Name: Un método sencillo para glucosinolatos Extracción y análisis de alta presión con cromatografía líquida (HPLC) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Aprenda a extraer y analizar glucosinolatos en plantas mediante cromatografía líquida de alta presión. Este método validado facilita investigaciones en ecología, patología vegetal y ciencias de alimentos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NMvD agradece al Dr. Michael Reichelt (Instituto Max-Planck de Ecología Química, Jena, Alemania) por proporcionar las primeras muestras de referencia cuando comenzó a usar este método hace 16 años. Ciska Raaijmakers (NIOO-KNAW, Wageningen, Países Bajos), Sebastian Krosse (B-Ware, Nijmegen, Países Bajos) y Christian Ristok (iDiv, Leipzig) son reconocidos por mejorar el protocolo a lo largo de los años. Se reconoce a Mirka Macel y Martine Huberty (Universidad de Tübingen, Alemania) su permiso para utilizar el cromatograma Rorippa. Los autores agradecen el apoyo del Centro Alemán para la Investigación Integrativa de la Biodiversidad (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, financiado por la Fundación Alemana de Investigación (FZT 118).

1. Preparación de soluciones necesarias para la extracción glucosinolatos <ol><li> Preparar 500 ml de metanol al 70% (MeOH) en agua (ultrapura) en una botella de vidrio. Para 100 muestras y estándares de 5, 420 ml de 70% es necesaria MeOH. </li><li> Preparar acetato de sodio 20 mM (NaOAc) (pH = 5,5) mediante la adición de 0,82 g de NaOAc o 1,36 g de NaOAc 3 x H 2 O en 500 ml de agua; ajustar el pH con cloruro de hidrógeno (HCl). Almacenar el NaOAc en el refrigerador. Para que se necesita 100 muestras y estándares de 5, 370 ml de acetato sódico 20 mM (pH = 5,5) en agua. </li><li> Para preparar el material de la columna, la mezcla 10 g de gel de dextrano reticulado (tipo G-25) con 125 ml de agua ultrapura. Almacenar la mezcla resultante en un refrigerador (4 ° C). </li><li> Preparación de la solución sulfatasa <ol><li> Disolver 10,000 unidades de aril sulfatasa (tipo H-1 de Helix pomatia) en 30 ml de agua ultrapura y añadir 30 ml de etanol absoluto (EtOH). Mezclar bien la solución y transferirla a uno CEN 250 mltrifuge tubo o varios tubos más pequeños, dependiendo de la disponibilidad. </li><li> Centrifugar la mezcla a 2650 xg durante 20 min a temperatura ambiente (RT). Transferir el sobrenadante (s) a un vaso de precipitados; Agregar 90 ml de EtOH y se mezcla. Centrifugar la mezcla en uno o más tubos de centrífuga a 1.030 xg durante 15 min a TA. </li><li> Descartar el sobrenadante. Disolver y combinar los gránulos en un total de 25 ml de agua ultrapura. Vortex así, dispensan en tubos de 1 mL, y almacenar en un congelador a -20 ° C; que se mantendrá durante al menos un año. </li></ol></li><li> Preparación de la solución de referencia sinigrin <ol><li> Pesar en torno a 9 mg de monohidrato sinigrin con 1-g exactitud (por ejemplo, 8,769 mg). Transferirla a un matraz aforado de 10 ml y disolver el monohidrato sinigrin en 10,0 ml de agua ultrapura. </li><li> Calcular la molaridad de la solución madre y preparar cinco referencias sinigrina entre 50-750 mM por dilución de la solución madre. Para un ejemplo detallado, véase<html> <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/20160918GrosservanDamJoVEGlucosinolates_S1.docx" target="_blank">S1 del archivo</a> . </li><li> Prescindir de las diferentes referencias sinigrina en tubos de reacción de 1,5 ml y congelar a 20 ° C. Incluir una serie de cinco referencias sinigrina en cada lote de extracción. Utilice siempre los valores correctos para la molaridad utilizado actualmente sinigrin referencias para el cálculo de las concentraciones. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de la instalación de extracción <ol><li> Prepare un estante de la columna para las columnas pipeta Pasteur (para la preparación de columnas, véase el paso 3.1). Etiqueta de la cremallera o de las columnas para realizar un seguimiento de los números de las muestras (ver Figura 1). </li><li> Preparar un bloque que sostiene el mismo número de la etiqueta tubos de microcentrífuga de 2 ml (véase la etapa 3.3 y la Figura 1) </li></ol>5 / 55425fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Rack para la extracción de glucosinolatos. Vista frontal (izquierda) y vista desde arriba (derecha) de un estante de la columna hecho a sí mismo y de bloques para la extracción de glucosinolatos. Altura: 100 mm, distancia entre agujeros cambió (para sostener las columnas pipeta Pasteur): 30 mm (eje x) x 15 mm (eje). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 3. Preparación de las columnas y tubos de microcentrífuga <ol><li> Preparar una columna por muestra y cinco columnas adicionales para las cinco muestras de referencia sinigrina. <ol><li> En cada una pipeta de vidrio, colocar un trozo de lana de vidrio de aproximadamente 1 cm x 1 cm. Use un palo de madera o de vidrio para empujar la lana de vidrio hasta el punto en el que la pipeta se estrecha. La lana de vidrio se debe evitar que el material de la columna se agote, pero no use demasiado, ya que se ralentizará la elución de las columnas. Utilizar guantes de WHen el trabajo con la lana de vidrio. </li></ol></li><li> Coloca las columnas de la rejilla columna (véase la Figura 1). Coloque la parrilla de la columna en una bandeja de laboratorio (bandeja de desechos) para atrapar a los eluyentes utilizados para los lavados de las columnas consecutivas. </li><li> Cortar los primeros 5 mm de la punta de una punta de pipeta de 1 ml de plástico y una pipeta 0,5 ml de material de la columna preparada (G-25 gel en agua, véase el paso 1.3) en cada columna. Agite la botella que contiene el material de la columna antes de la pipeta. Eliminar las columnas con fugas (material G-25 se ejecuta a través de la capa de lana de vidrio) y sustituir por otros nuevos. <ol><li> Después de pipetear el material de la columna en las columnas, añadir 1 ml de agua ultrapura para enjuagar por la material. </li></ol></li><li> Prever un tubo de reacción de 2 ml por muestra y cinco tubos para las cinco muestras de referencia sinigrina; etiquetarlos. Use una aguja de disección para hacer agujeros en las tapas para después de la liofilización y colocar los tubos preparados en el bloque de tubo en el mismo patrón como elcolumnas (paso 2.2, véase la Figura 1). </li></ol> 4. Extracción de glucosinolatos <ol><li> Pesar se liofilizaron y material vegetal finamente molidas (normalmente 50,0 a 100,0 mg de peso seco; las concentraciones de glucosinolatos finales en el extracto debe estar en el rango de la curva de referencia) a la 0,1 mg en 2 ml, etiquetados, redondo tubos de reacción -fondo. Añadir dos pequeñas bolas de metal (3 mm de diámetro) como retardantes de ebullición a cada tubo. NOTA: El protocolo también se puede aplicar a materiales frescos, flash-congelados, que han sido molidas en nitrógeno líquido y se mantuvieron congeladas hasta la extracción. Aumentar la cantidad de material pesado para la extracción y el porcentaje de MeOH en el líquido de extracción a 85% para compensar la dilución por el agua en los materiales 19. </li><li> Pipetear 1 ml de 70% de MeOH en cada tubo y vórtice brevemente. Cierre los tubos y se sellarán con tapas de seguridad antes de colocarlos lo más rápidamente posible en un caliente wbaño ater (90-92 ° C) durante algunos minutos (~ 5 minutos), hasta que el 70% de MeOH simplemente hierva. Precaución: Use gafas de seguridad durante este paso! </li><li> Coloque los tubos de muestra en un baño ultrasónico durante 15 minutos. Mientras tanto, tomar la sulfatasa y las cinco muestras de referencia sinigrina fuera del congelador para descongelar a temperatura ambiente. </li><li> Después de ultra-sonicación, centrifugar los tubos de muestra en 2700 xg en una centrífuga de mesa durante 10 minutos a RT; un pellet debe formar en cada tubo. Añadir los sobrenadantes de las columnas etiquetadas y pipeta de las cinco muestras de referencia en columnas separadas. <ol><li> Si bien pipeteando los sobrenadantes, mantener la punta más de la pastilla para evitar materiales vegetales pipeteo. Tenga en cuenta que cuando se utilizan muestras secas, el volumen de sobrenadante será menor que 1,0 ml. </li></ol></li><li> Añadir 1 ml de 70% de MeOH a los gránulos restantes en los tubos de muestra y agitar los tubos antes de colocarlos en un baño de ultrasonidos durante 15 min. Centrifugar los tubos de nuevo, como en el paso 4.4, y añadir la supernatantes a las respectivas columnas; debido a las propiedades del material de la columna, el grupo sulfato de carga negativa de los glucosinolatos será retenido específicamente en la columna. </li><li> Se lavan las columnas con los extractos en tres etapas secuenciales. <ol><li> Pipetear 2 x 1 ml de 70% de MeOH en cada columna. Espere a que la columna se seque antes de agregar los próximos 1 ml; esto eliminará más compuestos apolares de los extractos (por ejemplo, clorofila). </li><li> Enjuagar el MeOH mediante la adición de 1 ml de agua ultrapura a cada columna. </li><li> Pipetear 2 x 1 ml de 20 mM NaOAc tampón para cada columna para crear las condiciones óptimas para la reacción de sulfatasa. </li></ol></li><li> Tome el bastidor con las columnas de la bandeja de desechos y secar los pies del bastidor con un pañuelo de papel. Coloque la parrilla sobre el bloque con los frascos y tubos etiquetados. Asegúrese de que cada punta de la columna se encuentra en la etiqueta correspondiente, tubo, de 2 ml (véase la Figura 1). </li><li> Añadir 20 l de soluti sulfatasaa las columnas. Asegúrese de que la sulfatasa llega a la superficie del material de la columna. Pipeta de 50 l de tampón NaOAc en cada columna para limpiar abajo de la sulfatasa. Cubrir las columnas con papel de aluminio y dejar reposar durante la noche. NOTA: Debido a las actividades de la sulfatasa, el grupo sulfato se eliminará, la liberación de los desulfoglucosinolates de la columna de modo que puedan eluir con el agua. Para una descripción detallada, consulte Crocoll et al. 19. </li><li> El día siguiente, eluir el desulfoglucosinolates pipeteando 2 x 0,75 ml de agua ultrapura a cada columna. Cuando todas las columnas se han secado, levante el estante de la columna y sacarlo de los tubos de reacción. <ol><li> Tape los tubos (asegúrese de que hay agujeros en las tapas) y congelarlos en nitrógeno líquido o en un congelador a -80ºC durante 30 min. Liofilizar las muestras durante 12 a 24 h (en función del número de muestras y la capacidad de la liofilizador) para eliminar toda el agua. </li></ol></li> &lt;li&gt; Después de la liofilización, re-disuelve el residuo en un volumen exacto (generalmente 1,0 ml) de agua ultrapura. La transferencia de las muestras y las cinco referencias sinigrina a viales de HPLC etiquetados. Mantener las muestras en un refrigerador (4 ° C) durante un máximo de dos semanas o un congelador (-20 ° C) durante un máximo de un año antes de su análisis con HPLC. </li><li> Dejar que el vidrio columnas se secan bajo el capó durante la noche y disponerlos en estado seco. Recuperar las bolas de metal de los tubos de muestra utilizados en el paso 4.5 para su reutilización y poner los tubos en el recipiente de eliminación de residuos. </li></ol> 5. Mediciones de HPLC de muestras extraídas <ol><li> Separar las glucosinolatos en una columna C18 de fase inversa (4,6 x 150 mm, 3 m, 300 Å) con un gradiente de acetonitrilo-agua (véase la Tabla 1) y un flujo de 0,75 ml / min y una temperatura de columna de 40 ° C . Realizar la detección y cuantificación a 229 nm. </li><li> Medir las referencias sinigrina en la misma columna, pero con un gradiente adaptadoMétodo para reducir el uso de disolventes (véase la Tabla 2). Comenzar con la inyección de las cinco referencias sinigrina, a partir de la referencia con la concentración más baja. A continuación, inyectar las muestras, incluyendo una inyección de metanol (en blanco) después de cada décimo muestra para limpiar la columna, y para evitar que el arrastre de los picos. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Tiempo [min] </td><td> Flujo [ml / min] </td><td> % Un agua </td><td> % B ACN </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0.750 </td><td> 98 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 35 </td><td> 0.750 </td><td> sesenta y cinco </td><td> 35 </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 0.750 </td><td> 98 </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="4"> Temperatura de la columna 40 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabla 1: gradiente de acetonitrilo-agua para la separación de glucosinolatos y analysis en HPLC de fase inversa. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Tiempo [min] </td><td> Flujo [ml / min] </td><td> % Un agua </td><td> % B ACN </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0.750 </td><td> 98 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 0.750 </td><td> 89.3 </td><td> 10.7 </td></tr><tr><td> 11 </td><td> 0.750 </td><td> 98 </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="4"> Temperatura de la columna 40 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabla 2: acortado gradiente de acetonitrilo-agua para la cuantificación de las cinco referencias sinigrina utilizados para la cuantificación de glucosinolatos. 6. Identificación y Cuantificación de glucosinolatos <ol><li> Identificación <ol><li> Comparación de los tiempos de los espectros UV y retención de los picos en las muestras con vano comercialmentecapaces, referencias glucosinolatos puros. Vea la Figura 2 para ver ejemplos de espectros UV de las distintas clases de glucosinolatos. </li><li> Identificar los glucosinolatos problema con los patrones de referencia o en LC-MS 18, 19, si es posible. </li><li> Identificar los glucosinolatos desconocidos con la resonancia magnética nuclear (RMN), si es posible. </li><li> Comparación de los tiempos de los espectros UV y retención de los picos con las de la Figura 2 y Tabla 3 referencias, bases de datos, o la literatura. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig2.jpg" /> Figura 2. Espectros UV de las clases más comunes de glucosinolatos. espectros de absorción UV (200-350 nm) de seis desulfoglucosinolates (GSL), basada en soluciones hechas de compuestos de referencia disponibles en el comercio extraídos como se describe aquí, lo que representa las clases estructurales más comunes. El nombre común, esNombre STRUCTURALES (entre paréntesis), y la clase estructural se dan. (A) sinigrina (2-propenil GSL), alquenilo; (B) glucoerucın (4-methylthiobutyl GSL), thioalkenyl; (C) glucorafanina (4-methylsulfinlybutyl GSL), sulfinilo; (D) glucobrasicina (indol-3-ilmetil GSL), indol; (E) gluconasturtina (2-feniletil GSL), aromático; (F) sinalbina (4-hidroxibencil GSL), aromático. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="2"><li> Cuantificación <ol><li> Integrar el área bajo los picos de las cinco referencias sinigrina y las muestras. </li><li> Calcular una curva de calibración de las cinco referencias sinigrina medido con base en el área integrada. Usar la ecuación de la recta de regresión (véase la Ecuación 1) para calcular la cantidad interpolada de glucosinolatos (ver Ecuación 2).</li><li> Para calcular la concentración de los diferentes glucosinolatos, multiplicar la cantidad interpolado (x) por el factor de respuesta (M) para la detección a 229 nm de la CE (1990) 16, Buchner (1987) 15, o Brown et al. (1993) 17; los factores de respuesta de consenso de los desulphoglucosinolates más comúnmente detectados se dan en la Tabla 3. NOTA: Los factores de respuesta pueden variar entre los sistemas-Esta puede ser la razón por la que existen diferentes valores dados por diferentes referencias (ver referencias 15-17). Sin embargo, los valores son en su mayoría muy cerca y en un rango similar con clases estructurales. Siguiendo la convención, establecer el factor de respuesta de glucosinolatos no identificados a 1, aunque para glucosinolatos indólicos desconocidos con un espectro de UV similar a la de glucobrasicina y otros glucosinolatos indólicos (Figura 2), sería aconsejable utilizar 0.25 como un factor de respuesta para obteneruna estimación realista de la concentración (Tabla 3). </li><li> Para calcular el importe final de glucosinolatos (x t) en la muestra, tomar el factor de dilución (D) y la masa de la muestra (w) que se utiliza para el análisis en cuenta (véase la ecuación 3). <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq1.jpg" /> (1) <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq2.jpg" /> (2) <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq3.jpg" /> (3) y = área de pico m = pendiente de la curva de regresión 5-punto de referencia c = la intersección de la línea de regresión con el eje y x = cantidad de glucosinolatos en el extracto x t = concentración de glucosinolatos en la muestra de la planta D = factor de dilución M = factor de respuesta para la detección a 229 nm de Buchner (1987) o Brown et al. (1993) w = masa de la muestra utilizada para la extracción </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hartmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+waste+products+to+ecochemicals%3A+Fifty+years+research+of+plant+secondary+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">From waste products to ecochemicals: Fifty years research of plant secondary metabolism.</a> Phytochemistry. 68 (22-24), 2831-2846 (2007).</li>
