Protocolos para la visualización androgénica, órganos y sus órganos interactivos con inmunotinción en la mosca de la fruta

El objetivo general de este procedimiento es visualizar los órganos esteroidogénicos y sus órganos interactivos en larvas o hembras adultas de la mosca del vinagre, Drosophila melanogaster. Este método puede ayudar a comprender la biosíntesis de hormonas esteroides en insectos y el mecanismo regulatorio neuronal subyacente al apareamiento y a la metamorfosis. La principal ventaja de esta técnica es que la inervación de los órganos esteroidogénicos y la porción relativa de sus órganos interactivos permanece intacta.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque los órganos esteroidogénicos en las larvas de mosca son muy pequeños y transparentes. Mi laboratorio y yo estamos contentos de compartir nuestros protocolos de disección. Así que, comencemos.

Después de preparar las larvas, inicie la disección del curso en un platillo de tres centímetros lleno con PBS, bajo un microscopio estereoscópico. Primero, sujete el gancho bucal con pinzas. Luego, utilizando tijeras microquirúrgicas, corte el cuerpo aproximadamente a un tercio de la longitud desde el extremo anterior.

A continuación, sostenga la longitud anterior con un par de pinzas y use un segundo par para empujar suavemente la punta de la cabeza hacia el interior del cuerpo, con el fin de voltear completamente el cuerpo larval al revés. Prepare hasta 20 larvas de esta manera en un lapso de 10 minutos, y luego transfiéralas a la solución fijadora. Después de 30 minutos, lave las preparaciones y continúe con la inmunotinción.

Para comenzar, deje las larvas sumergidas en agua durante aproximadamente una hora, para asfixiarlas e inmovilizarlas. Luego, coloque una larva con el lado dorsal hacia arriba en una gota de PBS sobre un recipiente recubierto de silicona. El lado dorsal presenta los dos tubos traqueales.

Bajo un microscopio estereoscópico, use pinzas para insertar un alfiler de insecto en el extremo anterior. Luego, estire el cuerpo hacia el lado posterior e introduzca un segundo alfiler en el extremo posterior. A continuación, realice una pequeña incisión cerca de la cola utilizando tijeras microquirúrgicas.

Desde la incisión, corte cuidadosamente la cutícula dorsal longitudinalmente a lo largo de la línea media dorsal, hacia la cabeza, sin dañar ninguno de los tejidos bajo la cutícula. Después de realizar la incisión, estire las paredes corporales hacia los lados y fíjelas con alfileres para insectos en las esquinas. Luego, utilizando pinzas, retire el cuerpo graso anterior y las glándulas salivales, exponiendo así el complejo cerebro-glándula anular en la superficie.

Ahora, aspire el PBS e introduzca la preparación en solución fijadora. Después de 30 minutos, use pinzas para retirar los alfileres con insecto y transfiera la preparación a un microtubo lleno con PBT al 0,3 %. A continuación, continúe con la inmunotinción.

Después de la inmunotinción de las larvas, utilice una pipeta desechable para transferir las muestras a un recipiente lleno con PBT al 0,3 %. Bajo un microscopio estereoscópico, sujete la cutícula o el gancho bucal con un par de pinzas. Luego, utilice una aguja de calibre 27 conectada a una jeringa de un mililitro, como si fuera un cuchillo, para extraer el complejo de cerebro, glándula en anillo y disco ocular de la cutícula corporal, cortando la punta anterior del esófago y los discos oculares.

A continuación, utilizando fórceps, separe cuidadosamente el esófago y el intestino del complejo de disco cerebral-glándula en anillo-disco ocular. Tire del intestino hacia el lado posterior, ya que el esófago atraviesa el cerebro por encima del cordón nervioso ventral. Finalmente, para aislar el complejo cerebro-glándula en anillo, corte cuidadosamente las conexiones entre el disco cerebral, los discos oculares y los discos de las patas, con un cuchillo de aguja.

Es bastante esencial usar pinzas finas con bordes afilados durante la disección. Recomiendo encarecidamente que afilé las pinzas con una piedra de amolar para ajustar sus bordes sin dejar espacios. Para transferir las muestras, utilice una micropipeta con una punta de gran diámetro.

Deposite las muestras en el centro del portaobjetos de vidrio. Luego, utilice pinzas para colocar las muestras sobre su lado ventral, de modo que la glándula anular, que se encuentra en el lado dorsal del cerebro, pueda ser observada. A continuación, incline el portaobjetos y elimine la mayor cantidad posible del exceso de PBT.

Luego, coloque una gota de reactivo de montaje cerca de las muestras y use pinzas para bajar lentamente una lámina de cubierta sobre el reactivo y después sobre las muestras. Para diseccionar el ovario de hembras adultas, anestesie las moscas con gas de dióxido de carbono. A continuación, corte sus cabezas y transfiera sus cuerpos a una placa de tres centímetros llena con PBS.

