Un método sencillo para glucosinolatos Extracción y análisis de alta presión con cromatografía líquida (HPLC)

El objetivo general de este protocolo es realizar un análisis fácil y directo de los glucosinolatos en plantas y otras muestras biológicas. Este método, para extraer y analizar glucosinolatos, se puede utilizar para responder preguntas clave en ecología de plantas e insectos, patología de plantas, fitomejoramiento y ciencias de los alimentos. La principal ventaja de esta técnica es que está bien validada y es ampliamente aplicable a una amplia gama de muestras biológicas.

Aunque este método se utiliza principalmente para cuantificar glucosinolatos en materiales vegetales, también se puede aplicar a suelos o alimentos preparados. Este procedimiento de extracción se puede realizar en casi cualquier laboratorio porque se utiliza principalmente un equipo de laboratorio estándar. Por lo general, las personas nuevas en este método realizarán mejor los análisis y la inspección cuando lean y observen la película al menos una vez.

Para comenzar el procedimiento, mezcle 10 gramos de gel de dextrina reticulado G-25 con 125 mililitros de agua ultrapura. Guarde la mezcla en una botella tapada a 4 grados centígrados. A continuación, disuelva 10.000 unidades de arilsulfatasa tipo H-1 en 30 mililitros de agua ultrapura.

Agregue a esto 30 mililitros de etanol absoluto y revuelva bien la mezcla. Centrifugar la mezcla a 2.650 veces G durante 20 minutos a temperatura ambiente. Combine el sobrenadante con 90 mililitros de etanol absoluto en un vaso de precipitados.

Mezcle y vierta los tubos de centrífuga nuevos. Centrifugar la mezcla a 1.030 veces G durante 15 minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante.

Disuelve y combina los pellets en un total de 25 mililitros de agua ultrapura. Agite bien la mezcla y luego transfiera la mezcla a tubos de 1 mililitro. Almacene las muestras de sulfato a 20 grados centígrados hasta por un año.

A continuación, pese unos 90 miligramos de sinograma y registre el peso con una precisión de 1 microgramo. A continuación, disuelva el monohidrato de sinograma en 10 mililitros de agua ultrapura. Prepare a partir de esta solución madre de sinograma cinco soluciones de referencia con concentraciones que oscilan entre 50 y 750 micromolares.

Almacene las soluciones de referencia en tubos de 1,5 mililitros a 20 grados centígrados. A continuación, para cada muestra y referencia, etiquete un tubo de microcentrífuga de 2 mililitros en una posición de bastidor de columna. Perfore la tapa de cada tubo de microcentrífuga con una aguja de disección para la liofilización posterior.

Coloque los tubos etiquetados en un bloque con la misma configuración y espaciado que las columnas etiquetadas. Para preparar las columnas de pipetas de vidrio, utilice una varilla de madera o vidrio para presionar suavemente un trozo de lana de vidrio de 1 centímetro por 1 centímetro en la pipeta. Empaque la lana de vidrio en la transición del cilindro de la pipeta al tallo.

Coloque una columna de pipeta en cada posición etiquetada en la gradilla. Coloque la rejilla sobre una bandeja de residuos. Corta el extremo de una punta de pipeta de plástico de 1 mililitro.

Agite bien el gel de dextrina preparado. Y, a continuación, utilice la punta de pipeta ensanchada para cargar 0,5 mililitros de gel de dextrina preparado en cada columna. Revise las columnas para ver si hay fugas de gel de dextrina y reemplace las columnas con fugas.

Una vez que todas las columnas se hayan cargado con gel de dextrina, lave cada columna con 1 mililitro de agua ultrapura. Pese entre 50 y 100 miligramos de material vegetal finamente molido en un tubo de reacción de 2 mililitros con tapa de seguridad, y registre el peso con una precisión de 0,1 miligramos. Coloca dos esferas metálicas de 3 milímetros de diámetro en cada tubo.

Agregue a cada tubo 1 mililitro de metanol al 70% en agua ultrapura y agite brevemente cada mezcla. Cierre los tubos con tapas de seguridad adicionales y colóquelos inmediatamente en un baño de agua de 90 a 92 grados centígrados. Calienta los tubos hasta que la sierra comience a hervir.