<li>Will, H., Laubenheimer, A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jlac.18791990109/abstract">Ueber das Glucosid des weissen Senfsamens.</a> Justus Liebigs Annalen der Chemie. 199 (1), 150-164 (1879).</li>
<li>Agerbirk, N., Olsen, C. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22405332">Glucosinolate structures in evolution.</a> Phytochemistry. 77, 16-45 (2012).</li>
<li>Halkier, B. A., Gershenzon, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16669764">Biology and biochemistry of glucosinolates.</a> Ann Rev Plant Biol. 57, 303-333 (2006).</li>
<li>Sønderby, I. E., Geu-Flores, F., Halkier, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+glucosinolates+-+gene+discovery+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22TIPS%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of glucosinolates - gene discovery and beyond.</a> TIPS. 15 (5), 283-290 (2010).</li>
<li>Kliebenstein, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+natural+variation+in+Arabidopsis+glucosinolate+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetic control of natural variation in Arabidopsis glucosinolate accumulation.</a> Plant Physiol. 126 (2), 811-825 (2001).</li>
<li>van Leur, H., Raaijmakers, C. E., van Dam, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heritable+glucosinolate+polymorphism+within+natural+populations+of+Barbarea+vulgaris%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">A heritable glucosinolate polymorphism within natural populations of Barbarea vulgaris.</a> Phytochemistry. 67 (12), 1214-1223 (2006).</li>
<li>Kelly, P. J., Bones, A., Rossiter, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-cellular+immunolocalization+of+the+glucosinolate+sinigrin+in+seedlings+of+Brassica+juncea%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Sub-cellular immunolocalization of the glucosinolate sinigrin in seedlings of Brassica juncea.</a> Planta. 206 (3), 370-377 (1998).</li>
<li>van Dam, N. M., Tytgat, T. O. G., Kirkegaard, J. A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11101-008-9101-9">Root and shoot glucosinolates: a comparison of their diversity, function and interactions in natural and managed ecosystems.</a> Phytochem Rev. 8 (1), 171-186 (2009).</li>
<li>Ratzka, A., Vogel, H., Kliebenstein, D. J., Mitchell-Olds, T., Kroymann, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12161563">Disarming the mustard oil bomb.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (17), 11223-11228 (2002).</li>
<li>Wittstock, U., Kliebenstein, D. J., Lambrix, V., Reichelt, M., Gershenson, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWittstock%2C+U+%22Integrative+Phytochemistry%3A+From+ethnobotany+to+molecular+ecology%3A+Recent+Advances+in+Phytochemistry%22">Integrative Phytochemistry: From ethnobotany to molecular ecology: Recent Advances in Phytochemistry</a>. Romeo, J. T. 37, Ch. 5 Pergamon (2003).</li>
<li>Hopkins, R. J., van Dam, N. M., van Loon, J. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+glucosinolates+in+insect-plant+relationships+and+multitrophic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Role of glucosinolates in insect-plant relationships and multitrophic interactions.</a> Ann Rev Entomol. 54 (1), 57(2009).</li>
<li>Kliebenstein, D. J., Gershenzon, J., Mitchell-Olds, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+quantitative+trait+loci+mapping+of+aliphatic%2C+indolic+and+benzylic+glucosinolate+production+in+Arabidopsis+thaliana+leaves+and+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative quantitative trait loci mapping of aliphatic, indolic and benzylic glucosinolate production in Arabidopsis thaliana leaves and seeds.</a> Genetics. 159 (1), 359-370 (2001).</li>
<li>Mithen, R., Bennett, R., Marquez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucosinolate+biochemical+diversity+and+innovation+in+the+Brassicales%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Glucosinolate biochemical diversity and innovation in the Brassicales.</a> Phytochemistry. 71 (17-18), 2074-2086 (2010).</li>
<li>Buchner, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuchner%2C+R+%22Glucosinolates+in+rapeseed%22">Glucosinolates in rapeseed</a>. Wathelet, J. P. , Martinus Nijhoff Publishers. 50-58 (1987).</li>
<li>Oil seeds - determination of glucosinolates High Perfomance Liquid Chromatography. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Official+Journal+of+the+European+Communities%22">Official Journal of the European Communities</a>. , L 170/28. Annex VIII 03.07 27-34 (1990).</li>
<li>Brown, P. D., Tokuhisa, J. G., Reichelt, M., Gershenzon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+glucosinolate+accumulation+among+different+organs+and+developmental+stages+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Variation of glucosinolate accumulation among different organs and developmental stages of Arabidopsis thaliana.</a> Phytochemistry. 62 (3), 471-481 (2003).</li>
<li>Glauser, G., Schweizer, F., Turlings, T. C. J., Reymond, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Profiling+of+Intact+Glucosinolates+in+Arabidopsis+Leaves+by+UHPLC-QTOFMS+Using+a+Charged+Surface+Hybrid+Column%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem+Analysis%22%5BJournal%5D)">Rapid Profiling of Intact Glucosinolates in Arabidopsis Leaves by UHPLC-QTOFMS Using a Charged Surface Hybrid Column.</a> Phytochem Analysis. 23 (5), 520-528 (2012).</li>
<li>Crocoll, C., Halkier, B. A., Burow, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrocoll%2C+C+%22Current+Protocols+in+Plant+Biology%22">Current Protocols in Plant Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2016).</li>
<li>Griffiths, D. W., Bain, H., Deighton, N., Botting, N. P., Robertson, A. A. B. <a target="_blank" href="https://pubag.nal.usda.gov/pubag/article.xhtml?id=1446175">Evaluation of liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionisation-mass spectrometry for the identification and quantification of desulphoglucosinolates.</a> Phytochem Analysis. 11 (4), 216-225 (2000).</li>
<li>Gimsing, A. L., Kirkegaard, J. A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11101-008-9105-5">Glucosinolates and biofumigation: fate of glucosinolates and their hydrolysis products in soil.</a> Phytochem Rev. 8 (1), 299-310 (2009).</li>
<li>Fahey, J. W., Zalcmann, A. T., Talalay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+diversity+and+distribution+of+glucosinolates+and+isothiocyanates+among+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">The chemical diversity and distribution of glucosinolates and isothiocyanates among plants.</a> Phytochemistry. 56, 5-51 (2001).</li>
<li>de Graaf, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+4-%CE%B1-rhamnosyloxy+benzyl+glucosinolate+in+Noccaea+caerulescens+showing+intraspecific+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of 4-α-rhamnosyloxy benzyl glucosinolate in Noccaea caerulescens showing intraspecific variation.</a> Phytochemistry. 110 (0), 166-171 (2015).</li>
<li>van Dam, N. M., Raaijmakers, C. E. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00049-005-0323-7">Local and systemic induced responses to cabbage root fly larvae (Delia radicum) in Brassica nigra and B. oleracea.</a> Chemoecology. 16 (1), 17-24 (2006).</li>
<li>Gols, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1439179106000892">Temporal changes affect plant chemistry and tritrophic interactions.</a> Bas Appl Ecol. 8 (5), 421-433 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las mayores ventajas de este método establecido y ampliamente utilizado es que es robusto, bastante sencillo, y relativamente bajo costo por muestra. La mayoría de los equipos necesarios para la extracción y el análisis deben estar disponibles en un laboratorio estándar o puede ser auto-construida, con la excepción de la HPLC-PDA. Otra ventaja es que desulfoglucosinolates disueltos en agua son químicamente muy estable cuando se mantiene fresco y en viales (HPLC) estancos al aire, por lo que los extractos pueden ser fácilmente enviadas para el análisis de HPLC en otros lugares. En contraste con las plataformas LC-MS, que requieren formación y amplia experiencia práctica de la gestión del software y el análisis de los datos especializadas, HPLC-UV / PDA se pueden ejecutar con facilidad después de un corto periodo de formación. Esto no sólo reduce los costes del procedimiento, sino que también hace que este método sea más accesible a una amplia gama de los científicos, incluyendo a los estudiantes. Generalmente, cuando los procedimientos descritos anteriormente se siguen carefuLLY, deben producirse algunos problemas. En general, los picos de glucosinolatos están muy bien separados en el cromatograma. Si este no es el caso, el programa de gradiente podría adaptarse por la disminución de la tasa de aumento de acetonitrilo en el eluyente. Por otra parte, la construcción de una nueva pre-columna (200-500 inyecciones) o columna (1.500 -2.000 inyecciones) puede resolver el problema. De vez en cuando, cromatogramas de muestras individuales en un lote pueden mostrar muy pequeño o ningún pico. Esto es generalmente debido a los errores de pipeteo cuando se añade la sulfatasa (por ejemplo, una columna o se ha omitido la sulfatasa no se lava adecuadamente hacia abajo en la columna). Por otra parte, la concentración de glucosinolatos en los materiales experimentales pueden haber sido menor de lo esperado y se utilizó muy poco material para la extracción. Si el último es el caso, el volumen de inyección se puede incrementar a 100 l, o una parte alícuota exacta (por ejemplo, 800 l) del extracto puede ser concentrado. Este último podría lograrse mediante secado por congelacióning el extracto, disolviendo el residuo en un volumen más pequeño (por ejemplo, 100 l) de agua, y reinyectar usando la misma curva de referencia. En los cálculos de la concentración original del extracto, los números deben ser multiplicados por el factor de dilución. Si esto no resuelve el problema, los materiales deben ser extraídos de nuevo utilizando más material de partida. Si esta es más de 100 mg, el volumen de los disolventes de extracción y el tamaño de los tubos deben ajustarse proporcionalmente para mantener la eficacia de la extracción. Una ventaja adicional es que este método ha sido bien validado. Esto se debe a que ha sido descrito como un método estándar para la cuantificación de los glucosinolatos en semilla de colza, para los que se confirmaron los procedimientos y exactitud en varios laboratorios 16. Además, los antecedentes genéticos, la biosíntesis, y funciones biológicas de glucosinolatos están sujetas a intensos esfuerzos de investigación, en el modEL especies de plantas Arabidopsis thaliana entre otros 4, 6, 12. Por lo tanto, muchos factores de respuesta para la cuantificación exacta de desulfoglucosinolates en relación con sinigrin están bien definidos y disponibles públicamente 15,17. A pesar de que los protocolos basados en LS-MS son más de alto rendimiento, más sensible, y son capaces de (tentativamente) identificar glucosinolatos para los que no hay normas están disponibles 18, 19, 20, la falta de factores de respuesta universales para LC-MS limita la la cuantificación exacta de las concentraciones de glucosinolatos 18. Además, estos métodos generalmente no incluyen una etapa de liofilización, y la cantidad de agua en el material de planta fresca es no contabilizado en los cálculos, por lo que la cuantificación exacta difícil. Por último, porque nuestro método de extracción consiste en una columna de basela purificación y la etapa de concentración, también se puede aplicar a muestras &quot;sucias&quot; con bajas concentraciones de glucosinolatos, como los suelos 21. En comparación con los métodos basados en LC-MS que por lo general extraen recién materiales congelados, utilizan placas de 96 pocillos para la extracción, y no incluyen una etapa de sulfatasa 18, 19, nuestro método es relativamente mucho tiempo y mano de obra intensa. Con los bastidores de las columnas descritas en el presente documento, una sola persona puede extraer cerca de 100-150 muestras en un solo día. Elución (día siguiente), secado por congelación (durante la noche), y volver a disolver puede tener lugar dentro de los siguientes dos días. Con un inyector automático de HPLC, un tiempo de ejecución y el equilibrio de 40-45 minutos por inyección, y que no surjan imprevistos, se tardaría 3-4 días para adquirir los datos para este conjunto de muestras. Cuando el software de HPLC permite la cuantificación automática basada en la curva sinigrin, una comprobación manual de los cromatogramas y PEak asignaciones para 100 muestras sólo podrán tomar otro 1 o 2 horas antes de que los datos pueden ser utilizados para los análisis estadísticos. A pesar de la creciente disponibilidad de las normas de glucosinolatos, sólo una pequeña fracción de los más de 130 candidatos actualmente se puede adquirir en el comercio. Sin embargo, con algunas referencias para cada una de las clases de biosíntesis; el acceso a bases de datos bibliográficas que especifican los compuestos que se encuentran previamente en las especies de plantas (por ejemplo, Fahey et al. 22); conocimiento básico de los principios cromatográficos, tales como la lógica de la serie eluotrópica (por ejemplo, para un número creciente de Cs en la cadena lateral en los compuestos alifáticos, las Figuras 3 y 4); y la validación de las muestras individuales en LC-MS 19 o glucosinolatos aislados en RMN 23, uno puede fácilmente superar esta limitación. La mayoría de los protocolos para el análisis de glucosinolatos utilizar curvas de referencia internos(Es decir, una cierta concentración para la extracción de sinigrin o sinalbina un disolvente de extracción 16, 17, 19). Principalmente, las curvas de referencia internos son más apropiados para corregir los errores de procesamiento de muestras individuales y, por tanto, teóricamente, producir una mayor precisión. A pesar de esta ventaja, se prefiere utilizar una curva de referencia externa de cinco puntos, ya que a menudo analizamos diferentes especies silvestres, algunas de las cuales contienen altos niveles de sinigrin (por ejemplo, Brassica nigra 24) o sinalbina (por ejemplo, Sinapis alba 25), el dos referencias de glucosinolatos para el que los factores de respuesta están disponibles. Por otra parte, la adición de estándares internos para cada muestra aumenta el costo de los análisis, como patrones de referencia de glucosinolatos de alto grado suelen ser bastante caros. En conclusión, a pesar de los pasos que requieren mucho tiempo, este protocoloproporciona un método sencillo y accesible para extraer y cuantificar los glucosinolatos en muestras de plantas. Sin embargo, es importante tener en cuenta que los niveles de glucosinolatos en sí son sólo una indicación de la potencial actividad biológica, visto como la necesidad de reaccionar con mirosinasa, y la variación en los productos de reacción se pueda derivar de un único glucosinolatos 11. Los ensayos de validación deben llevarse a cabo para confirmar la relevancia biológica.