A continuación, bajo un microscopio estereoscópico, agarre el lado dorsal del tórax con pinzas y sostenga el segmento abdominal A-5 o A-6 con un segundo par de pinzas. Luego, retire cuidadosamente la cutícula abdominal hacia el lado posterior. Antes de continuar, limpie la cutícula pegajosa de las pinzas.

A continuación, pellizque un oviducto e aísle el ovario. Luego, peine y extienda las puntas del ovario usando pinzas. Una vez extendido, sumerja el ovario en solución fijadora durante 30 minutos, para prepararlo para la tinción.

Para elaborar una preparación que mantenga la inervación del ovario, transfiera moscas hembra anestesiadas a un recipiente recubierto de silicona lleno con PBS. Bajo el microscopio de disección, sostenga el probóscide y retire la cutícula de la cabeza para exponer el cerebro. Del cerebro, elimine la tráquea conectada, dejando el cerebro unido a la cuerda nerviosa ventral.

Luego, sostenga el tórax por el lado dorsal y retire las patas y alas. A continuación, retire la cutícula ventral del tórax, comenzando por la base de cada pata. Una vez expuesta la CVM, retire con mucho cuidado la cutícula dorsal residual y los músculos adheridos a la CVM, utilizando pinzas.

No dañe las conexiones entre el cerebro y el cordón nervioso ventral (VNC). A continuación, utilizando pinzas, retire la cutícula abdominal para exponer los ovarios y sus órganos asociados, que incluyen el prop, el intestino, el oviducto, el útero y la glándula accesorio. Por último, elimine cualquier tejido residual, incluyendo la tráquea y el cuerpo graso.

Luego, sumerja las muestras en solución fijadora durante 30 minutos para prepararlas para la inmunotinción. Después de la inmunotinción, transfiera las muestras a un portaobjetos de vidrio con PBT al 0,1 % utilizando una micropipeta. A continuación, observe el portaobjetos con un microscopio y separe los cordones de los ovariolos entre sí utilizando pinzas.

No dañe las puntas de los ovaríolos durante este proceso. Ellos contienen los germarios. Al preparar el complejo del cerebro con los órganos reproductivos, elimine cualquier cutícula residual y extienda las estructuras sobre el portaobjetos.

A continuación, retire la mayor parte del exceso de PBT y luego aplique una gota de reactivo de montaje sobre la muestra. A continuación, coloque lentamente una laminilla sobre el portaobjetos utilizando pinzas y almacene el portaobjetos a cuatro grados celsius en la oscuridad. Posteriormente, observe las muestras al microscopio y enfoque los órganos esteroidogénicos en el campo de visión.

Una vez que la vista esté fija, cambie el sistema de obtención de imágenes al modo de adquisición de imágenes. Durante las etapas larvarias, la glándula protorácica se marcó con anticuerpos contra enzimas ecdisteroidogénicas, incluyendo el anticuerpo anti-shroud. Para visualizar la conexión neuronal entre la glándula protorácica y el cerebro, se diseccionó el complejo cerebro-glándula en anillo.

El método de disección del filete muestra el sistema nervioso estomatogastrico, en el cual un grupo de neuronas serotoninérgicas proyecta hacia la glándula protorácica, el proventrículo y los músculos faríngeos. En hembras adultas, el ecdisteroide ovárico afecta muchos aspectos de la ovogénesis, como la proliferación de las CSG. Las CSG se encuentran en el germario, en el extremo de cada ovariólo en el ovario.

Dentro del germario, las CEG fueron etiquetadas específicamente utilizando dos anticuerpos, 1B1 y DE-cadherina. Para visualizar la inervación del ovario, se diseccionó el ovario junto con el cerebro, el CNC, el intestino, el prop, el útero y la espermateca. Las neuronas se visualizaron mediante mCD8:GFP bajo el control del conductor n-Synaptobrevin GAL4.

Además, la estructura de los músculos se tiñó utilizando faloídicina dicongugada. Aunque la disección de los órganos esteroidogénicos puede parecer difícil al principio, utilice este video para aprender los puntos de corte de los tejidos y aislar más fácilmente el órgano sin lesiones. Esperamos que nuestro protocolo sea informativo, no solo para principiantes, sino también para investigadores experimentados.

Una vez dominado, puede aplicar este procedimiento a su investigación y adaptarlo según sus necesidades. Esperamos que este protocolo contribuya a la comprensión integral de la biosíntesis de hormonas esteroides. Protocolos más detallados paso a paso están disponibles en el manuscrito.

Por favor, revíselo.