Transfiera los tubos a un baño ultrasónico y caliente sónicamente las muestras durante 15 minutos. Durante la sonicación, comience a descongelar la muestra de sulfato y las referencias del sinograma. Después de la sonicación, centrifugar las muestras a 2.700 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Cargue los sobrenadantes y las referencias de sinograma descongeladas en las columnas correspondientes, teniendo cuidado de no arrastrar materia vegetal en la pipeta. Agregue 1 mililitro de metanol al 70% a cada tubo. Vórtice las mezclas.

Y calentar las mezclas por ultrasonidos durante 15 minutos. Vuelva a centrifugar los tubos en las mismas condiciones que antes. Cargue los sobrenadantes en las columnas correspondientes.

Agregue dos porciones de 1 mililitro de metanol al 70% a cada columna, permitiendo que las columnas se sequen entre cada porción. Lave el metanol residual de cada columna con 1 mililitro de agua ultrapura. A continuación, lavar cada columna con dos porciones de 1 mililitro de tampón de acetato de sodio de 20 milimolares, pH 5,5.

Una vez que las últimas porciones de tampón de acetato de sodio se hayan drenado en la rejilla de residuos, retire la rejilla de la bandeja de basura y seque los pies de la rejilla con un pañuelo de papel. Coloque la rejilla sobre el bloque de tubos de microcentrífuga etiquetados, de modo que las puntas de las columnas estén en los tubos correspondientes. Cargue 20 microlitros de solución de sulfato en cada columna, asegurándose de que la solución llegue a la superficie del material de la columna.

Enjuague la solución de sulfato en el material de la columna con 50 microlitros de tampón de acetato de sodio. Es muy importante que el sulfato se lave en la columna. La enzima debe estar en la columna para reaccionar a los glucosinolatos intactos unidos a la columna.

Una vez que la solución de sulfato se haya lavado en cada columna, cubra las columnas con papel de aluminio. Deje que las columnas permanezcan en reposo durante la noche. A continuación, alude a los de-sulfo-glucosinolatos de cada columna con dos porciones de 0,75 mililitros de agua ultrapura.

Una vez que las columnas se hayan secado, retire la rejilla de la columna y tape cada tubo. Congele los tubos en nitrógeno líquido o a 80 grados centígrados durante al menos 30 minutos. Liofiliza las muestras durante 12 a 24 horas.

Disuelve cada residuo en 1 mililitro de agua ultrapura. Y luego transfiera cada muestra y referencia a viales de muestra de HPLC etiquetados. Separe los extractos en una columna CAT de fase inversa.

Utilice una longitud de onda de detección de 229 nanómetros. Una vez separados por HPLC, los glucosinolatos pueden identificarse comparando los tiempos de retención y los espectros UV con los estándares de glucosinolatos conocidos. Las concentraciones de glucosinolatos en la muestra se calculan a partir de una curva de calibración de sinograma y los valores de la literatura para los factores de respuesta.

A partir de esto, se pueden determinar las concentraciones de glucosinolatos en la muestra original de la planta. En las condiciones de HPLC utilizadas, la progoitrina no saludable alude bastante temprano y se separa de la glucorafanina biológicamente beneficiosa. Los endoglucosinolatos también están bien separados.

Se observan series liotrópicas con un aumento de los eslabones de la cadena lateral para el alconol, el metilfol-alconol y los metil-solfinol-glucosinolatos de cadena más larga. Por lo tanto, los glucosinolatos desconocidos se pueden clasificar tentativamente en función de estas series liotrópicas en combinación con espectros UV. Con la preparación adecuada, una persona puede extraer de 150 a 200 muestras en un día de trabajo.

Hará falta otro día para aludir a las columnas, liofilizar las muestras y prepararlas para la HPLC. Siguiendo este procedimiento, se pueden aplicar otros métodos, como el LCMS, para identificar desulfoglucosinolatos desconocidos en el cromatograma. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extraer glucosinolatos de sus muestras biológicas y analizarlos mediante HPLC.

No olvide que trabajar con metanol puede ser extremadamente peligroso y siempre debe hacerse debajo de la campana extractora.