Se estima que las plantas producen más de 200.000 diferentes tipos de compuestos químicos 1. Sólo la minoría de estos compuestos parece jugar un papel en el metabolismo primario de las plantas, que alimenta el crecimiento y la reproducción; la mayoría son los denominados metabolitos secundarios. A pesar de su nombre, metabolitos secundarios son a menudo críticos para la supervivencia y reproducción de las plantas, ya que sirven para atraer a los polinizadores o defender la planta contra patógenos y herbívoros 1. Los glucosinolatos son una clase muy diversa de metabolitos secundarios que se han estudiado durante más de 150 años 2. Hasta la fecha, más de 130 glucosinolatos estructuralmente diferentes se han identificado 3. En términos generales, los glucosinolatos se pueden subdividir en diferentes clases basadas en el aminoácido de la que se sintetizan. glucosinolatos indol, por ejemplo, se sintetizan a partir del aminoácidotriptófano, mientras que la fenilalanina proporciona el esqueleto de base para la síntesis de glucosinolatos aromáticos 4. Dentro de las clases, hay un alto grado de diversidad estructural, que se produce por los pasos de elongación de la cadena secuencial en el rutas biosintéticas, tales como en la clase de glucosinolatos alifáticos, o por modificaciones de la cadena lateral (por ejemplo, hidroxilación) 4, 5. Una especie de planta de glucosinolatos pueden contener hasta 37 glucosinolatos diferentes que pertenecen a diferentes clases estructurales 6. A pesar de que las especies de plantas tienen perfiles típicos de glucosinolatos, la variación intraespecífica de los tipos de glucosinolatos se encuentran con frecuencia entre los individuos y las poblaciones 6, 7. Glucosinolatos intactos se almacenan en las vacuolas de las células vegetales y se pueden encontrar en cualquier órgano sobre el suelo o bajo el suelo 7, &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 8, 9. En caso de rotura celular (por ejemplo, por los herbívoros), glucosinolatos se liberan y se mezclan con la enzima mirosinasa, lo que desencadenó una bomba de aceite de mostaza 10. Debido a la actividad de la mirosinasa, y dependiendo de la estructura de la glucosinolatos, las condiciones de reacción, y la presencia de enzimas modificadoras, se forman diferentes compuestos picantes, tóxicos, o nocivos, tales como nitrilos y (iso) tiocianatos 11. Los productos de reacción tienen altas actividades biológicas; por ejemplo, sirven como repelentes de insectos herbívoros generalistas 12. La heredabilidad y la biosíntesis de glucosinolatos vías están bien estudiados, principalmente debido a su importancia para (glucorafanina) efectos positivos sobre la salud humana 5 herbívoro y resistencia a patógenos, su valor como componentes de sabor en mostazas y coles, y su negativo (progoitrin) y, </sup&gt; 13, 14. Debido a la gran interés en glucosinolatos como compuestos, métodos de extracción y detección biológicamente activos basados en la cromatografía líquida de alta presión de fase inversa (HPLC) equipado con radiación ultravioleta (UV) o matriz de fotodiodos (PDA) detectores se han utilizado comúnmente desde la década de 1980 15 . Sobre la base de este método, las Comunidades Europeas emitió un protocolo estándar que fue probado y validado en varios laboratorios para el análisis de los glucosinolatos en las semillas oleaginosas (Brassica napus, colza, canola 16). Otros añaden a este método (por ejemplo, mediante la determinación de los factores de respuesta adicionales para glucosinolatos que no están presentes en violación de semillas oleaginosas) 17. A pesar de la creciente disponibilidad de plataformas de líquidos (LC-MS) de espectrometría de cromatografía de masa y protocolos de alto rendimiento para el análisis de glucosinolatos 18 <sup&gt;, 19, el método HPLC-UV / PDA original, es aún ampliamente utilizado por los científicos. Las principales razones son que este método es sencillo, rentable y relativamente accesible a los laboratorios sin una extensa infraestructura de conocimiento-química analítica. Para servir a esta comunidad, que aquí detalladamente el protocolo para la extracción de glucosinolatos de materiales vegetales y el análisis de sus formas desulfo con HPLC-PDA.

