Name: Protocolos para la visualización androgénica, órganos y sus órganos interactivos con inmunotinción en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Aprende a visualizar órganos esteroidogénicos y sus interacciones en Drosophila melanogaster mediante inmunotinción. Este protocolo permite estudiar la biosíntesis de hormonas esteroides y sus mecanismos neuronales.

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Agradecemos a Reiko Kise y Tomotsune Ameku por su apoyo técnico a este trabajo. Agradecemos también a Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, el Bloomington Drosophila Stock Center, Kyoto Stock Center (DGRC), y el Banco hibridoma Estudios del Desarrollo de las acciones y los reactivos. Este trabajo fue apoyado por becas a YSN de JSP KAKENHI la subvención Número 16K20945, La Fundación Naito, y el Premio de Investigación de Ciencias Inoue; y con una donación a RN de MEXT KAKENHI la subvención Número 16H04792.

NOTA: El esquema general de protocolos se muestra en la Figura 1. 1. La disección de la larval anillo prensaestopas (RG) NOTA: En D. melanogaster, que pertenece a Diptera cyclorrhaphous, el PG está dentro de un órgano endocrino compuesto llama la glándula anillo (RG, la Figura 2D). Puesto que es inviable que el PG se separa quirúrgicamente de otros tipos de células (discutidos más adelante), un objetivo práctico es aislar un RG intacto, sin daños por disección. <ol><li> Preparación de larvas en las etapas de desarrollo apropiadas NOTA: Para sincronizar las etapas de desarrollo de las larvas de D. melanogaster, es necesario recoger los huevos dentro de una estrecha ventana de tiempo y para recoger las larvas en los momentos adecuados. <ol><li> Recoger los huevos durante 2 h en una placa de agar de zumo de uva a 25 ° C. </li><li> Recoger recién eclosionadas 1 <sup&gt; st estadio las larvas bajo un microscopio de disección con una pinza y transferirlos a un pequeño frasco que contiene alimentos mosca de levadura / harina de maíz estándar de puré. NOTA: La edad de las larvas está representado por &quot;horas después de la puesta de huevos (hael)&quot;, &quot;horas después de la eclosión (HAH)&quot;, o &quot;L3 horas después de la ecdisis (hAL3E)&quot;. </li><li> En el punto de tiempo apropiado, recoger las larvas por etapas con un bucle de plástico desechable para evitar lesiones indeseable. Para minimizar una diferencia en la progresión del desarrollo de las larvas instar 3 rd, recoger las larvas instar 2 nd a 70 Hael (48 HAH) y permitir que se mudan en intervalos de 2 h. Después, recoger las larvas instar 3 rd dentro de 2 h después de la ecdisis L3; Este procedimiento da 0-2 larvas hAL3E. </li><li> Transferencia de las larvas por etapas para un plato lleno de solución salina tamponada con fosfato (PBS). </li><li> Enjuagar las larvas con PBS para eliminar la comida residual del cuerpo. </li></ol></li><li> Disección grueso de las larvas bajo unamicroscopio de disección <ol><li> Mantenga el gancho de la boca de una larva con unas pinzas. Cortar el cuerpo de la larva en la parte anterior de un tercio de la longitud del cuerpo utilizando micro tijeras. </li><li> Mantenga el extremo cortado del cuerpo de la larva anterior con un par de fórceps. Usando el otro par de pinzas, empuje suavemente la punta de la cabeza hacia el interior del cuerpo; este procedimiento convierte el cuerpo de la larva de adentro hacia afuera. NOTA: Este paso se puede omitir para la disección de 1 st estadio las larvas. </li><li> Repita pasos 1.2.1-1.2.2 con larvas adicional durante 5-10 min. NOTA: El número de larvas debe ser igual o inferior a 20 para ahorrar tiempo para la disección. </li></ol></li><li> Disección filete de larvas NOTA: Este método permite mantener la posición de los tejidos permanezca intacto. <ol><li> Deja larvas en el agua sólo durante 1 h. Las larvas son inmovilizado debido a la asfixia. </li><li> Ponga un lado larva dorsal en una gota de PBS en un recubrimiento de silicio-plato, con el lado dorsal hacia arriba. NOTA: El lado dorsal tiene 2 tubos traqueales que discurre longitudinalmente. </li><li> Bajo un microscopio de disección, inserte una clavija de insecto en la punta anterior de la larva usando fórceps. Estirar el cuerpo de las larvas en el lado posterior y poner un segundo pasador en la punta posterior de la larva. NOTA: Además de pasadores de insectos, una aguja hecho de un alambre de tungsteno puede ser útil 21. Una aguja puede ser embebido en una punta de pipeta a través del calentamiento para su uso como una aguja de disección. </li><li> Bajo un microscopio de disección, hacer una pequeña incisión cerca de la cola con micro tijeras. A partir de la incisión, corte la cutícula dorsal longitudinalmente a lo largo de la línea media dorsal hacia la cabeza. Tenga cuidado de no dañar los tejidos debajo de la cutícula. </li><li> Estirar la cutícula bodywall en cada lado y colocar 4 pines en cada esquina de la bodywall diseccionado. </li><li> Quitar una parte de la grasa corporal anterior con pinzas, para exponer el cerebro-RG complex ser expuesto en la superficie. Retirar un par de glándulas salivales, si es necesario. </li></ol></li><li> La fijación y tinción de tejido con inmunohistoquímica <ol><li> Poner el tercio anterior de los cuerpos de larvas (paso 1.2.2) en un microtubo de 1,5 ml lleno con 500! L de la solución de arreglo (4% de paraformaldehído en PBS). Fijar menos de 20 muestras a la vez, de lo contrario PBS asociadas a las muestras fijadas puede causar una dilución desfavorable del fijador. Para disección filete, eliminar una gota de PBS y a continuación, añadir una gota de solución de arreglo. NOTA: Para solución de arreglo, ya sea 3.7% de formaldehído o paraformaldehído al 4% pueden ser usados. </li><li> Incubar los tejidos disecados en la solución de corrección para 30 min a temperatura ambiente (RT) o, alternativamente, durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Reemplazar la solución de arreglo con 500 l de PBS y enjuague rápidamente las muestras 3 veces. Lavar las muestras con 500 l 0,3% PBT (PBS + 0,3% de etoxilato de octilfenol) durante 15 min en un agitador a RT. Para disección filete, quitar los pasadores de insectos y la transferencia de las muestras en un microtubo ml 1.5. NOTA: Para aumentar la permeabilidad de los anticuerpos en los tejidos, las muestras se tratan con 500 l 2,0% PBT durante 1-2 h en un agitador a temperatura ambiente. </li><li> Reemplazar PBT con 500! L de solución (2% de albúmina de suero bovino en PBT) de bloqueo. Se incuban las muestras durante 1,5 h en un agitador a temperatura ambiente. </li><li> Reemplazar la solución de bloqueo con 50! L de la solución de anticuerpo primario, es decir, anticuerpos diluidos en la solución de bloqueo. </li><li> Se incuban las muestras durante la noche en un agitador a 4 ° C. </li><li> Reemplazar la solución de anticuerpo primario con 500 l 0,3% PBT y enjuague rápidamente las muestras 5 veces. Se lavan las muestras 3 veces con 500! L 0,3% PBT durante 15 min cada uno en un eje de balancín a TA. </li><li> Reemplazar 0,3% PBT con 50! L de la solución de anticuerpo secundario (anticuerpos de tinte conjugado diluido en la solución de bloqueo). Para la tinción nuclear, 0,5 l de 4&#39; , 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, / ml de solución madre 0,1 mg) se añade a 50 solución l. Se incuban las muestras en un agitador durante 2 horas a RT o, alternativamente, a 4 ° C durante la noche. NOTA: Mantener las muestras en la oscuridad. </li><li> Reemplazar la solución de anticuerpos con 500 l 0,3% PBT y enjuagar 5 veces. Se lavan las muestras 3 veces con 500! L 0,3% PBT durante 15 min cada uno a TA. </li></ol></li><li> Disección Fine del complejo cerebro-RG contiene el PG y el montaje <ol><li> Usar una pipeta desechable para transferir las muestras inmunoteñidas a un plato lleno de 0,3% PBT. NOTA: Para evitar burbujas de inconvenientes durante la disección y de montaje, 0,3% PBT se puede reemplazar con PBS. </li><li> Bajo un microscopio de disección, mantenga la cutícula o la boca gancho con un par de pinzas. Usando una aguja de 27 G unida a una jeringa de 1 ml como un &quot;cuchillo&quot;, cortar la punta anterior de los discos de esófago y del ojo para