>/</td><td>El número de catálogo viene acompañado de una cita</td></tr><tr><td>Concentrador de vacío SpeedVac (placas de 96 pozos)</td><td>Termodinámica</td><td>15308325</td><td>Savant SPD1010</td></tr><tr><td>Capucha estéril</td><td>Termodinámica</td><td>1375</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas estériles</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367549</td><td></td></tr><tr><td>Tinción de células muertas verdes SYTOX, para citometría de flujo</td><td>Thermo Fisher</td><td>S34860</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X), sin fenol rojo</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Vórtice</td><td>Sigma</td><td>Z258415</td><td></td></tr><tr><td>Baños María</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD10</td><td></td></tr></tbody></table>

preparación automatizada de muestras para el análisis multiplexado de modificaciones posttraduccionales de histonas unicelulares (sc-hptm2)

Automated Sample Preparation for the Multiplexed Analysis of Single-Cell Histone Post-Translational Modifications (sc-hPTM2)

Para demostrar la aplicación de nuestro flujo de trabajo de proteómica de histonas unicelulares utilizando nuestro sistema, analizamos esferoides de células HepG2/C3A tratadas con 5 mM de butirato de sodio durante 24 horas. Tras la adquisición de LC-MS/MS, se procesaron los datos en bruto con EpiProfile tanto para el marcaje ligero (anhídrido propiónico) como para el marcaje pesado (anhídrido propiónico-d10), obteniendo datos normalizados que representan las abundancias de los péptidos y las marcas de histonas. El paquet...

Preparación automatizada de muestras para el análisis multiplexado de modificaciones posttraduccionales de histonas unicelulares (sc-hPTM2)

Histone post-translational modifications (hPTMs) are central regulators of chromatin organization and gene expression. Their dysregulation is implicated ...

automated-sample-preparation-for-multiplexed-analysis-single-cell

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este protocolo describe un flujo de trabajo totalmente integrado para la caracterización de las histonas modificaciones post-traduccionales utilizando espectrometría de masas (MS). El flujo de trabajo incluye la purificación de la histona de cultivos de células o tejidos, la derivación de histonas y la digestión, el análisis de MS utilizando cromatografía líquida de flujo nano e instrucciones para el análisis de datos. El protocolo está diseñado para dentro de 2 - 3 días.

Flujo de trabajo completo para el análisis de las histonas modificaciones post-traduccionales El uso de espectrometría de masas de abajo hacia arriba: A partir de la histona Extracción de Análisis de Datos

Este manuscrito describe métodos para aplicar la tecnología de microarrays de péptidos a la especificidad de perfiles de anticuerpos que reconocen las histonas y sus modificaciones post-traduccionales.

Análisis de especificidad de anticuerpos histona con microarrays peptídicos

El propósito de este artículo es proporcionar a una guía completa y sistemática a la purificación eficiente de las histonas H3 y H4 y la cuantificación de residuos de histona acetilado.

Purificación de proteínas de histona H4, H3 y la cuantificación de las marcas acetilado histonas en las células y el tejido cerebral

Este flujo de trabajo describe el rendimiento del enriquecimiento eficiente en tiempo y costo de múltiples modificaciones post-traduccionales de proteínas (PTF) simultáneamente para el análisis proteómico global cuantitativo. El protocolo utiliza el enriquecimiento de PTM a nivel de péptido con múltiples anticuerpos conjugados, seguido de un análisis de espectrometría de masas de adquisición independiente de datos para obtener información biológica sobre la conversación cruzada PTM.

Enriquecimiento de afinidad simultánea de dos modificaciones post-traduccionales para la cuantificación y la localización del sitio

Aquí, los autores muestran la utilidad de MULTI-seq para fenotipar y posteriormente emparejar scRNA-seq y scATAC-seq en la caracterización de los perfiles de accesibilidad transcriptómica y cromatina en la retina.

Análisis multiplexado de la expresión génica de la retina y la accesibilidad a la cromatina utilizando scRNA-Seq y scATAC-Seq

Este protocolo describe cómo se puede utilizar un sistema de cultivo celular tridimensional para modelar, tratar y analizar modificaciones de cromatina en un estado casi fisiológico.

Cuantificación a nivel global de modificaciones post-traduccionales de histonas en un modelo de cultivo celular 3D de tejido hepático

En este trabajo se describe un protocolo para la cuantificación de modificaciones globales de histonas mediante citometría de flujo intranuclear en microglía cerebral aislada. El trabajo también contiene el protocolo de aislamiento de microglía que se utilizó para la recolección de datos.

Cuantificación de las modificaciones postraduccionales globales de histonas mediante citometría de flujo intranuclear en microglía cerebral de ratón aislada

Un flujo de trabajo analítico basado en cromatografía líquida, espectrometría de movilidad de iones atrapados y espectrometría de masas de tiempo de vuelo (LC-TIMS-ToF MS/MS) para un análisis "ascendente" de alta confianza y altamente reproducible de las modificaciones e identificación de histonas en función de los parámetros principales (tiempo de retención [RT], sección transversal de colisión [CCS] y relación masa-carga [m/z] precisa).

Cribado de modificación de histonas mediante cromatografía líquida, espectrometría de movilidad de iones atrapados y espectrometría de masas de tiempo de vuelo

Este protocolo permite la extracción eficiente de histonas de diversas muestras clínicas para el posterior análisis de modificaciones postraduccionales mediante LC-MS/MS. Al facilitar la detección robusta de modificaciones clave de histonas, sirve como una herramienta valiosa para un perfil epigenético integral en grandes cohortes clínicas.

Extracción de histonas de muestras clínicas para perfilado epigenético mediante espectrometría de masas

Recientemente se han identificado variantes genéticas en el miembro humano de la familia Spindlin 4 (SPIN4) en pacientes con sobrecrecimiento óseo, un trastorno novedoso del desarrollo. Se presenta un protocolo y nuevos resultados que describen la identificación bioquímica de histonas modificadas en el contexto de nucleosomas como sustratos de unión a SPIN4.

Identificación de histonas modificadas como sustratos de unión del miembro 4 de la familia de la espiglina humana (SPIN4) mediante matrices peptídicas y pulldown nativo de nucleosomas

Este estudio presenta un protocolo multioma espacial Trekker–CUT&amp;Tag que combina codificación de barras espacial directa de una sección tisular con análisis multioma de célula única. Este enfoque permite simultáneamente un perfilado espacial de expresión génica en células individuales y la modificación de la histona H3K27ac, ofreciendo conocimientos mecanicistas sobre la regulación génica en el contexto de la microanatomía tisular.

Perfilado multiómico integrado de célula única y resuelto espacialmente del transcriptoma y objetivos epigenómicos en secciones de tejido congelado

Aprende a preparar muestras automatizadas para análisis multiplexado de modificaciones postraduccionales de histonas unicelulares. Este protocolo mejora la reproducibilidad y sensibilidad en estudios de heterogeneidad cromatínica.

Preparación automatizada de muestras para el análisis multiplexado de modificaciones posttraduccionales de histonas unicelulares (sc-hPTM2) (Video) | JoVE Journal

Preparación automatizada de muestras para el análisis multiplexado de modificaciones posttraduccionales de histonas unicelulares (sc-hPTM2)

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