Protocolos para la visualización androgénica, órganos y sus órganos interactivos con inmunotinción en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster

El objetivo general de este procedimiento es visualizar los órganos esteroidogénicos y sus órganos interactivos en larvas o hembras adultas de la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster. Este método puede ayudar a comprender la biosíntesis de hormonas esteroides de insectos y el mecanismo regulador neuronal que subyace al apareamiento y la metamorfosis. La principal ventaja de esta técnica es que la inervación de los órganos esteroidogénicos y la porción relativa de sus órganos interactivos permanece intacta.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque los órganos esteroidogénicos de las larvas de mosca son bastante pequeños y transparentes. Mi laboratorio y yo nos complace compartir nuestros protocolos de disección. Entonces, comencemos.

Después de preparar las larvas, comience el curso de disección en un plato de tres centímetros lleno de PBS, bajo un microscopio de disección. Primero, agarre el gancho de la boca con pinzas. Luego, con unas microtijeras, corte el cuerpo a aproximadamente un tercio de la longitud de la punta anterior.

A continuación, sostenga la longitud anterior con un par de pinzas y use un segundo par para empujar suavemente la punta de la cabeza hacia el cuerpo, para finalmente darle la vuelta al cuerpo de la larva. Prepare hasta 20 larvas de esta manera en 10 minutos y luego transfiéralas a una solución fijadora. Después de 30 minutos, lave las preparaciones y proceda con la inmunotinción.

Para empezar, deja las larvas sumergidas en agua durante aproximadamente una hora, para que asfixien y así inmovilicen las larvas. Luego, coloque una larva con el lado dorsal hacia arriba en una gota de PBS en un plato recubierto de silicona. La cara dorsal tiene los dos tubos traqueales.

Bajo un microscopio de disección, use pinzas para insertar un alfiler de insecto en la punta anterior. Luego, estire el cuerpo hacia el lado posterior y coloque un segundo alfiler en la punta posterior. A continuación, haz una pequeña incisión cerca de la cola con unas microtijeras.

Desde la incisión, corte con cuidado la cutícula dorsal longitudinalmente a lo largo de la línea media dorsal, hacia la cabeza, sin dañar ninguno de los tejidos debajo de la cutícula. Después de hacer la incisión, estire las paredes del cuerpo y asegúrelas con alfileres para insectos en las esquinas. Luego, con fórceps, extirpe el cuerpo graso anterior y las glándulas salivales, exponiendo así el complejo de glándula del anillo cerebral en la superficie.

Ahora, aspire el PBS y sumerja la preparación en una solución fijadora. Después de 30 minutos, use pinzas para quitar los alfileres de insectos y transfiera la preparación a un microtubo lleno de 0.3% PBT. A continuación, se procede a la inmunotinción.

Después de inmunotinción de las larvas, utilice una pipeta desechable para transferir las muestras a un plato lleno de 0,3% de PBT. Bajo un microscopio de disección, sujete la cutícula o el gancho bucal con un par de pinzas. Luego, use una aguja de calibre 27 conectada a una jeringa de un mililitro, como un cuchillo, para eliminar el complejo del disco ocular de la glándula del anillo cerebral de la cutícula del cuerpo, cortando la punta anterior del esófago y los discos oculares.

A continuación, con fórceps, separe cuidadosamente el esófago y el intestino del complejo del disco ocular de la glándula del anillo cerebral. Tire del intestino hacia el lado posterior, ya que el esófago pasa a través del cerebro por encima del cordón nervioso ventral. Finalmente, para aislar el complejo de la glándula del anillo cerebral, corte cuidadosamente las conexiones entre el disco encefálico, los discos oculares y los discos de las piernas, con un cuchillo de aguja.

Es muy esencial utilizar pinzas finas con bordes afilados durante la disección. Te recomiendo encarecidamente que afiles las pinzas con un trozo de piedra de moler para unir sus bordes sin dejar huecos. Para transferir las muestras, utilice una micropipeta con una punta de diámetro ancho.

Deposite las muestras en el centro del portaobjetos de vidrio. Luego, use fórceps para colocar las muestras en sus lados ventrales, de modo que se puedan obtener imágenes de la glándula anular, que se encuentra en el lado dorsal del cerebro. A continuación, incline el portaobjetos y limpie la mayor cantidad posible del exceso de PBT.

Luego, coloque una gota de reactivo de montaje cerca de las muestras y use pinzas para bajar lentamente un cubreobjetos sobre el reactivo y luego sobre las muestras. Para diseccionar el ovario femenino adulto, anestesiar moscas con gas de dióxido de carbono. Luego, córtales la cabeza y transfiere sus cuerpos a un plato de tres centímetros lleno de PBS.