eliminar el complejo disco-RG-ojo cerebro de la cutícula cuerpo. </li><li> SEPAcalificar el esófago y el intestino del complejo disco-RG-ojo cerebro con fórceps. Desde el esófago pasa a través del cerebro por encima del cordón nervioso ventral (VNC), extraiga el intestino para el lado posterior. NOTA: Para quitar los discos imaginales adicionales de las muestras, cortar las conexiones entre el cerebro, ojo discos y discos de la pierna con un cuchillo de aguja. </li><li> Repita los pasos 1.5.1-1.5.4 para otras muestras. NOTA: Para evitar restos de tejido se pegue a las muestras, transferir cada muestra completado a un plato limpio diferente lleno de 0,3% PBT o PBS. </li><li> Transferir las muestras al centro de un portaobjetos de vidrio limpio con una micropipeta. NOTA: Para 2 nd o 3 rd larvas instar, al final de una punta de la micropipeta debe estar truncado con una hoja de afeitar. </li><li> Bajo un microscopio de disección, alinee las muestras individuales con su lado dorsal hacia arriba mediante el uso de fórceps. NOTA: El RG está situado en el lado dorsal del cerebro (Figura 2A). Esta alineación facilita la especificación de muestras individuales durante la exploración. </li><li> Incline un portaobjetos de vidrio y limpie tanto el exceso de PBT como sea posible. Ponga una gota de reactivo de montaje en un lado de la corredera. Coloque el borde de una hoja de la cubierta desde el otro lado de la gota y poner la hoja de la cubierta en las muestras lentamente con unas pinzas. NOTA: Este procedimiento impide que las muestras se mueva fuera de la hoja de la cubierta. </li><li> Almacenar las muestras a 4 ° C. Mantener las muestras en la oscuridad. </li></ol></li></ol> 2. La disección del ovario en Las hembras adultas <ol><li> Preparación de las hembras adultas <ol><li> Alimentación moscas hembra con comida estándar elevado de levadura / harina de maíz durante 3-4 días para engordar el ovario. Mantener a 25 ° C. </li></ol></li><li> La disección de los ovarios de mujeres adultas <ol><li> Anestesiar hembra vuela con CO 2 gas y cortó sus cabezas. </li><li> Transferencia cuerpos volar a un plato de 3 cmlleno de PBS. </li><li> Bajo un microscopio de disección, mantenga el tórax en el lado dorsal con unas pinzas. Agarre la A5 segmento abdominal o A6 con las otras pinzas y retire la cutícula abdominal hacia el lado posterior. Limpiar la cutícula pegajosa de la punta de las pinzas. </li><li> Pellizcar un oviducto y sacar el ovario del cuerpo. </li><li> Peinar y separar las puntas del ovario con fórceps. Nota: Esta operación mejora la eficiencia de la inmunotinción. </li></ol></li><li> La disección del cerebro femenino adulto, VNC y órganos reproductores. NOTA: Este método permite que la inervación del ovario que se mantiene intacta. <ol><li> Anestesiar hembra vuela con CO 2 gas y transferirlos a un plato de silicio recubierto lleno de PBS. </li><li> Bajo un microscopio de disección, mantenga la trompa y retire la cutícula cabeza para exponer el cerebro con unas pinzas. Retire la tráquea conectado al cerebro. NOTA: El Brain es una estructura blanco y redondeado. El cerebro se conecta a la VNC en el tórax. </li><li> Mantenga el tórax en el lado dorsal y cortar las patas y las alas con un par de fórceps. Usando el otro par de pinzas, retire la cutícula tórax ventral desde las bases de las patas. Una vez que el VNC se expone, eliminar la cutícula dorsal residual y los músculos correspondientes a las utilizando fórceps VNC. Tenga cuidado de no dañar la conexión entre el cerebro y el VNC. </li><li> El uso de fórceps para despegar la cutícula abdominal y exponer el ovario y sus órganos interactivos, incluyendo las neuronas, la cosecha, el intestino, el oviducto, útero y la glándula accessary. </li><li> Eliminar los tejidos residuales incluyendo la tráquea y la grasa corporal usando fórceps. </li></ol></li><li> La fijación y tinción de tejido con inmunohistoquímica <ol><li> Transferir aproximadamente 8-10 pares de los ovarios a un microtubo de 1,5 ml lleno con 250! L de la solución de arreglo (4% paraformaldehyde en PBS) e incubar las muestras durante 30 min a TA. </li><li> Reemplazar la solución de arreglo con 500 l de PBS y enjuague rápidamente las muestras 3 veces. </li><li> Se lavan las muestras 2 veces con 500! L 0,1% PBT durante 5 min cada uno a TA. </li><li> Reemplazar PBT con 50! L de solución de bloqueo. Se incuban las muestras durante 1 h en un agitador a temperatura ambiente. </li><li> Reemplazar la solución de bloqueo con 50! L de la solución de anticuerpo primario. </li><li> Se incuban las muestras durante la noche en un agitador a 4 ° C. </li><li> Reemplazar la solución de anticuerpo primario con 500 l 0,1% PBT. Se lavan las muestras 3 veces con 500! L 0,1% PBT durante 15 min cada uno en un eje de balancín a TA. </li><li> Reemplazar 0,1% PBT con una solución de anticuerpo secundario 50 l. Para la tinción nuclear, añadir 0,5! L de DAPI 50! L de la solución. Se incuban las muestras durante 2 h en un agitador a temperatura ambiente. </li><li> Reemplazar la solución de anticuerpo secundario con 500 l 0,1% PBT. Se lavan las muestras 3 veces con 500! L 0,1% PBT<html> durante 15 min cada uno en un eje de balancín a TA. NOTA: El procedimiento de lavado se puede hacer a 4 ° C durante la noche. Mantener las muestras en la oscuridad. </li></ol></li><li> El montaje de las muestras en portaobjetos de vidrio <ol><li> Transferir las muestras a un portaobjetos de vidrio con 0,1% PBT utilizando una micropipeta. NOTA: Para evitar burbujas de inconvenientes durante la disección y de montaje, 0,1% PBT se puede reemplazar con PBS. </li><li> Para el ovario, se separan las cadenas de los ovarioles una de la otra con unas pinzas bajo un microscopio de disección. No dañar las puntas de los ovariolas que contienen los germaria. Para el complejo órgano cerebro-VNC-reproductiva, eliminar la cutícula residual y organizar la posición sobre un portaobjetos de vidrio. </li><li> Limpiar tanto el exceso de PBT como sea posible y poner una gota de reactivo de montaje en el centro de las muestras. Colocar una hoja de la cubierta lentamente utilizando fórceps. </li><li> Almacenar las muestras a 4 ° C. Mantener las muestras en la oscuridad. </li></ol></li></ol>&quot;&gt; 3. Imaging con un microscopio confocal de barrido láser <ol><li> Observar las muestras bajo el microscopio y llevar a los órganos androgénica en el campo de visión. Una vez que la vista se fija, cambiar el sistema de imágenes en el modo de adquisición de imágenes. NOTA: Los 10-20x lentes del objetivo se utilizan para obtener las imágenes del complejo cerebro-RG o todo el ovario. Alternativamente, los 40-63X lentes de objetivo (agua o inmersión en aceite) se utilizan para la visualización de la localización subcelular de las proteínas en GSCs o las inervaciones neuronales del PG y el ovario. </li><li> Configurar los parámetros de adquisición de imágenes en el software adjunto. Seleccione la combinación de la fluorescencia (por ejemplo, GFP y RFP). Por procedimiento de escaneo rápido, ajustar la potencia del láser, la sensibilidad de los detectores (Ganancia / Offset), y el tamaño del agujero de alfiler. NOTA: Para obtener imágenes de alta calidad, la potencia del láser de barrido y la sensibilidad del detector (Ganancia) deben optimizarse para cada muestra. Para delinear la formade los tejidos, a-luz transmitida imagen puede tomarse además de una imagen fluorescente. </li><li> Tome pilas Z de las imágenes. Durante una exploración rápida continua, mover el plano focal con el mando de enfoque del microscopio y establecer la posición inicial y la posición final. El número de rebanadas y la distancia de intervalo entre las rebanadas se ajustan en consecuencia. </li><li> Seleccione la velocidad de exploración, el método de exploración, y el modo de exploración bidireccional. </li><li> &quot;Comenzar las exploraciones reales&quot; para la adquisición de imágenes. </li><li> Guarda la imagen con el formato del software adjunto. NOTA: Los archivos de imagen originales contienen la información de los parámetros de adquisición de imágenes y escalas. Imágenes exportadas pueden procesarse utilizando un software de procesamiento de imágenes en el ordenador 22. </li></ol>