<table><tbody><tr><td>Grado de gradiente de metanol HiPerSolv CHROMANORM&reg; para HPLC grado</td><td>VWR</td><td>20864.320</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio (NaOAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302406-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>1.09057.1000</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A25120-10G</td><td></td></tr><tr><td>(&minus;)-Hidrato de Sinigrin de rábano picante &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1647-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Arilo sulfatasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9626-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>20816.298</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur</td><td>Carl Roth</td><td>4518.1</td><td></td></tr><tr><td>Lana de vidrio</td><td>Carl Roth</td><td>7377.1</td><td></td></tr><tr><td>Varilla de vidrio/madera</td><td>VWR</td><td>HERE1080766</td><td></td></tr><tr><td>tubos de reacción de 2 ml</td><td>VWR</td><td>211-2120</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de disección</td><td>Carl Roth</td><td>KX93.1</td><td></td></tr><tr><td>Placas de laboratorio Rotilabo</td><td>Carl Roth</td><td>0772.1</td><td>Bandeja</td></tr><tr><td>de residuos Clips de sellado Rotilabo</td><td>Carl Roth</td><td>N217.1</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizador Freezone 12 L</td><td>Labconco</td><td>7960030</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril grado supergradiente</td><td>VWR</td><td>83639.320</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>VWR</td><td>462-5112</td><td></td></tr><tr><td>Baño ultrasónico</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB 15061</td><td></td></tr><tr><td>PH Electrodo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td> Centrífuga STARA2115 <td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004210</td><td></td></tr><tr><td>Pre-Columna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69697</td><td>Columna C18 (4,6 x 10 mm, 5 y micro; m, 300 &Aring;)&nbsp;</td></tr><tr><td>Columna Acclaim 300</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>60266</td><td>C18 columna (4,6 x 150 mm, 3 y micro; m, 300 &Aring;)&nbsp;</td></tr><tr><td>HPLC Ultimate 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>con horno de columna y detector UV o PDA</td></tr><tr><td>Matraz 1.000 mL</td><td>VWR</td><td>215-1595</td><td></td></tr><tr><td>Compuestos de referencia de glucosinolatos</td><td>Phytoplan</td><td>varios</td><td>http://www.phytoplan.de/</td></tr></tbody></table>

