La cuantificación tridimensional de espinas dendríticas de piramidal neuronas derivadas de células madre humanas pluripotentes inducidas

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de espinas dendríticas de neuronas perales derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos y cuantificarlas en tres dimensiones. Esto se logra tratando primero los cubreobjetos en placas de seis pocillos con poliuretano y laminina para cultivar células madre neurales. A continuación, células madre neurales diluidas en cultivo.

Los medios se platean, mediante un suave movimiento de pipeta giratoria y se permiten diferenciar hasta 70 días en cultivo. Al renovar el medio regularmente, las células se transducen con lentivirus GFP teñido con anticuerpos anti GFP y se visualizan. Finalmente, se fijan los cultivos y se obtienen imágenes de las espinas dendríticas mediante microscopía confocal.

En última instancia, los datos de imagen de las espinas dendríticas humanas se reconstruyen en 3D para su clasificación y cuantificación. Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para obtener neuronas glutamatérgicas de la capa dos a cuatro de la corteza cerebral humana. Implica el uso de células madre neurales derivadas de células madre prepotentes inducidas humanas que se originan a partir de fibroblastos humanos según el método publicado anteriormente.

La principal ventaja de esta técnica de nuestros métodos existentes es que permite la segmentación automática de DON a la derecha y PY en 3D. Esto con una ganancia de tiempo apreciable en comparación con los softwares existentes, que generalmente se preparan solo a partir de análisis 2D. El donr y espiar en las clasificaciones es muy práctico y fácil de usar también.

Para preparar cultivos neuronales, coloque tapas de vidrio en seis platos de cultivo de pocillos y agregue la poliornitina para incubar durante la noche bajo una campana de flujo al día siguiente. Use DPBS para lavar los cubreobjetos tres veces y agregue laminina incubada debajo de una campana de flujo durante al menos 10 horas. Prepare un medio de cultivo que contenga los siguientes componentes.

A continuación, utilice el medio para colocar y enviar células madre neurales o NSCS a una densidad de 50.000 células por centímetro cuadrado Pipeteo con movimientos giratorios lentos para reducir la agrupación de células para transducir neuronas humanas derivadas de IPSC. En cualquier etapa de maduración, agregue un microlitro de una solución madre que contenga 40 nanogramos de vector lentiviral GFP por pocillo de cultivo que contenga medio de cultivo fresco e incube a 37 grados Celsius durante 48 horas. Para preparar las células para la inmunofluorescencia, retire el medio de cultivo y use formaldehído al 4% para fijar las células transducidas a temperatura ambiente durante 10 minutos.

A continuación, utilice un XPBS para lavar las células tres veces durante 10 minutos cada una. A continuación, sumerja los cubreobjetos en PBS suplementado con 0,05 % Triton X 110 % de suero de caballo e incube a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, utilice PBS para lavar las fundas tres veces.

Agregue un anticuerpo primario número 1000 GFP en 100 microlitros de suero PBS 4% horse a cada cubreobjetos. Incubar en una caja oscura a cuatro grados centígrados durante la noche. Ahora diluya Alexa Fluor 4 88 anticuerpo conjugado uno a 200 en PBS 0.5% entre 20, e incube las células con la solución de anticuerpos a temperatura ambiente durante una hora después de usar PBS para lavar los portaobjetos tres veces.

Utilice el medio de montaje para montar los portaobjetos para la microscopía de fluorescencia. Bajo un microscopio confocal, seleccione al menos 10 neuronas sanas por condición con una morfología parametálica y una arborización dendrítica plegada para cuantificar de 60 a 100 micrómetros por dendrita. Adquiera imágenes con un objetivo de aceite de 40 x na, 1,3 y un láser de 488 nanómetros con una potencia máxima típica a nivel de muestra de alrededor de 20 microvatios, establezca el tamaño de píxel en torno a 80 nanómetros para espinas dendríticas muestreadas correctamente.

