Name: Replacado posterior a la diferenciación de las neuronas derivadas de células madre pluripotentes humanas para la detección de alto contenido de la neuritogénesis y la maduración de la sinapsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: Aprende el replacado de neuronas derivadas de células madre pluripotentes humanas para análisis de alto contenido. Este método optimiza la incubación con proteasa para mejorar la viabilidad celular y facilitar el estudio de la neuritogénesis y la maduración sináptica.

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Este trabajo es un componente de los Grupos Nacionales de Investigación Celular Reprogramada De Cooperativa (NCRCRG) para estudiar enfermedades mentales y fue apoyado por la subvención de NIH U19MH1 2015-0644. El trabajo inicial también fue apoyado por la concesión de NIH NS070297. Agradecemos a los Doctores Carol Marchetto y Fred Gage, The Salk Institute, por proporcionar la línea WT 126 de células progenitoras neuronales, y a los doctores Eugene Yeo y Lawrence Goldstein, UC San Diego, por proporcionar la línea CVB WT24 de células progenitoras neuronales. Agradecemos a Deborah Pre en el laboratorio de la Dra. Anne Bang, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, por discusiones útiles.

1. Período de diferenciación antes de la replacación
<ol><li>Diferenciar las neuronas en platos de 10 cm, utilizando un protocolo de elección7,8 hasta que las neuronas han formado una red gruesa con sus procesos y expresar no sólo los primeros marcadores neuronales como MAP2 o TuJ1, sino también marcadores tardíos como NeuN.</li>
	<li>
Cambiar la mitad del medio de elección cada 4 días durante el proceso de diferenciación neuronal. NOTA: Los cambios medios más extensos o frecuentes diluyen los factores tróficos esenciales y podrían desfavorecer la maduración.<ol>
<li>Para las neuronas WT126 derivadas de iPSC, utilizar los siguientes medios de cultivo posteriores a la diferenciación: suplemento de 5 ml 100x N2, 10 ng/ml BDNF, 10 ng/mL GDNF, 1 g/ml de laminin, ácido ascórbico de 200 m, 1 m de dibutiryl-cAMP y 10 ml DeM1 para el medio de águila modificado de 500 ml de Dulbecco/ mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12). Poco a poco, utilizando cambios de medios medios, reemplazar con medio basal neural (Tablade Materiales)y los mismos suplementos.</li>
		<li>Para las neuronas CVB WT derivadas de iPSC, utilice el siguiente medio de cultivo posterior a la diferenciación: 500 ml basal neural A medio (Tablade materiales)y 500 mL DMEM/F12 medio con 2 g/ml de laminina, suplemento de glutamina de 10 ml (Tablade materiales), 0,75 mg/ml de bicarbonato sódico, 5 ml de aminoácidos no esenciales de medio esencial mínimo (MEM), ácido ascórbico de 0,2 mM, 10 ng/ml BDNF, 20 ml 50x B27 y suplemento de 10 ml 100x N2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Recubrimiento Multiwells
<ol><li>El día antes de revestir, cubrir con poli-L-ornitina (PLO). Disolver la OLP en agua estéril para hacer una solución en stock (10 mg/ml). Almacene este stock a -20 oC. Diluir la OLP 1:100 en agua para producir una concentración de 50 g/ml al recubrir el vidrio y una relación de 1:1.000 (10 g/ml) al recubrir el plástico.</li>
	<li>Aplique el recubrimiento directamente sobre las placas de destino. Utilice el volumen de recubrimiento adecuado al tamaño de la placa (es decir, para una placa de 24 pocillos aplique 500 ml de solución de PLO por poca).</li>
	<li>Deje que las placas se sentan en la oscuridad durante la noche a temperatura ambiente.</li>
	<li>Recuperar placas recubiertas el día de replacado y transferir a un gabinete de bioseguridad estéril.</li>
	<li>Aspirar la solución de PLO y enjuagar dos veces con agua estéril.</li>
	<li>Diluir laminina (1,15 mg/ml) en solución salina con fosfato (PBS) a 1:400 de dilución. NOTA: Descongelar la minin a 4 oC y añadir rápidamente a PBS para evitar la agregación de laminina y recubrimiento desigual.</li>
	<li>Aspirar agua estéril y aplicar 500 l de recubrimiento laminino a los pozos previamente recubiertos con OLP.</li>