un método sencillo para glucosinolatos extracción y análisis de alta presión con cromatografía líquida (hplc)

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC)

Los glucosinolatos son una clase bien estudiada y muy diversa de compuestos vegetales naturales. Desempeñan un papel importante en la resistencia de las plantas, la calidad del aceite de colza, el sabor de los alimentos y la salud humana. La actividad biológica de los glucosinolatos se libera tras el daño tisular, cuando se mezclan con la enzima mirosinasa. Esto da lugar a la formación de productos de descomposición picantes y tóxicos, como isotiocianatos y nitrilos. Actualmente, se han identificado más de 130 glucosinolatos estructuralmente diferentes. La estructura química del glucosinolato es un determinante importante del producto que se forma, que a su vez determina su actividad biológica. Estos últimos pueden variar desde perjudiciales (por ejemplo, progoitrina) hasta beneficiosos (por ejemplo, glucorafanina). Cada especie de planta que contiene glucosinolatos tiene su propio perfil específico de glucosinolatos. Por esta razón, es importante identificar correctamente y cuantificar de manera confiable los diferentes glucosinolatos presentes en los cultivos de hojas, semillas y raíces brasicáceas o, para estudios ecológicos, en sus parientes silvestres. Aquí, presentamos un método bien validado, dirigido y robusto para analizar los perfiles de glucosinolatos en una amplia gama de especies de plantas y órganos de plantas. Los glucosinolatos intactos se extraen de los materiales vegetales molidos con una mezcla de metanol y agua a altas temperaturas para desactivar la actividad de la mirosinasa. A continuación, el extracto resultante se lleva a una columna de intercambio iónico para su purificación. Después del tratamiento con sulfatasa, los desulfoglucosinolatos se eluyen con agua y el eluido se liofiliza. El residuo se absorbe en un volumen exacto de agua, que se analiza mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC) con una matriz de fotodiodos (PDA) o un detector ultravioleta (UV). La detección y cuantificación se logra mediante la realización de comparaciones de los tiempos de retención y los espectros UV de los estándares comerciales de referencia. Las concentraciones se calculan sobre la base de una curva de referencia de sinigrina y factores de respuesta bien establecidos. Aquí se analizan las ventajas y desventajas de este método sencillo, en comparación con métodos más rápidos y tecnológicamente avanzados.