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<li>Niwa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-molting+glossy%2Fshroud+encodes+a+short-chain+dehydrogenase%2Freductase+that+functions+in+the+%26%2334%3BBlack+Box%26%2334%3B+of+the+ecdysteroid+biosynthesis+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the &#34;Black Box&#34; of the ecdysteroid biosynthesis pathway.</a> Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).</li>
<li>Komura-Kawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+Zinc+Finger+Transcription+Factor+Ouija+Board+Controls+Ecdysteroid+Biosynthesis+through+Specific+Regulation+of+spookier%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genet%22%5BJournal%5D)">The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier.</a> PLOS Genet. 11 (12), e1005712(2015).</li>
<li>Yamanaka, N., Marqués, G., O'Connor, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle-Mediated+Steroid+Hormone+Secretion+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Vesicle-Mediated Steroid Hormone Secretion in Drosophila melanogaster.</a> Cell. 163 (4), 907-919 (2015).</li>
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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Se estudió la biosíntesis ecdisteroide y su mecanismo de regulación en D. melanogaster, e ideó un protocolo para la disección y la inmunotinción. El momento de la biosíntesis de ecdiesteroide se ve afectada por las señales ambientales a través de entradas neuronales 33, por lo que es esencial para mantener la inervación de los órganos ecdysteroidogenic junto con el cerebro, VNC, y otros tejidos durante la disección. Como se describió anteriormente, el D. ...