	<li>Colocar las placas en una incubadora de 37oC durante un mínimo de 4-6 h. Utilizar incubaciones más largas, hasta 16 h, para superficies de vidrio. Utilice tiempos de incubación consistentes.</li>
</ol>3. Replating Differentiated Neurons
<ol><li>Enjuague la placa de las neuronas diferenciadas con PBS una vez suavemente. Disperse PBS suavemente por la pared de la placa, y no directamente sobre las células, para evitar interrumpirlas.</li>
	<li>Aspirar suavemente PBS, teniendo cuidado de evitar tocar las células directamente pero para aspirar desde el borde del plato mientras se inclina hacia el investigador.</li>
	<li>Aplicar al menos 1 ml de la enzima proteolítica (Tablade materiales)por placa de 10 cm y devolver las células a la incubadora. Añadir volúmenes ligeramente más altos si la sala de cultivo de tejidos presenta una alta tasa de evaporación debido a la baja humedad.</li>
	<li>Incubar células con enzima proteolítica durante 40-45 min con el fin de separarlas de la placa y separarlas de otras neuronas dentro de la red neuronal. NOTA: El tiempo en este paso es crítico. Quemar la proteasa demasiado pronto puede provocar un aumento de la muerte celular después de volver a pestear. El fabricante de enzimas proteolíticas recomienda que se utilicen temperaturas muy inferiores a 37 oC con períodos de incubación más largos para el paso de las líneas celulares (p. ej., durante la noche a 4 oC). Sin embargo, se debe evitar el manejo de las neuronas a 4 oC, ya que a menudo muestran una mala supervivencia después de la exposición al frío. El fabricante también afirma que una incubación de 60 minutos con la enzima a 37 oC conduce a su inactivación enzimática. Sin embargo, en la experiencia de los autores, una incubación de 40-45 minutos de cultivos neuronales derivados de hiPSC a 37 oC es suficiente para una disociación eficiente y una excelente supervivencia neuronal al replacar.</li>
	<li>Revise las neuronas en un microscopio de contraste de fase durante el tiempo de incubación y permita que el tratamiento de la proteasa continúe hasta que la red neuronal se separe completamente de la placa y comience a romperse en hojas más pequeñas al agitar brevemente la placa debajo de la Microscopio.</li>
	<li>Quench la actividad de proteasa utilizando 5 ml de medios DMEM frescos por 1 ml de proteasa en la placa de 10 cm para detener la digestión. Triturar suavemente las células contra la placa 5-8 veces para interrumpir la red, utilizando pipetas serológicas. Tenga cuidado de no aplicar demasiada presión al triturar, ya que las neuronas diferenciadas son frágiles. No utilice una punta P1000, ya que el extremo es demasiado afilado y estrecho, y por lo tanto puede pura o dañar las neuronas.</li>
	<li>Aplicar solución con células a través de un colador de células con malla de 100 m de diámetro en un tubo cónico fresco de 50 ml gota a gota.</li>
	<li>Enjuague el colador con 5 ml adicionales de medios DMEM frescos, después de que las células se hayan filtrado.</li>
	<li>Células de giro en centrífuga de sobremesa a 1.000 x g durante 5 min.</li>
	<li>Regrese el tubo cónico al gabinete de bioseguridad y aspire la mayor parte de los medios, dejando alrededor de 250 ol para asegurar que las células conserven la humedad.</li>
	<li>Resuspenda las células suavemente en 2 ml de medios DMEM frescos. No pipetee el pellet contra el lado del tubo. En su lugar, invierta suavemente las células cónicas 2-3 veces y pase las células a través del extremo de un pipeta serológico de 5 ml para desalojarlas.</li>
	<li>Aplicar 10 s de neuronas resuspendidas en el borde de un hemocímetro.</li>
	<li>Agregue 8-10 l de trippan azul a la gota de células para evaluar la viabilidad celular durante este paso de resuspensión. Aplicar 10 l de esta mezcla en el hemocitómetro u otros contadores de células automáticos. Evalúe como viables aquellas células que son fase brillante y excluya el tinte azul trypan.</li>
	<li>Determinar la cantidad de células viables / ml, y prepararse para diluir el contenido del tubo cónico de acuerdo con la densidad celular deseada.</li>
	<li>Placa 10.000 células por pozo para una placa de 384 pocillos; placa de 150.000 a 200.000 de células por pozo para una placa de 24 pocillos.</li>