Este método permite la detección y separación de desulfoglucosinolates se encuentran comúnmente en todas las clases estructurales (Figura 3). El perjudiciales progoitrin 2-hydroxyglucosinolate viene relativamente temprano en el cromatograma y está claramente separada del glucorafanın glucosinolatos beneficiosa, la única methylsulfinylglucosinolate en esta muestra. Sinigrina, gluconapina, y glucobrassicanapin formar una serie eluotrópica de glucosinolatos alquenilo con longitudes de aumento de la cadena lateral (C3, C4, C5 y, respectivamente). Una serie lógica semejante es visible para los dos glucosinolatos methylthioalkenyl, glucoiberverin (C3) y glucoerucın (C4). Los picos de los tres glucosinolatos indólicos, glucobrasicina y sus derivados 4-hidroxi-1 y methoxyglucobrassicin (neoglucobrassicin), también están claramente separados. Cabe señalar que los picos de neoglucobrassicin y glucoerucın, así como gluconasturtina, la única gluco aromáticosinolate en esta muestra, son particularmente altas en este extracto Brassica debido a la adición de extractos de la raíz a la mezcla 9. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig3.jpg" /> Figura 3: Cromatograma de un extracto de glucosinolatos. Detalle (1-32 min) de un cromatograma de HPLC resultante del análisis de las muestras combinadas de raíces y brotes de Brassica nigra, B. rapa, B. y oleracea. Las etiquetas de nivel indican el tiempo de retención y las abreviaturas de desulfoglucosinolates identificados (GSL). PRO = progoitrin (2-OH-3-butenilo GSL); RAPH = glucorafanın (4-methylsulfinlybutyl GSL); SIN = sinigrin (2-propenil GSL), GNA = gluconapina (3-butenilo GSL); 4OH = 4-hydroxyglucobrassicin; IBV = glucoiberverin (3-metiltiopropilo GSL); GBN = glucobrassicanapin (4-pentenilo GSL); ERU = glucoerucın (4-methylthiobutyl GSL); GBC = glucobrasicina (indol-3-ilmetil GSL); NAS = gluconasturtina (2-feniletil GSL); NEO = neoglucobrassicin (1-MeOH-glucobrasicina). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Más largos glucosinolatos metilsulfinilo de cadena, que se encuentran comúnmente en la planta modelo Arabidopsis, también muestran una serie eluotrópica, como se ve en un extracto de raíz de Rorippa austriaca. Glucohesperalin (C6), glucosiberin (C7), glucohirsutin (C8), y glucoarabin (C9) aparece a intervalos regulares en el cromatograma (Figura 4). Junto con los espectros UV de los picos, tal serie lógica eluotrópica se puede usar para clasificar y provisionalmente identificar, glucosinolatos desconocidos. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig4.jpg" /> Figura 4: Cromatograma (marco de 9-30 min) De los desulfoglucosinolates en un extracto de raíz de Austrian Rorippa. Las etiquetas de nivel indican el tiempo de retención y las abreviaturas de desulfoglucosinolates identificados (GSL). HES = glucohesperin (6-methylsulfinylhexyl GSL); SBE = glucosiberin (7-methylsulfinylheptyl GSL); GBC = glucobrasicina (indol-3-ilmetil GSL); HIR = glucohirsutin (8-methylsulfinlyoctyl GSL); ARA = glucoarabin (9-methylsulfinylnonylglucosinolate); NEO = neoglucobrassicin (1-MeOH-glucobrasicina). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nombre común </td><td> Estructura de cadena lateral </td><td> Rt (min) * </td><td> 229 nm </td><td> referencia# </td></tr><tr><td> aliphatic glucosinolatos </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glucocapparin </td><td> metilo </td><td> 3.5 </td><td> 1 </td><td> marrón </td></tr><tr><td> sinigrin </td><td> 2-propenilo </td><td> 5.5 </td><td> 1 </td><td> Brown, CE </td></tr><tr><td> gluconapina </td><td> 3-butenilo </td><td> 9.5 </td><td> 1.11 </td><td> CE </td></tr><tr><td> Glucobrassicanapin </td><td> 4-pentenilo </td><td> 13.5 </td><td> 1.15 </td><td> CE </td></tr><tr><td> Glucoiberverin </td><td> 3-metiltiopropilo </td><td> 10.9 </td><td> 0,8 </td><td> marrón </td></tr><tr><td> glucoerucın </td><td> 4-methylthiobutyl </td><td> 14.0 </td><td> 0,9 </td><td> marrón </td></tr><tr><td> Glucoiberin </td><td> 3-methylsulfinylpropyl </td><td> 3.7 </td><td> 1.2 </td><td> marrón </td></tr><tr><td> glucorafanın </td><td> 4-methylsulfinylbutyl </td><td> 4.9 </td><td> 0,9 </td><td> marrón </td></tr><tr><td> Glucoalyssin </td><td> 5-methylsulfinylpentyl </td><td> 7.6 </td><td> 0,9 </td><td> marrón </td></tr><tr><td> Glucohesperin </td><td> 6-methylsulfinylhexyl </td><td> 10.5 </td><td> 1 </td><td> marrón </td></tr><tr><td> Glucosiberin </td><td> 7-methylsulfinylheptyl </td><td> 13.5 </td><td> 1 </td><td> marrón </td></tr><tr><td> Glucohirsutin </td><td> 8-methylsulfinyloctyl </td><td> 16.8 </td><td> 1.1 </td><td> marrón </td></tr><tr><td> Glucoarabin </td><td> 9-methylsulfinylnonyl </td><td> 20.5 </td><td> 1 </td><td></td></tr><tr><td> Glucocheirolin </td><td> 3-methylsulfonylpropyl </td><td> 4.2 </td><td> 0,9 </td><td> marrón </td></tr><tr><td> Progoitrin </td><td> 2 (R) -OH-3-butenilo </td><td> 4.5 </td><td> 1.09 </td><td> Buchner, EC </td></tr><tr><td> Gluconapoleiferin </td><td> 2-OH-5-pentenilo </td><td> 8.3 </td><td> 1 </td><td> CE </td&gt; </tr><tr><td> glucosinolatos indólicos </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4-hydroxyglucobrassicin </td><td> 4-hidroxiindol-3-ilmetil </td><td> 11.2 </td><td> 0.28 </td><td> Buchner, EC </td></tr><tr><td> glucobrasicina </td><td> indol-3-ilmetil </td><td> 15.3 </td><td> 0.29 </td><td> Buchner, EC </td></tr><tr><td> 4-Methoxyglucobrassicin </td><td> 4-metoxiindol-3-ilmetil </td><td> 18.2 </td><td> 0.25 </td><td> Buchner, EC </td></tr><tr><td> Neoglucobrassicin </td><td> 1-metoxiindol-3-ilmetil </td><td> 22.5 </td><td> 0,2 </td><td> Buchner, EC </td></tr><tr><td> glucosinolatos aromáticos </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> sinalbina </td><td> 4-hidroxibencil </td><td> 8.1 </td><td> 0,5 </td><td> Buchner </td></tr><tr><td> Glucosibarin </td><td> 2 (R) -OH-2-feniletil </td><td> 12.1 </td><td&gt; 0,95 </td><td> ver siguiente </td></tr><tr><td> Glucobarbarin </td><td> 2 (S) -OH-2-feniletil </td><td> 12.7 </td><td> 0.95 </td><td> Buchner </td></tr><tr><td> Glucotropaeolin </td><td> bencilo </td><td> 13.8 </td><td> 0.95 </td><td> Buchner, EC </td></tr><tr><td> gluconasturtina </td><td> 2-feniletilo </td><td> 18.0 </td><td> 0.95 </td><td> Buchner, EC </td></tr><tr><td> desconocido - alifáticos / aromáticos como el espectro UV </td><td></td><td></td><td> 1 </td><td> CE </td></tr><tr><td> desconocido - indol como espectro </td><td></td><td></td><td> 0.25 </td><td> CE </td></tr><tr><td colspan="5"> * Tiempo de retención aproximado (Rt) redondeado en 0,1 min (± 0,3 min dependiendo de la columna, la calidad de eluyente). Los tiempos de retención se determinan en plataformas ThermoFisher / Dionex último HPLC equipado con una columna C 18 (150 x 4,6 mm, tamaño de partícula 3 micrómetros) más C 18 </sub&gt; precolumna (10 x 4,6 mm, tamaño de partícula 5 micrómetros) con un programa de gradiente como en la Tabla 1. </td></tr><tr><td colspan="5"> # Referencias para los factores de respuesta: Buchner, R. en glucosinolatos en colza (ed JP Wathelet) 50-58 (Martinus Nijhoff Publishers, 1987); Brown, PD, Tokuhisa, JG, Reichelt, M. &amp; Gershenzon, J. Variación de la acumulación de glucosinolatos entre los diferentes órganos y etapas de desarrollo de Arabidopsis thaliana. Fitoquímica. 62 (3), 471-481, doi: 10.1016 / S0031-9422 (02) 00549-6, (2003); CE. semillas oleaginosas - Determinación de glucosinolatos cromatografía líquida de alta. Diario Oficial de las Comunidades Europeas. L 170/28. Anexo VIII 03.07.27-34 (1990). </td></tr></tbody></table> Tabla 3: Factores de respuesta de los más comúnmente encontrado desulfo-glucosinolatos en extractos de plantas y sus tiempos de retención aproximados en C 18 columnas. Eluyentes, gradient, temperatura de la columna, y la tasa de flujo como en la Tabla 1.