En los organismos multicelulares, un grupo de células está dotado de una función especializada en su actividad biogénica que es esencial para todo el cuerpo. Para cumplir su cometido, cada tejido u órgano expresa una serie de genes relacionados con sus funciones y se comunica con otros tejidos para orquestar sus actividades en el contexto del desarrollo. Para caracterizar este tipo de funciones celulares especializadas y las interacciones entre órganos, tenemos que especificar un grupo de células junto con otros tipos de células que se mantienen intactos en la arquitectura multicelular. Un ejemplo de tales órganos especializados es un órgano steroidogenic, donde muchos enzimas biosintéticas median los pasos de conversión de colesterol a las hormonas esteroides activos 1. La mayoría de estos genes de enzimas se expresan específicamente en órganos esteroidogénicas, y la ruta de biosíntesis está estrechamente regulada por muchos estímulos externos a través de entradas humorales y entradas neuronales. Una vezsintetizados, las hormonas esteroides se secretan en la hemolinfa y se dirigen a muchos tejidos y órganos para la regulación de la expresión de una variedad de genes 2. Por lo tanto, la acción de una hormona esteroide induce una respuesta sistémica a mantener la homeostasis, el crecimiento y la reproducción. Para investigar las funciones de la biosíntesis de la hormona esteroide y las acciones pleiotrópicos de las hormonas esteroides, Drosophila melanogaster se puede utilizar como un sistema modelo adecuado. Durante las etapas larvales, la hormona esteroide insecto, ecdiesteroide, se biosintetiza en un órgano endocrino especializada llamada la glándula prothoracic (PG) 3. En el PG, varias enzimas ecdysteroidogenic catalizan específicamente los múltiples pasos de conversión de colesterol a ecdisona, que controla la muda y la metamorfosis en las etapas de desarrollo apropiadas 4. Por lo tanto, se regula un cambio dinámico en el título de ecdiesteroidepor muchas vías de señalización en respuesta a señales ambientales. Por otra parte, en la etapa adulta, ecdiesteroide desempeña papeles esenciales en la fisiología, incluyendo la reproducción, el sueño, la memoria, y la vida útil 5, 6, 7, 8. Se sabe que ecdiesteroide se biosintetiza activamente en el ovario, la regulación de la progresión de la ovogénesis 6, 7, 8, 9, 10, 11. Recientemente hemos informado de que el número de células madre de línea germinal (GSCS) se ve afectada por la señalización de péptido ecdiesteroide y sexo en respuesta a los estímulos de acoplamiento 12. Las potentes herramientas de D. melanogaster genética y la biología celular, incluyendo información sobre el genoma bien anotado, gen binariosistemas de expresión, y técnicas de ARNi transgénicos, nos han permitido identificar genes esenciales para la biosíntesis de ecdisteroide en el PG y el ovario 13, 14, 15. Una vez identificados los genes ecdysteroidogenic, la regulación transcripcional de estos genes y las localizaciones dinámicas de productos génicos puede ser examinado en la ruta de biosíntesis 16. Para este propósito, la transcripción-PCR cuantitativa en inversa, ARN hibridación in situ, y el análisis inmunohistoquímico se llevan a cabo. La aplicación de estas técnicas incluye una tarea difícil; la elaborada disección de la PG o el ovario. En particular, la PG de la mosca de la fruta es relativamente menor que la de otros insectos (por ejemplo, el gusano de seda y la mosca de golpe), por lo que uno tiene que practicar la habilidad vital de mosca de la fruta de disección para el muestreo. Además, ambos órganos reciben inervación ecdysteroidogenics desde el sistema nervioso central (CNS) 17, 18, 19, 20. Por lo tanto, para los análisis anatómicos precisos, los órganos ecdysteroidogenic deben mantenerse intacta junto con el sistema nervioso central y otros órganos, para no interrumpir sus conexiones neuronales. Aquí nos proporcionan protocolos para la disección y la visualización de los órganos androgénica en D. melanogaster. El aprendizaje de la técnica de disección es el punto de partida clave para estos experimentos. Además, se puede etiquetar con éxito los órganos esteroidogénicas, así como sus órganos interactivos con varios anticuerpos y líneas Gal4 conductor. Tomando ventaja de estas técnicas, materiales, y la genética, se puede estudiar los mecanismos integrales de la biosíntesis de la hormona esteroide.

