Preparación automatizada de muestras para el análisis multiplexado de modificaciones posttraduccionales de histonas unicelulares (sc-hPTM2)

Estamos avanzando en la proteómica unicelular con un método automatizado de multiplexación para estudiar la heterogeneidad global de la cromatina para modificaciones postraduccionales. Lo que hace que este protocolo sea complicado es la preparación proteómica a escala picograma, el marcaje multiplex, así como la resolución de péptidos histonos modificados combinatorios complejos. Para empezar, reconstituir las células hepatocelulares de carcinoma Hep G2/C3A a una concentración final de 200 a 500 células por microlitro en PBS helado.

Ajusta la anchura de pulso y el voltaje de transmisión de cada tobera a los valores proporcionados por el fabricante. Para lograr la máxima eficiencia de las pastillas, asegúrese de que el desplazamiento Z entre las dos toberas difiera en menos de 50 micrómetros. Identifica la posición óptima de contacto para cada tobera y compara las lecturas de altura Z en la pestaña de configuración de toberas.

Para el esquema de multiplexación tuplex, carga una sola corredera en el portaobjetos de la cabina y luego transfiere al instrumento. Usando una pipeta, agítale 150 microlitros de DMSO de grado LCMS en un nuevo tubo de PCR. Colócalo en la posición dos de la estación de lavado con la tapa del tubo mirando hacia la puerta del instrumento.

Empieza la partida DMSO. Obtén una caída estable una vez después de que el DMSO haya sido aspirado. Fíjate en el cambio en la transparencia del PDC.

Puede ser necesario aumentar el voltaje. Verifica la estabilidad realizando una comprobación del volumen de caída. Realiza el sistema de asistente de cámara principal para alinear la cámara.

Dispensa DMSO y permite que el instrumento vacie automáticamente las boquillas y capture imágenes en todas las diapositivas para el control de calidad. Revisa estas imágenes para verificar que hay una gota DMSO uniforme en cada diapositiva y para comprobar si faltan o no están en el objetivo. Tras aspirar la suspensión de la celda, abre la celda en un módulo, realiza una captura de fondo y luego ejecuta la rutina de mapeo para definir la zona de eyección.

Haz el análisis y luego selecciona las partículas para seleccionar celdas según el tamaño y la elongación. Ahora, prepara una mezcla maestra de digestión fresca en agua de calidad LCMS. Desgasifica la solución con una bomba de vacío durante 10 minutos sobre hielo.

Después de dispensar la mezcla de digestión sobre las láminas, deja que el instrumento enjuague automáticamente las boquillas y fotografía cada lámina. Revisa las imágenes para verificar que cada gota recibe la mezcla digestiva de forma uniforme. Incuba las láminas a temperatura ambiente durante la noche para realizar la digestión.

Después de iniciar la evaporación y la digestión nocturna, inspecciona las imágenes. Si las gotas están lo suficientemente secas, detén la fuga. Si no, haz clic en continuar y seca durante otros cinco minutos.

Para el marcado, primero prepara soluciones estándar para la derivación multiplexada de histonas. Después de la dispensación, permite que el instrumento enjuague automáticamente las boquillas y fotografía cada lámina. Revisa las imágenes para confirmar una distribución uniforme y la colocación correcta de las gotas en todas las láminas.

Tras completar la incubación, dispensar la solución de hidroxilamina para el temple. Para recoger la muestra, selecciona la ejecución en la pestaña principal y luego comienza la ejecución en la pestaña de ejecución. Cuando termine la recogida, revisa las imágenes para comprobar si hay errores.

Una vez terminado con la pastilla, quita la tapa de la placa de la pastilla. Luego seca las muestras a baja temperatura en un concentrador al vacío. Para la adquisición de datos, programa el método de cromatografía líquida de alto desempeño.

Configura el experimento MS dos para que contenga ventanas de aislamiento de 50% de sobrecarga de masa, disociación de colisión de alta energía del 27% y un objetivo automático de control de ganancia del 1000%. Cubre la placa con una alfombra de sellado de goma y colócala dentro del autosampler. Después de obtener los archivos en bruto, revisa brevemente el cromatograma y luego ejecuta los datos en bruto en la versión 2.1 de EpiProfile. Revisa la tabla de salida de las abundancias normalizadas de PTM de histonas y úsala para análisis posteriores.

Se cuantificaron los primeros 20 peptidoformos H3 de histonas, mostrando sus abundancias relativas en condiciones de control y tratadas con butirato de sodio. Tanto la acetilación de H3K9 como la acetilación de H3K14 mostraron mayor abundancia relativa durante el tratamiento con butirato de sodio. Mientras que la acetilación de H3 K9, la acetilación de K14 parecía aún más enriquecida en las células tratadas.

Los niveles totales de acetilación aumentaron tras el tratamiento con butirato de sodio, mostrando una distribución de errores más amplia en comparación con los controles, reflejando la mayor heterogeneidad capturada a nivel de célula individual. La cuantificación de modificaciones de histonas simples y coexistentes demostró que los estados de acetilación combinatoria se veían más fuertemente afectados por el butirato de sodio. La dispersión más amplia de las células tratadas con butirato de sodio indicó una mayor heterogeneidad biológica entre las células individuales dentro de los esferoides.

Este protocolo cierra la brecha en la investigación epigenética al permitir a los científicos estudiar los estados de la cromatina en solución unicelular. Este flujo de trabajo permite la preparación de muestras de alto rendimiento, la multiplexación de muestras y la espectrometría de masas imparcial para producir datos epigenéticos tanto sensibles como cuantitativos de células individuales. Investigaciones futuras explorarán cómo la regulación de la cromatina está alterando estados patológicos como el cáncer, las enfermedades metabólicas y el envejecimiento.