Aquí, describimos con gran detalle un protocolo establecido y robusto para la extracción de glucosinolatos de materiales vegetales molidos. Después de un tratamiento con sulfatasa en columna de los extractos, los desulfoglucosinolatos se eluyen y analizan mediante cromatografía líquida de alta presión.

Un método sencillo para glucosinolatos Extracción y análisis de alta presión con cromatografía líquida (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil ...

El objetivo general de este protocolo es realizar un análisis sencillo y directo de las glucosinolatos en plantas y otras muestras biológicas. Este método, para extraer y analizar glucosinolatos, puede utilizarse para responder preguntas clave en ecología planta-insecto, patología vegetal, mejora vegetal y ciencias de los alimentos. La principal ventaja de esta técnica es que está bien validada y es ampliamente aplicable a una amplia gama de muestras biológicas.Aunque este método se utiliza principalmente para cuantificar glucosinolatos en materiales vegetales, también puede aplicarse a suelos o alimentos procesados. Este procedimiento de extracción puede realizarse en casi cualquier laboratorio, ya que principalmente se usa equipo de laboratorio estándar. En general, las personas nuevas en este método realizarán mejor los análisis y la inspección si leen y observan la película al menos una vez.Para comenzar el procedimiento, mezcle 10 gramos de gel de dextrina reticulada G-25 con 125 mililitros de agua ultrapura. Almacene la mezcla en un frasco con tapa a 4 grados Celsius. Luego, disuelva 10.000 unidades del arilsulfatasa tipo H-1 en 30 mililitros de agua ultrapura.Agregue a esto 30 mililitros de etanol absoluto y mezcle bien la mezcla. Centrifugue la mezcla a 2,650 ×g durante 20 minutos a temperatura ambiente. Combine el sobrenadante con 90 mililitros de etanol absoluto en un vaso de precipitados.Mezcle y vierta en nuevos tubos de centrífuga. Centrifugue la mezcla a 1.030 ×g durante 15 minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante.Disuelva y combine los pellet en un total de 25 mililitros de agua ultrapura. Agite bien la mezcla mediante vórtex y luego transfiera la mezcla a tubos de 1 mililitro. Almacene las muestras de sulfatato a 20 grados Celsius durante hasta un año.A continuación, pese aproximadamente 90 miligramos de sinograma y registre el peso con una precisión de 1 microgramo. Luego, disuelva el sinograma monohidratado en 10 mililitros de agua ultrapura. Prepare a partir de esta solución stock de sinograma cinco soluciones de referencia con concentraciones que varían entre 50 y 750 micromolares.Almacene las soluciones de referencia en tubos de 1,5 mililitros a 20 grados Celsius. A continuación, etiquete un tubo de microcentrífuga de 2 mililitros en una posición de rack en columna para cada muestra y referencia. Perfore la tapa de cada tubo de microcentrífuga con una aguja de disección para el posterior liofilizado.Coloque los tubos etiquetados en un bloque con la misma configuración y espaciado que las columnas etiquetadas. Para preparar las columnas de pipeta de vidrio, utilice una varilla de madera o vidrio para presionar suavemente un trozo de lana de vidrio de 1 centímetro por 1 centímetro dentro de la pipeta. Compacte la lana de vidrio en la transición entre el cilindro de la pipeta y su vástago.Coloque una columna de pipeta en cada posición etiquetada del soporte. Coloque el soporte sobre una bandeja de desecho. Corte el extremo de una punta de pipeta de plástico de 1 mililitro.Agite bien el gel de dextrina preparado. Luego, utilice la punta de pipeta ensanchada para cargar 0.5 mililitros del gel de dextrina preparado en cada columna. Verifique si hay fugas de gel de dextrina en las columnas y reemplace cualquier columna que presente fugas.Una vez que todas las columnas hayan sido cargadas con gel de dextrina, lave cada columna con 1 mililitro de agua ultrapura. Pese entre 50 y 100 miligramos de material vegetal libre de almidón, finamente molido, en un tubo de reacción de 2 mililitros con tapa de seguridad, y registre el peso con una precisión de 0,1 miligramos. Coloque dos esferas metálicas de 3 milímetros de diámetro en cada tubo.Añada a cada tubo 1 mililitro de metanol al 70 % en agua ultrapura y vortexe brevemente cada mezcla. Cierre los tubos con tapas de seguridad adicionales y colóquelos inmediatamente en un baño de agua a 90-92 grados Celsius. Caliente los tubos hasta que comience a hervir la muestra.Transfiera los tubos a un baño ultrasónico y sonicar caliente las muestras durante 15 minutos. Durante la sonicación, comience a descongelar la muestra de sulfatato y las referencias de sinograma. Después de la sonicación, centrifugue las muestras a 2.700 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente.Cargue los sobrenadantes y las referencias de sinograma descongeladas en las columnas correspondientes, teniendo cuidado de no aspirar material vegetal con la pipeta. Añada 1 mililitro de metanol al 70 % a cada tubo. Agite las mezclas mediante vórtex.Y calentar las mezclas por ultrasonido durante 15 minutos. Centrifugar nuevamente los tubos en las mismas condiciones que antes. Cargar los sobrenadantes en las columnas correspondientes.Agregue dos porciones de 1 mililitro de metanol al 70 % a cada columna, dejando que las columnas se sequen completamente entre cada porción. Lave el metanol residual de cada columna con 1 mililitro de agua ultrapura. Luego, lave cada columna con dos porciones de 1 mililitro de tampón de acetato de sodio 20 milimolar, pH 5.5.Una vez que las últimas porciones del tampón de acetato de sodio hayan drenado hacia la bandeja de desecho, retire la bandeja de la cubeta de desecho y seque los pies de la bandeja con un tejido. Coloque la bandeja sobre el bloque de tubos microcentrífugos etiquetados, de modo que las puntas de las columnas queden alineadas con los tubos correspondientes. Añada 20 microlitros de solución de sulfatato a cada columna, asegurándose de que la solución alcance la superficie del material de la columna.Lave la solución de sulfatato hacia el material de la columna con 50 microlitros de tampón de acetato de sodio. Es muy importante que el sulfatato sea arrastrado hacia la columna. La enzima debe estar en la columna para reaccionar con las glucosinolatos intactas unidas a la columna.Una vez que la solución de sulfatato se haya lavado hacia abajo en cada columna, cubra las columnas con papel de aluminio. Deje reposar las columnas durante la noche. A continuación, eluya los desulfo-glucosinolatos de cada columna con dos porciones de 0,75 mililitros de agua ultrapura.Una vez que las columnas hayan quedado secas, retire el soporte de columnas y tape cada tubo. Congele los tubos en nitrógeno líquido o a 80 grados Celsius durante al menos 30 minutos. Liofilice las muestras durante 12 a 24 horas.Disuelva cada residuo en 1 mililitro de agua ultrapura. Luego transfiera cada muestra y referencia a viales etiquetados para cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Separe los extractos en una columna de fase inversa CAT.Utilice una longitud de onda de detección de 229 nanómetros. Una vez separadas por HPLC, las glucosinolatos pueden identificarse mediante la comparación de los tiempos de retención y los espectros UV con estándares conocidos de glucosinolatos. Las concentraciones de glucosinolatos en la muestra se calculan a partir de una curva de calibración de sinograma y valores de la literatura para los factores de respuesta.A partir de esto, se pueden determinar las concentraciones de glucosinolatos en la muestra vegetal original. Bajo las condiciones de HPLC utilizadas, el progoitrina nocivo eluye bastante temprano y se separa del glucorafanina biológicamente beneficioso. Los glucosinolatos endógenos también se separan adecuadamente.Se observan series liotrópicas con el aumento de las cadenas laterales para alconol, metilfol-alconol y glucosinolatos de cadena más larga como metil-sulfinol-glucosinolatos. Así, los glucosinolatos desconocidos pueden clasificarse tentativamente en función de estas series liotrópicas combinadas con los espectros UV. Con una preparación adecuada, una persona puede extraer entre 150 y 200 muestras en un día de trabajo.Se necesitará otro día para hacer referencia a las columnas, liofilizar las muestras y prepararlas para HPLC. Tras seguir este procedimiento, se pueden aplicar otros métodos, como LCMS, para identificar desulfo-glucosinolatos desconocidos en su cromatograma. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extraer glucosinolatos de sus muestras biológicas y analizarlos mediante HPLC.No olvide que trabajar con metanol puede ser extremadamente peligroso y siempre debe realizarse bajo la campana extractora.