<table><tbody><tr><td><plato > cultivo de huevos</tejido fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(55 mm)</td><td>AS ONE</td><td>1-8549-02</td><td>&nbsp; para platos de agar jugo de uva</td></tr><tr><td>taza de recolección</td><td>HIKARI KAGAKU</td><td></td><td></td></tr><tr>pasta<td>de levadura</td><td>Levadura seca oriental, Tokio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% jugo de uva</td><td>Welch Food Inc.</td><td></td><td></td></tr><larvas <tr><td>> cría fuerte</viales fuertes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pequeños (12 ml, 40 veces; 23,5 mm, PS)</td><td>SARSTEDT</td><td>58.487</td><td></td></tr><tr><td>lazo desechable</td><td>AS ONE</td><td>6-488-01</td><td></td></tr><tr><td>alimento estándar para</td><td></td><td></td> moscas<td>&nbsp; el recepi nosotros en el sitio web del centro de valores de Blooington.</td></tr><tr><td><Microscopio >></td><td></td><td></td><td></td>disección fuerte</disección fuerte</tr> <tr><td></td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td>Placa de</tr> cultivo de tejidos <tr><td></td><td>Leica</td><td>S8 AP0</td><td></td></tr><tr><td>(35 x 10 mm, sin tratar)</td><td>IWAKI</td><td>1000-035</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>TORAY</td><td></td><td>silicona coarting dentro de placas</td></tr><tr><td>Aguja Terumo (27G, 0,40 x 19 mm)&nbsp;</td><td>TERUMO</td><td>NN-2719S</td><td>Un "cuchillo" para cortar las pinzas de tejido</td></tr><tr><td>, Inox, #5</td><td>Dumont, Suiza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>alfiler de insectos (0,18 mm de diámetro)</td><td>Marca</td><td></td> Shiga para <td></td></tr><tr><td>micro tijeras de</td> disección de filetes <td>NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.</td><td>MB-50-10</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>fijación</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>agua ultrapura</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td></td></tr> solución <tr><td>salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Nacalai tesque</td><td>16222-65</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Nacalai tesque</td><td>02890-45</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Nacalai tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>microtubos (1,5 ml)</td><td>INA OPTIKA</td><td>CF-0150</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Incubación</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Como un mezclador de espinas TM-300 (balancín)</td><td>Como un</td><td>balancín</td><td>TM-300</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>SIGMA</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>anticuerpo primario</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-Sro (conejillo de indias), 1:1000</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP (conejo), 1:1000</td><td>Sondas moleculares</td><td>A6455</td><td>Shimada-Niwa ans Niwa, 2014</td></tr><tr><td>anti-GFP (mAb de ratón, GF200), 1:100</td><td>Nakarai tesque</td><td>04363-66</td><td></td></tr><tr><td>anti-5HT (conejo), 1:500</td><td>SIGMA</td><td>S5545</td><td></td></tr><tr><td>anti-Hts 1B1 (ratón)</td><td>Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo (DSHB)</td><td>1B1</td><td></td></tr><tr><td>anti-DE-cadherina (rata), 1:20</td><td>DSHB</td><td>DCAD2</td><td></td></tr><tr><td>anti-nc82 (ratón), 1:50</td><td>DSHB</td><td>nc82</td><td></td></tr><tr><td><anticuerpo fuerte>secundario</anticuerpo secundario fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-conejo IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugado</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra IgG (H+L), conjugado con Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-rata IgG (H+L) de cabra, conjugado con Alexa Fluor 546 Life</td><td>Technologies</td><td>A-11081</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-cobaya IgG (H+L) de cabra, conjugado Alexa Fluor 555</td><td>Life Technologies</td><td>A-21435</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 faloidina conjugada con colorante</td><td>Life Tecnologías</td><td>A-22283</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Reactivos de montaje</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro portaobjetos</td><td>de vidrio Matsunami Glass Ind.,Ltd.</td><td>SS7213</td><td></td></tr><tr><td>Cubierta de cristal de microscopio cuadrado</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td></td><td></td>C218181</tr><tr><td>Reactivo FluorSave (Reactivo de montaje)</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferencia 1 ml (Gotero desechable)</td><td>WATSON</td><td>5660-222-1S</td><td></td></tr><tr><td>imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700 sistema de microscopio de barrido láser</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>invertido Axio Observer. Z1 SP izquierda</td></tr><tr><td><fuerte>procesamiento de imágenes</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700 ZEN</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Es una interfaz de usuario especial basada en el sistema operativo Microsoft Windows7 de 64 bits</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly stocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>w; GMR45C06-GAL4</td><td></td><td></td><td>&nbsp; del Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)</td></tr><tr><td>UAS&ndash; GFP; UAS&ndash; mCD8::GFP</td><td></td><td></td><td>regalos de K. Ito, Universidad de Tokio.</td></tr><tr><td>w[1118]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4</td><td></td><td></td><td>ver en Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010)</td></tr><tr><td>w; UAS-mCD8::GFP</td><td></td><td></td><td>&nbsp; del Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)</td></tr><tr><td>yw;; nSyb-GAL4</td><td></td><td></td><td>&nbsp; del Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)</td></tr></tbody></table>

protocolos para la visualización androgénica, órganos y sus órganos interactivos con inmunotinción en la mosca de la fruta<em&gt; drosophila melanogaster</em

