Protocolo para la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por humanos en cultivos mixtos de neuronas y glia para pruebas de neurotoxicidad

El objetivo general de este procedimiento es diferenciar las células madre neurales derivadas de colonias de células madre pluripotentes inducidas humanamente en cultivos mixtos de células neuronales y gliales. Este modelo es adecuado para el cribado de toxicidad de fármacos y productos químicos. Este modelo in vitro se puede aplicar para evaluar las perturbaciones inducidas químicamente de las vías de señalización que se activan durante el proceso de diferenciación neuronal y glial.

La principal ventaja de este sistema es que utiliza un modelo humano derivado de células madre pluripotentes inducidas que representa una alternativa a las células cancerosas tradicionalmente utilizadas y a los cultivos primarios animales y permite estudiar la neurotoxicidad en poblaciones mixtas de células neuronales y gliales. El procedimiento será demostrado por Francesca Pistollato, nuestra postdoctorada, y Carolina Nunes, estudiante de posgrado de nuestro laboratorio. Comience por pasar las colonias de hiPSC.

Trabajando bajo un microscopio estereoscópico a cuatro aumentos X en una cabina de flujo laminar, use una jeringa de un mililitro con una aguja de calibre 30. Corta las colonias de células madre en cuadrados de unas 200 micras por 200 micras. El corte de las colonias requiere buenas habilidades manuales para obtener fragmentos de igual tamaño.

El uso de herramientas de corte disponibles en el mercado puede ayudar. A continuación, utilice una pipeta de 200 microlitros para separar los fragmentos de la colonia de la superficie del plato pipeteando suavemente el medio que se encuentra debajo para levantar las piezas. Transfiera unos 100 fragmentos de colonias a una placa de 60 milímetros recubierta de DMEM F12 de matriz calificada llena de cuatro mililitros de medio hiPSC completo.

A continuación, incubar la nueva placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Realice un cambio total de medio todos los días e inspeccione la morfología de las colonias utilizando un microscopio de contraste de fase con cuatro aumentos de X y 10X. En el día cero del procedimiento de diferenciación, refresque el medio hiPSC agregando tres mililitros de medio por placa de Petri de 60 milímetros.

A continuación, corte y separe los fragmentos de 200 micras como antes. Pipetear los fragmentos desprendidos y el medio en un tubo de 15 mililitros. Enjuague el plato con dos mililitros de medio hiPSC completo y recupere todos los fragmentos.

A continuación, centrifugar a 112 veces G durante un minuto. Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente los fragmentos en cinco mililitros de medio hiPSC EB completo. Coloque todo el volumen en una placa de cultivo de tejidos de fijación ultra baja de 60 milímetros.

Incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, revise las células con el microscopio invertido. El día uno, los cuerpos embrioides deben aparecer redondeados y distintos entre sí, como se ve aquí.

A continuación, pipetea los cuerpos embrioides y el medio de la placa y transfiérelos a un tubo de 15 mililitros. Centrifugar los cuerpos embrioides a 112 veces G durante un minuto. En el segundo día, aspire la solución de recubrimiento de matriz estándar de un plato de 60 milímetros previamente preparado y agregue cinco mililitros de medio de inducción neuroepitelial completo, o NRI, al plato.

Trabajando bajo el microscopio estereoscópico a cuatro aumentos y utilizando una pipeta de 200 microlitros, recoja alrededor de 50 cuerpos embrioides flotantes y transfiéralos a un plato recubierto. A continuación, incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, el tercer día del procedimiento de diferenciación, revise la placa bajo el microscopio con un aumento de 10X para asegurarse de que los cuerpos embrioides estén todos unidos.

A continuación, realice suavemente un cambio total del medio con el medio NRI completo. Cambie el medio NRI cada dos días hasta el día siete, cuando los agregados neuroepiteliales en forma de roseta deberían ser visibles. En el séptimo día, cubra una placa de 96 pocillos pipeteando 100 microlitros de matriz estándar diluida en medio de cultivo en cada pocillo.

En el octavo día, corte los agregados en forma de roseta en fragmentos bajo un microscopio estereoscópico con un aumento de 10X en condiciones estériles. Tenga en cuenta que las rosetas tienden a desprenderse fácilmente del plato cuando se tocan con la aguja. En este caso, desagregue parcialmente la roseta separada con la punta de la aguja.

Si las rosetas van a permanecer parcialmente adheridas, utilice una pipeta de 200 microlitros para completar el desprendimiento de los fragmentos de roseta. Los esquejes de roseta requieren buenas habilidades manuales y precisión para evitar el corte sin derivados neurexidérmicos. A continuación, recoja los fragmentos de roseta y su medio en un tubo cónico de 15 mililitros.

Enjuague el plato con dos mililitros de medio NRI para recuperar todos los fragmentos. A continuación, gire los fragmentos de roseta a 112 veces G durante uno o dos minutos. Después de aspirar el sobrenadante, vuelva a suspender suavemente el pellet en un mililitro de un X DPBS precalentado sin calcio ni magnesio.

Pipetear suavemente los fragmentos de roseta hacia arriba y hacia abajo para disociarlos parcialmente. A continuación, añada cuatro mililitros de medio NRI completo y cuente las células con azul de tripano y un contador de células automatizado. A continuación, aspire la solución de recubrimiento de matriz estándar de la placa de 96 pocillos y deposite las celdas en los pocillos a una densidad de alrededor de 15.000 celdas por centímetro cuadrado en medio NRI.

Incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. El día 10, realice un cambio total del medio utilizando un medio de diferenciación neuronal completo. Esta imagen representativa muestra rosetas después de 12 días in vitro teñidas para nestina en verde y beta tres tubulina en rojo.

Aquí, las células que se han cultivado durante 28 días in vitro se han teñido para beta tres tubulina en rojo y NF200 en verde. Esta imagen representativa muestra células neuronales diferenciadas de NSC después de 21 días in vitro teñidas para NF200 en rojo y dos en verde. Aquí, las células gliales del mismo cultivo se tiñen para GFAP en rojo.

Este histograma compara la cuantificación de células positivas de nestina, MAP dos, GFAP, ácido gamma-aminobutírico, transportador vesicular de glutamato uno y tirosina hidroxilasa positivas en derivados de IMR90 hiPSC y células diferenciadas de NSC derivadas de IMR90 hiPSC. Estas imágenes de contraste de fase tomadas con un objetivo 10X muestran células madre neuronales en diferenciación durante 21 días. Siguiendo estos procedimientos, se pueden realizar otras lecturas, como la PCR cuantitativa en tiempo real y el reanálisis multilateral, para evaluar la fisiología y el fenotipo de las células neuronales y gliales y evaluar el efecto de los productos químicos.

No olvide que el trabajo con compuestos químicos puede ser extremadamente peligroso. Es por eso que siempre se deben tomar las precauciones pertinentes usando gafas, guantes o mascarilla debajo de la campana de flujo, especialmente cuando se realizan tratamientos químicos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener una población mixta diferenciada de neuronas y células gliales a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas, lo que representa un modelo adecuado, un modelo in vitro, para el desarrollo de pruebas de neurotoxicidad.