a-straightforward-method-for-glucosinolate-extraction-analysis-with

Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

Un método simple es a condición de que permite la rápida extracción y análisis de hormonas de plantas múltiples de pequeñas muestras de tejido. El procedimiento utiliza la extracción en fase vapor de la etapa de purificación solemne. Las muestras se analizaron por GC / MS con ionización química que produce principalmente (M +1) + iones.

Monitoreo hormonas vegetales en las respuestas de estrés

En este video, demostramos la extracción de metabolitos basada en sondas SPME de un riñón de un donante previamente extraído. Los metabolitos extraídos se pueden utilizar para realizar análisis metabolómicos y lipidómicos con el fin de evaluar la calidad del órgano para el trasplante.

Muestreo de microextracción en fase sólida: una técnica basada en sondas para la extracción de muestras de tejidos de injerto

Se presenta un protocolo para la extracción completa de lípidos, metabolitos y proteínas de tejidos biológicos utilizando una muestra.

Un método de extracción fraccionada simple para el análisis comprensivo de metabolitos, lípidos y proteínas a partir de una sola muestra

Presentamos una cómoda extracción en fase sólida acoplada a cromatografía líquida de alta presión (HPLC) con detección electroquímica (ECD) para la determinación simultánea de los tres neurotransmisores monoamina y dos de sus metabolitos en la orina de los bebés. También identificamos el metabolito MHPG como un potencial biomarcador para el diagnóstico precoz de daño cerebral para los niños.

Un método conveniente para la extracción y análisis con cromatografía líquida de alta presión de los neurotransmisores catecolaminas y sus metabolitos

Este protocolo describe un rendimiento único para técnicas complementarias analíticas y ómicas que culmina en una caracterización totalmente emparejado de materia orgánica natural y proteómica microbiana en diferentes ecosistemas. Este enfoque permite comparaciones robustas para la identificación de rutas metabólicas y transformaciones importantes para describir la producción de gas de efecto invernadero y predecir las respuestas al cambio ambiental.

Técnicas analíticas de alta resolución complementarias solo rendimiento para caracterizar mezclas complejas de materia orgánica Natural

Aquí describimos fuerte anión intercambio de cromatografía líquida de alto rendimiento de [3H]-myo-inositol-etiquetado plántulas que es un método altamente sensible para detectar y cuantificar polifosfatos de inositol en las plantas.

Extracción y cuantificación de polifosfatos de inositol solubles y radiomarcados de diferentes especies vegetales utilizando SAX-HPLC

El método desarrollado de marcaje con 13C6-glucosa combinado con espectrometría de masas de alta resolución por cromatografía líquida es versátil y sienta las bases para futuros estudios sobre los órganos primarios y las vías implicadas en la síntesis de metabolitos secundarios en plantas medicinales, así como la utilización integral de estos metabolitos secundarios.

13Marcaje deC-6-glucosa asociado con LC-MS: identificación de órganos primarios de plantas en la síntesis de metabolitos secundarios

Este estudio desarrolló una cromatografía líquida de alta potencia junto con el método de espectrometría de masas triple cuadrupolar (HPLC-QQQ-MS) para identificar y cuantificar alcaloides tropanos (hiosciamina, anisodamina, escopolamina) en Anisodus tanguticus. El método resultó rápido, preciso y fiable para el análisis de alto rendimiento de plantas medicinales.

Un método eficiente y rápido HPLC-QQQ-MS para la cuantificación de alcaloides tropanos en plantas medicinales

Untargeted metabolómica ofrece una hipótesis de generación instantánea de un perfil metabólico. Este protocolo se demostrará la extracción y el análisis de los metabolitos de las células, suero, o tejidos. Una gama de metabolitos se examinó utilizando extracción en fase líquido-líquido, microflujo UltraPerformance cromatografía líquida / de alta resolución de la espectrometría de masas (UPLC-HRMS) acoplado al software de análisis diferencial.

Metabolómica no focalizados de fuentes biológicas Uso UltraPerformance cromatografía líquida-espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS)

La pared celular bacteriana está compuesta de peptidoglicano, una red macromolecular de hebras de azúcar reticuladas por péptidos. La cromatografía líquida de ultra rendimiento proporciona alta resolución y rendimiento para nuevos descubrimientos de la composición de peptidoglicanos. Presentamos un procedimiento para el aislamiento de las paredes celulares (sacculi) y su posterior preparación para su análisis a través de UPLC.

Aislamiento Y Preparación De Paredes Celulares Bacterianas Para El Análisis Compositiva Por Cromatografía Líquida De Ultra Rendimiento

Aprenda a extraer y analizar glucosinolatos en plantas mediante cromatografía líquida de alta presión. Este método validado facilita investigaciones en ecología, patología vegetal y ciencias de alimentos.

Un método sencillo para glucosinolatos Extracción y análisis de alta presión con cromatografía líquida (HPLC)

Explorar más videos