Para muestrear todo el volumen de neuronas, adquiera una pila Z con un espaciado Z de 150 a 300 nanómetros, produciendo de 20 a 30 cortes Z para llevar a cabo la cuantificación 3D de las espinas dendríticas. Utilice los siguientes ajustes para el software de análisis para el preprocesamiento. Utilice el filtrado gaussiano eligiendo el filtro gaussiano de suavizado de procesamiento de imágenes.

Establezca el ancho del filtro igual al tamaño de píxel en el plano XY para realizar un trazado semiautomático de dendritas desde el módulo trazador de filamentos. En la pestaña Corte, utilice la herramienta de distancia para estimar el diámetro de la dendrita. A continuación, en la pestaña superado, haga clic en la herramienta filamentos y elija omitir la creación automática para una mejor robustez en la pestaña de dibujo.

Ahora se presenta, seleccione la ruta automática como método, la dendrita como tipo e ingrese el diámetro estimado de la dendrita. Usando el modo de selección del puntero, convierta el cursor en un cuadro y elija shift y haga clic con el botón derecho en el punto de inicio de la dendrita. El software realizará los cálculos iniciales.

Ahora mueva el puntero a lo largo de la dendrita desde el punto de inicio. Se muestra una línea amarilla que representa la ruta de dendrita más probable. Presione shift y a la izquierda.

Haga clic en el punto final de la dendrita para llevar a cabo la segmentación automatizada de la columna vertebral en la interfaz del módulo. Haga clic en la pestaña de creación en la lista desplegable de reconstrucción. Elija reconstruir el diámetro de la dendrita y marque la casilla mantener datos.

A continuación, haga clic en reconstruir. Establezca el umbral para que el volumen segmentado corresponda al volumen real de dendritas. Como algoritmo, seleccione la distancia más corta del mapa de distancias.

A continuación, haga clic en el botón siguiente debajo de la pestaña de corte, determine el lomo más pequeño, el diámetro de la cabeza y la longitud máxima. Luego, en la pestaña de superación, ingrese los valores de los parámetros alrededor de 200 a 300 nanómetros para el diámetro mínimo y cuatro micrómetros para la longitud máxima son buenos puntos de inicio sin marcar la casilla permitir espinas, haga clic en el botón siguiente. A continuación, ajuste el umbral de puntos de inicialización para que los puntos azules que representan las espinas se localicen en las cabezas de las espinas reales.

A continuación, haga clic en Siguiente. Ahora se realizará el cálculo del núcleo y puede llevar tiempo clasificar las espinas en la pestaña de herramientas de la interfaz del módulo, haga clic en clasificar la columna. Después de verificar que hay cuatro clases como se describe en el protocolo de texto, la interfaz del módulo generará cuatro nuevos objetos de filamento con los resultados de la clasificación.

Finalmente, exporte los datos estadísticos en la pestaña de estadísticas haciendo clic en exportar todas las estadísticas a archivo. Esta figura ilustra el cultivo de neuronas humanas marcadas como anticuerpo anti beta tres tubulina. La tendencia a la agrupación de células también es evidente aquí.

Aquí se muestra una neurona parametálica etiquetada con GFP 40 días después de la diferenciación de un progenitor cortical tardío. De las capas corticales superficiales. El recuadro muestra un aumento más bajo con el cuerpo aparente de la célula.

Estos paneles representan la reconstrucción en 3D de segmentos de espinas dendríticas en diferentes etapas de maduración. Aquí se muestra el análisis cuantitativo de la densidad y el volumen de la cabeza de la columna. Como era de esperar, estos dos parámetros aumentan a lo largo del período de cultivo.

Al intentar el procedimiento de cultivo, es importante colocar y despachar con mucho cuidado las células madre neurológicas agregando células lentamente con un suave movimiento giratorio para reducir la colina celular. De hecho, este método requiere la identificación de neuronas individuales.