Un método eficiente y rápido HPLC-QQQ-MS para la cuantificación de alcaloides tropanos en plantas medicinales

Desarrollamos un método HPLC-QQQ-MS para cuantificar rápidamente tres alcaloides tropanos principales en Anisodus tanguticus. El HPLC convencional carece de sensibilidad para alcaloides tropanos. Este método utiliza espectrometría de masas altamente sensible para resolver este problema.

Para empezar, pesa con precisión 10,0 miligramos de hiosciamina, hidrobromuro de anisodamina y bromuro de escopolamina de referencia. Colocalos en un matraz volumétrico separado de 10 mililitros. Añade metanol de grado cromatográfico a la línea marcada en cada matraz volumétrico.

Disolver los estándares a fondo con tratamiento ultrasónico para preparar soluciones estándar individuales con una concentración de 1,0 miligramos por mililitro. Luego, transfiere las soluciones de stock a botellas de reactivo marrón y guárdalas a cuatro grados Celsius en la oscuridad. Para preparar una solución intermedia estándar mixta de 10 microgramos por mililitro, se pipetean 100 microlitros de cada solución de stock previamente preparada en un matraz volumétrico de 10 mililitros.

Luego, añade metanol de grado cromatográfico a la línea marcada para diluir la solución. A continuación, realiza la liofilización de material fresco de Sophora flavescens. Luego, usando un molinillo de alta velocidad, pulveriza el material seco hasta obtener un polvo homogéneo.

Tamizar la pólvora por un tamiz estándar de 0,25 milímetros. Pesa con precisión 20 miligramos de la polvo tamizado. Transfiere a un matraz volumétrico de 100 mililitros y añade metanol de grado cromatográfico justo debajo de la línea marcada.

A continuación, realiza una extracción ultrasónica a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego, retira el matraz volumétrico y deja que se enfríe hasta 25 grados Celsius a temperatura ambiente. Añade metanol de grado cromatográfico a la línea marcada de 100 mililitros y vórtice para mezclar durante dos minutos.

Luego, pipetear un mililitro del extracto preparado en un matraz volumétrico de 100 mililitros. Añade metanol a la línea marcada. Sacude bien para mezclar bien y obtén la solución madre para la inyección de HPLC.

Para la filtración de muestras, prepare una jeringuilla desechable sin aguja de un mililitro y una membrana microporosa en fase orgánica de 0,22 micrómetros. Aspira 1,2 mililitros de la solución madre para inyectarla en la jeringuilla y filtra la solución empujándola lentamente a través de la membrana. Recoge el filtrado en un frasco de muestra de dos mililitros con un inserto interior y sella bien el frasco con una tapa.

Prepara la fase móvil A midiendo 1000 mililitros de agua ultrapura. Añade 1,0 mililitros de ácido fórmico de grado cromatográfico y mezcla uniformemente usando un agitador magnético durante 10 minutos. A continuación, preparar la fase B móvil utilizando metanol de grado cromatográfico directamente sin tratamiento adicional.

Desgasifica las fases móviles A y B a 40 kilohercios durante 15 minutos utilizando unidades de desgasificación ultrasónica separadas. Conecta las fases móviles desgasificadas en botellas de disolvente separadas a las líneas A y B correspondientes del sistema HPLC. Utiliza una columna C18 para la separación cromatográfica.

Equilibrar la columna con metanol y agua en una proporción de 80 a 20 durante 30 minutos y un caudal de 0,3 mililitros por minuto. Ajusta la temperatura del horno de columna a 30 grados Celsius y precalienta con 10 minutos de antelación. Luego, se ajusta el caudal a 0,60 mililitros por minuto, el volumen de inyección a dos microlitros y la longitud de onda de detección a 210 nanómetros.

Después de eso, establece el programa de elución de gradientes con las condiciones presentadas. Realizar detección por espectrometría de masas utilizando un espectrómetro de masas triple cuadrupolo equipado con una fuente de ionización electrospray que opera en modo de ionización positiva. Ajusta la presión del nebulizador a 15 libras por pulgada cuadrada, el voltaje capilar a 4.000 voltios, la temperatura del gas a 300 grados Celsius y el flujo de gas a 11 litros por minuto.

Luego, establece los parámetros para múltiples pares de iones de monitorización de reacción. Para identificar iones precursores, infundir directamente soluciones estándar individuales en modo de escaneo MS2. Tras la validación del método, realiza la adquisición de datos en modo de monitorización de múltiples reacciones.

Utiliza los parámetros optimizados, incluyendo el ion precursor, las transiciones de iones producto, el voltaje del fragmentador y la energía de colisión para cada analito, tal como se presenta aquí. Lanza el software de análisis cualitativo. Selecciona archivo y selecciona importar datos para importar todos los archivos recopilados.

Comprueba la simetría de picos y la consistencia temporal de retención de los picos objetivo en cada cromatograma iónico extraído. En el módulo de cuantificación, selecciona transición MRM. Introduce los pares de iones precursores y iones producto para cada componente y extrae los cromatogramas iónicos extractados correspondientes.

Calcula el área máxima para el análisis cuantitativo. Los tres alcaloides de tropano objetivo se separaron con éxito en 20 minutos bajo las condiciones optimizadas del HPLC. La resolución entre escopolamina y anisodamina fue de 8,67.

Mientras que la entre anisodamina e hiosciamina alcanzó 11,58, todos los valores de resolución superaron significativamente el criterio de separación inicial de 1,5. Todos los analitos mostraron buena linealidad en un rango de concentraciones de 0,014 a 0,320 microgramos por mililitro con coeficientes de correlación superiores a 0,99. Las recuperaciones medias fueron 101,44% para escopolamina, 100,25% para anisodamina y 99,56% para hiosciamina, con desviaciones estándar relativas de 1,85%, 2,35% y 1,9% respectivamente.

La cuantificación de tres alcaloides de tropano en 10 muestras de Anisodus tanguticus mostró que el contenido de escopolamina osciló entre 0,3667 miligramos por gramo en la muestra seis y 1,0356 miligramos por gramo en la muestra siete. El contenido de anisodamina osciló entre 0,0269 miligramos por gramo en la muestra seis y 0,3590 miligramos por gramo en la muestra 10. El contenido de hiosciamina osciló entre 0,2930 miligramos por gramo en la muestra dos y 1,4989 miligramos por gramo en la muestra 10, observándose niveles más altos en las muestras cuatro, siete, nueve y diez.

Este protocolo permite la cuantificación rápida y precisa de tres alcaloides principales de tropanos. El principal desafío es garantizar el procedimiento instrumental y la preparación estandarizada de la muestra para una medición precisa. Este método puede ampliarse para explorar y cuantificar otros metabolitos en Anisodus tanguticus.