A continuación, bajo un microscopio de disección, agarre el lado dorsal del tórax con pinzas y sujete el segmento abdominal A-5 o A-6 con un segundo par de pinzas. A continuación, retira la cutícula abdominal hacia la parte posterior. Antes de continuar, limpie la cutícula pegajosa de las pinzas.

A continuación, pellizca un ovaducto y aísla el ovario. A continuación, peina y separa las puntas del ovario con unas pinzas. Una vez extendido, sumergir el ovario en solución fijadora durante 30 minutos, para prepararlos para la tinción.

Para hacer una preparación que mantenga la inervación del ovario, transfiera las moscas hembra anestesiadas a un plato recubierto de silicona lleno de PBS. Bajo el microscopio de disección, sostenga la probóscide y retire la cutícula de la cabeza para exponer el cerebro. Del cerebro, se extrae la tráquea adherida, dejando el cerebro conectado al cordón nervioso ventral.

Luego, sostenga el tórax por el lado dorsal y retire las patas y las alas. A continuación, retire la cutícula ventral del tórax, comenzando en la base de cada pata. Una vez que el VNC esté expuesto, retire con mucho cuidado la cutícula dorsal residual y los músculos unidos al VNC, utilizando fórceps.

No dañe las conexiones entre el cerebro y el VNC. A continuación, con unas pinzas, retire la cutícula abdominal para exponer los ovarios y sus órganos interactivos, que incluyen el accesorio, el intestino, el ovacuto, el útero y la glándula accesoria. Por último, elimine los tejidos residuales, incluida la tráquea, y el cuerpo graso.

A continuación, sumerja las muestras en una solución fijadora durante 30 minutos, para prepararlas para la inmunotinción. Después de la inmunotinción, transfiera las muestras a un portaobjetos de vidrio con 0,1% de PBT utilizando una micropipeta. Luego, observe el portaobjetos con un microscopio y separe los hilos de los ovarios entre sí con fórceps.

No lesione las puntas de los ovarios durante este proceso. Contienen los germarios. Al preparar el cerebro para el complejo de órganos reproductivos, elimine cualquier cutícula residual y extienda las estructuras en el portaobjetos.

A continuación, limpie la mayor parte del exceso de PBT y, a continuación, aplique una gota de reactivo de montaje a la muestra. A continuación, coloque lentamente un portaobjetos en el portaobjetos con pinzas y guarde el portaobjetos a cuatro grados centígrados en la oscuridad. Más tarde, observe las muestras bajo el microscopio y lleve los órganos esteroidogénicos al campo de visión.

Una vez fija la vista, cambie el sistema de imágenes al modo de adquisición de imágenes. Durante las etapas larvarias, la glándula protorácica se marcó con anticuerpos contra enzimas ecdiesteroidogénicas, incluido el anticuerpo anti-sudario. Para visualizar la conexión neuronal entre la glándula protorácica y el cerebro, se diseccionó el complejo de la glándula del anillo cerebral.

El método de disección de filetes muestra el sistema nervioso estomatogástrico, en el que un grupo de neuronas serotoninérgicas se proyectan a la glándula protorácica, el proventrículo y los músculos faríngeos. En las mujeres adultas, el ecdisteroide ovárico afecta muchos aspectos de la ovogénesis, como la proliferación de GSC. Las GSC se localizan en el germarium en la punta de cada ovariolo del ovario.

Dentro del germario, las GSC se marcaron específicamente con dos anticuerpos, 1B1 y DE-cadherina. Para visualizar la inervación del ovario, se diseccionó el ovario, junto con el cerebro, la VNC, el intestino, el puntal, el útero y la espermateca. Las neuronas fueron visualizadas por mCD8:GFP bajo el control del controlador n-Sinaptobrevina GAL4.

Además, la estructura de los músculos se tiñó con faloidina diconjugada. Aunque la disección de los órganos esteroidogénicos puede parecer difícil al principio, use esta película para aprender el punto de corte de los tejidos para aislar más fácilmente el órgano sin lesiones. Esperamos que nuestro protocolo sea informativo, no solo para principiantes, sino también para investigadores experimentados.

Una vez que lo domines, puedes aplicar este procedimiento a tu investigación y repasarlo para que se adapte a tus necesidades. Esperamos que este protocolo ayude a la comprensión integral de la biosíntesis de hormonas esteroideas. En el manuscrito se encuentran disponibles protocolos paso a paso más detallados.

Por favor, compruébalo.