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

En los organismos multicelulares, un pequeño grupo de células está dotado de una función especializada en su actividad biogénica, la inducción de una respuesta sistémica a crecimiento y reproducción. En los insectos, la glándula larval prothoracic (PG) y las hembras adultas de juego ovario papeles esenciales en la biosíntesis de los principales hormonas esteroides llamados ecdysteroids. Estos órganos ecdysteroidogenic están inervados desde el sistema nervioso, a través del cual la temporización de la biosíntesis se ve afectada por las señales ambientales. Aquí se describe un protocolo para la visualización de órganos ecdysteroidogenic y sus órganos interactivos en larvas y adultos de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster, que proporciona un sistema modelo adecuado para el estudio de la biosíntesis de hormonas esteroideas y su mecanismo de regulación. disección hábil nos permite mantener las posiciones de los órganos ecdysteroidogenic y sus órganos interactivos, incluyendo el cerebro, el cordón nervioso ventral, y otros tejidos. La inmunotinción con unantibodies contra enzimas ecdysteroidogenic, junto con las proteínas de fluorescencia transgénicos conducidos por promotores específicos de tejido, están disponibles para marcar las células ecdysteroidogenic. Por otra parte, la inervación de los órganos ecdysteroidogenic también pueden marcarse por anticuerpos específicos o una colección de controladores de GAL4 en diversos tipos de neuronas. Por lo tanto, los órganos ecdysteroidogenic y sus conexiones neuronales pueden ser visualizadas simultáneamente por inmunotinción y técnicas transgénicas. Por último, se describe cómo visualizar las células madre de línea germinal, cuya proliferación y mantenimiento son controlados por ecdysteroids. Este método contribuye a la comprensión global de la biosíntesis de la hormona esteroide y su mecanismo de regulación neuronal.

Se utilizaron los protocolos anteriores para visualizar los órganos androgénica y sus órganos interactivos en D. melanogaster larvas y adultos hembras. El esquema general de protocolos se muestra en la Figura 1. El RG, incluyendo el PG (Figura 2D), es más pequeño y más transparente que el cerebro y se encuentra en el lado anterior-dorsal del cerebro (Figura 2A-C y 3A-E). Para etiquetar las células PG, varios grupos han generado varios tipos de anticuerpos c...

Se describe un protocolo para la disección, la fijación y la inmunotinción de órganos androgénica en Drosophila larvas y adultos hembras para estudiar la biosíntesis de hormonas esteroideas y su mecanismo de regulación. Además de los órganos androgénica, visualizamos la inervación de los órganos androgénica, así como células diana androgénica, tales como las células madre de línea germinal.

Protocolos para la visualización androgénica, órganos y sus órganos interactivos con inmunotinción en la mosca de la fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar los órganos esteroidogénicos y sus órganos interactivos en larvas o hembras adultas de la mosca del vinagre, Drosophila melanogaster. Este método puede ayudar a comprender la biosíntesis de hormonas esteroides en insectos y el mecanismo regulatorio neuronal subyacente al apareamiento y a la metamorfosis. La principal ventaja de esta técnica es que la inervación de los órganos esteroidogénicos y la porción relativa de sus órganos interactivos permanece intacta.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque los órganos esteroidogénicos en las larvas de mosca son muy pequeños y transparentes. Mi laboratorio y yo estamos contentos de compartir nuestros protocolos de disección. Así que, comencemos.Después de preparar las larvas, inicie la disección del curso en un platillo de tres centímetros lleno con PBS, bajo un microscopio estereoscópico. Primero, sujete el gancho bucal con pinzas. Luego, utilizando tijeras microquirúrgicas, corte el cuerpo aproximadamente a un tercio de la longitud desde el extremo anterior.A continuación, sostenga la longitud anterior con un par de pinzas y use un segundo par para empujar suavemente la punta de la cabeza hacia el interior del cuerpo, con el fin de voltear completamente el cuerpo larval al revés. Prepare hasta 20 larvas de esta manera en un lapso de 10 minutos, y luego transfiéralas a la solución fijadora. Después de 30 minutos, lave las preparaciones y continúe con la inmunotinción.Para comenzar, deje las larvas sumergidas en agua durante aproximadamente una hora, para asfixiarlas e inmovilizarlas. Luego, coloque una larva con el lado dorsal hacia arriba en una gota de PBS sobre un recipiente recubierto de silicona. El lado dorsal presenta los dos tubos traqueales.Bajo un microscopio estereoscópico, use pinzas para insertar un alfiler de insecto en el extremo anterior. Luego, estire el cuerpo hacia el lado posterior e introduzca un segundo alfiler en el extremo posterior. A continuación, realice una pequeña incisión cerca de la cola utilizando tijeras microquirúrgicas.Desde la incisión, corte cuidadosamente la cutícula dorsal longitudinalmente a lo largo de la línea media dorsal, hacia la cabeza, sin dañar ninguno de los tejidos bajo la cutícula. Después de realizar la incisión, estire las paredes corporales hacia los lados y fíjelas con alfileres para insectos en las esquinas. Luego, utilizando pinzas, retire el cuerpo graso anterior y las glándulas salivales, exponiendo así el complejo cerebro-glándula anular en la superficie.Ahora, aspire el PBS e introduzca la preparación en solución fijadora. Después de 30 minutos, use pinzas para retirar los alfileres con insecto y transfiera la preparación a un microtubo lleno con PBT al 0,3 %. A continuación, continúe con la inmunotinción.Después de la inmunotinción de las larvas, utilice una pipeta desechable para transferir las muestras a un recipiente lleno con PBT al 0,3 %. Bajo un microscopio estereoscópico, sujete la cutícula o el gancho bucal con un par de pinzas. Luego, utilice una aguja de calibre 27 conectada a una jeringa de un mililitro, como si fuera un cuchillo, para extraer el complejo de cerebro, glándula en anillo y disco ocular de la cutícula corporal, cortando la punta anterior del esófago y los discos oculares.A continuación, utilizando fórceps, separe cuidadosamente el esófago y el intestino del complejo de disco cerebral-glándula en anillo-disco ocular. Tire del intestino hacia el lado posterior, ya que el esófago atraviesa el cerebro por encima del cordón nervioso ventral. Finalmente, para aislar el complejo cerebro-glándula en anillo, corte cuidadosamente las conexiones entre el disco cerebral, los discos oculares y los discos de las patas, con un cuchillo de aguja.Es bastante esencial usar pinzas finas con bordes afilados durante la disección. Recomiendo encarecidamente que afilé las pinzas con una piedra de amolar para ajustar sus bordes sin dejar espacios. Para transferir las muestras, utilice una micropipeta con una punta de gran diámetro.Deposite las muestras en el centro del portaobjetos de vidrio. Luego, utilice pinzas para colocar las muestras sobre su lado ventral, de modo que la glándula anular, que se encuentra en el lado dorsal del cerebro, pueda ser observada. A continuación, incline el portaobjetos y elimine la mayor cantidad posible del exceso de PBT.Luego, coloque una gota de reactivo de montaje cerca de las muestras y use pinzas para bajar lentamente una lámina de cubierta sobre el reactivo y después sobre las muestras. Para diseccionar el ovario de hembras adultas, anestesie las moscas con gas de dióxido de carbono. A continuación, corte sus cabezas y transfiera sus cuerpos a una placa de tres centímetros llena con PBS.A continuación, bajo un microscopio estereoscópico, agarre el lado dorsal del tórax con pinzas y sostenga el segmento abdominal A-5 o A-6 con un segundo par de pinzas. Luego, retire cuidadosamente la cutícula abdominal hacia el lado posterior. Antes de continuar, limpie la cutícula pegajosa de las pinzas.A continuación, pellizque un oviducto e aísle el ovario. Luego, peine y extienda las puntas del ovario usando pinzas. Una vez extendido, sumerja el ovario en solución fijadora durante 30 minutos, para prepararlo para la tinción.Para elaborar una preparación que mantenga la inervación del ovario, transfiera moscas hembra anestesiadas a un recipiente recubierto de silicona lleno con PBS. Bajo el microscopio de disección, sostenga el probóscide y retire la cutícula de la cabeza para exponer el cerebro. Del cerebro, elimine la tráquea conectada, dejando el cerebro unido a la cuerda nerviosa ventral.Luego, sostenga el tórax por el lado dorsal y retire las patas y alas. A continuación, retire la cutícula ventral del tórax, comenzando por la base de cada pata. Una vez expuesta la CVM, retire con mucho cuidado la cutícula dorsal residual y los músculos adheridos a la CVM, utilizando pinzas.No dañe las conexiones entre el cerebro y el cordón nervioso ventral (VNC). A continuación, utilizando pinzas, retire la cutícula abdominal para exponer los ovarios y sus órganos asociados, que incluyen el prop, el intestino, el oviducto, el útero y la glándula accesorio. Por último, elimine cualquier tejido residual, incluyendo la tráquea y el cuerpo graso.Luego, sumerja las muestras en solución fijadora durante 30 minutos para prepararlas para la inmunotinción. Después de la inmunotinción, transfiera las muestras a un portaobjetos de vidrio con PBT al 0,1 % utilizando una micropipeta. A continuación, observe el portaobjetos con un microscopio y separe los cordones de los ovariolos entre sí utilizando pinzas.No dañe las puntas de los ovaríolos durante este proceso. Ellos contienen los germarios. Al preparar el complejo del cerebro con los órganos reproductivos, elimine cualquier cutícula residual y extienda las estructuras sobre el portaobjetos.A continuación, retire la mayor parte del exceso de PBT y luego aplique una gota de reactivo de montaje sobre la muestra. A continuación, coloque lentamente una laminilla sobre el portaobjetos utilizando pinzas y almacene el portaobjetos a cuatro grados celsius en la oscuridad. Posteriormente, observe las muestras al microscopio y enfoque los órganos esteroidogénicos en el campo de visión.Una vez que la vista esté fija, cambie el sistema de obtención de imágenes al modo de adquisición de imágenes. Durante las etapas larvarias, la glándula protorácica se marcó con anticuerpos contra enzimas ecdisteroidogénicas, incluyendo el anticuerpo anti-shroud. Para visualizar la conexión neuronal entre la glándula protorácica y el cerebro, se diseccionó el complejo cerebro-glándula en anillo.El método de disección del filete muestra el sistema nervioso estomatogastrico, en el cual un grupo de neuronas serotoninérgicas proyecta hacia la glándula protorácica, el proventrículo y los músculos faríngeos. En hembras adultas, el ecdisteroide ovárico afecta muchos aspectos de la ovogénesis, como la proliferación de las CSG. Las CSG se encuentran en el germario, en el extremo de cada ovariólo en el ovario.Dentro del germario, las CEG fueron etiquetadas específicamente utilizando dos anticuerpos, 1B1 y DE-cadherina. Para visualizar la inervación del ovario, se diseccionó el ovario junto con el cerebro, el CNC, el intestino, el prop, el útero y la espermateca. Las neuronas se visualizaron mediante mCD8:GFP bajo el control del conductor n-Synaptobrevin GAL4.Además, la estructura de los músculos se tiñó utilizando faloídicina dicongugada. Aunque la disección de los órganos esteroidogénicos puede parecer difícil al principio, utilice este video para aprender los puntos de corte de los tejidos y aislar más fácilmente el órgano sin lesiones. Esperamos que nuestro protocolo sea informativo, no solo para principiantes, sino también para investigadores experimentados.Una vez dominado, puede aplicar este procedimiento a su investigación y adaptarlo según sus necesidades. Esperamos que este protocolo contribuya a la comprensión integral de la biosíntesis de hormonas esteroides. Protocolos más detallados paso a paso están disponibles en el manuscrito.Por favor, revíselo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

¿Cómo los nichos y las células madre se forman durante el desarrollo es una cuestión importante con implicaciones prácticas. En...

La disección y la tinción de Drosophila Larvas Ovarios

Un método para inmunoteñir y visualizar los órganos chordotonal en larvas y pupas...

Visualización de los propioceptores<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas y pupas

Este video describe la glándula anular de Drosophila, una compleja estructura endocrina importante para la biosíntesis y secreción de ecdisteroides y otras hormonas. El protocolo presentado demuestra su disección, fijación e inmunotinción.

Disección de glándulas anulares larvariales: aislamiento de órganos endocrinos en desarrollo de Drosophila

Este video muestra un protocolo detallado de inmunotinción para visualizar defectos fenotípicos en los cuerpos de hongos de cerebros de Drosophila mutantes. El protocolo consiste en el uso de anticuerpos contra Fas2, una proteína implicada en la guía axonal que facilita el correcto desarrollo morfológico y funcional del cuerpo del hongo.

Visualización de neuronas del cuerpo de hongo en cerebros de Drosophila mediante inmunotinción

La inmunotinción es una técnica eficaz para visualizar tipos específicos de células y proteínas dentro de los tejidos. Al utilizar la sonicación, el protocolo descrito aquí alivia la necesidad de diseccionar tejidos de Drosophila melanogaster de embriones y larvas en fase avanzada antes de la inmunotinción. Proporcionamos una metodología eficiente para la inmunotinción de larvas enteras fijadas en formaldehído.

La sonicación-facilitado Inmunofluorescencia tinción de etapa tardía embrionario y larval<em&gt; Drosophila</em&gt; Tejidos<em&gt; In Situ</em

Las estructuras adultas de Drosophila se derivan de estructuras en forma de saco llamadas discos imaginales. El análisis de estos discos proporciona información sobre muchos procesos de desarrollo, incluida la determinación de tejidos, el establecimiento de límites de compartimentos, la proliferación celular, la especificación del destino celular y la polaridad celular plana. Este protocolo se utiliza para preparar discos imaginales para microscopía óptica/fluorescente.

La disección y la inmunotinción de imaginal discos de Drosophila melanogaster

Este protocolo describe la disección y el immunostaining del adulto de Drosophila melanogaster los tejidos del cerebro. Específicamente, este protocolo destaca el uso de setas neuronas cuerpo y fotorreceptor Drosophila como subconjuntos neuronal de ejemplo que pueden utilizarse con precisión para descubrir principios generales subyacentes a muchos aspectos del desarrollo neuronal.

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

El ovario del Drosophila es un sistema modelo excelente para estudiar el desarrollo del nicho de células madre. Aunque se han publicado métodos para disecar larvarios y adultos de los ovarios, disecciones de ovario pupa requieren técnicas diferentes que no han sido publicadas en detalle. Aquí describiremos un protocolo de disección, tinción y montaje pupas ovarios.

Disección y la coloración de los ovarios Pupal de Drosophila

Presentamos aquí un protocolo mejorado para la preparación de montaje completo y la inmunotensión de los testículos de Drosophila, adecuado para la microscopía confocal y también permitiendo el etiquetado reproducible y confiable. Ilustramos este protocolo por la representación y la cuantificación 3D de los experimentos del colocalization en los spermatocytes grandes S4-S5.

Inmunostaining De Todo El Monte Drosophila Testículos Para El Análisis Confocal 3D De Los Espermatocitos Grandes

En el embrión temprano de Drosophila , muchos orgánulos son móviles. En principio, se pueden obtener imágenes en vivo a través de sondas fluorescentes específicas, pero la cáscara del huevo impide la aplicación directa al embrión. Este protocolo describe cómo introducir tales sondas a través de la microinyección, y luego analizar el movimiento de orgánulos a granel a través de la velocimetría de imagen de partículas.

Visualización del tráfico dependiente de citoesqueletos de orgánulos que contienen lípidos en embriones de Drosophila

Aprende a visualizar órganos esteroidogénicos y sus interacciones en Drosophila melanogaster mediante inmunotinción. Este protocolo permite estudiar la biosíntesis de hormonas esteroides y sus mecanismos neuronales.

Protocolos para la visualización androgénica, órganos y sus órganos interactivos con inmunotinción en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal

Protocolos para la visualización androgénica, órganos y sus órganos interactivos con inmunotinción en la mosca de la fruta

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