	<li>Añadir DMEM fresco al tubo cónico de células resuspendidas para lograr la dilución adecuada y añadir suplementos apropiados adicionales como B27 y / o BDNF, dependiendo de los requisitos de la línea celular específica.</li>
	<li>Incline suavemente el tubo cónico para mezclar 2-3 veces.</li>
	<li>Aspirar el recubrimiento de laminina de la placa de 24 pocillos, o de la placa multipocilla de 384 pocillos utilizando un pipeta de 16 canales y enjuague una vez con PBS.</li>
	<li>Aspirar PBS usando un P1000 para la placa de 24 pocillos, o la pipeta de 16 canales para placas de 384 pocillos.</li>
	<li>Aplique la solución celular a cada pocal en una figura de ocho movimiento para evitar aglutinarse. La uniformidad del revestimiento también podría optimizarse mediante el uso de dispositivos automatizados de manipulación de líquidos. NOTA: La adición de laminina a los medios a partir de 2-4 días después de la reposición también ayuda a mantener una distribución homogénea de las células.</li>
	<li>Repita los pasos 3.19 y 3.20 para cada pozo.</li>
	<li>Devolver la placa a la incubadora a 37oC y 5% de CO2.</li>
	<li>Después de 2 días, comience a cambiar la mitad del medio cada 4 días utilizando los medios de cultivo posteriores a la diferenciación descritos en la sección 1.2. Después del tiempo de maduración deseado, fijar los cultivos utilizando 3.7% formaldehído a 37 oC y las células de mancha de acuerdo con los requisitos experimentales.</li>
</ol>4. Ensayos de viabilidad celular después de la reproducción
<ol><li>Añadir al reportero de la muerte de la célula temprana (VivaFix: 0,5 l de la solución de stock de 50 l por medio de cultivo de 500 l por pocto) después de repulsar brevemente la solución de stock.</li>
	<li>Iñénese con las células vivas y muertas cultivadas en multipolos con fondo de vidrio, después de 20 min, sin ningún paso de lavado, ya que el tinte fluoresce sólo una vez dentro de las células, o fijar y co-manchar con 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y/u otros anticuerpos antes de tomar imágenes utilizando un microscopio confocal.</li>
</ol>5. Inmunomanchación
<ol><li>Fijar cultivos con 3.7% de formaldehído en PBS más 120 mM de sacarosa durante 20 min a 37oC.</li>
	<li>Enjuague y permeabilice con 0.2% Triton X-100 durante 5 min a temperatura ambiente, y luego bloquee durante 30 min con 2% albúmina sérica bovina (BSA).</li>
	<li>Aspirar la BSA sin enjuiciar e incubar durante 1 h a temperatura ambiente con anticuerpo anti-MAP2 de conejo 1:1,000, anticuerpo anti-3 de ratón (TuJ1) 1:2,000, anticuerpo de pollo anti-NeuN (1:100) y anticuerpo anti-CTIP2 de rata (1:500), o con ratón anti-PSD95 ( 1:200), conejo antisináptica 1 (1:200) y anticuerpo anti-MAP2 de pollo para la tinción sináptica.</li>
	<li>Enjuague con PBS e incubar con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor más DAPI durante 45 min a 37 oC.</li>
	<li>Finalmente, lave dos veces con PBS antes de tomar imágenes.</li>
</ol>6. Imágenes de calcio
<ol><li>Infectar las células cultivadas con AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE (The Salk Institute for Biological Studies, GT3 Core Facility) a los 10 días posteriores a la reproducción y la imagen para evaluar los transitorios espontáneos de calcio a las 3-4 semanas posteriores a la reproducción.</li>
</ol>7. Adquisición y análisis de imágenes
NOTA: Para obtener más información sobre el sistema de adquisición, consulte Calabrese et al.12.
<ol><li>Utilice un módulo de imágenes para la adquisición manual o automatizada de imágenes, y un módulo de software de análisis de imágenes, como CellProfiler13,para mediciones morfométricas.</li>
	<li>Calcular la longitud media de los neuritas positivos TuJ1 y las dendritas positivas MAP2 midiendo la longitud total por campo de visión dividido por el número de neuronas (células positivas DAPI + MAP2 o TuJ1) dentro del mismo campo.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hemos demostrado un procedimiento directo para la resuspensión y reposición de cultivos neuronales humanos que optimiza la viabilidad, el éxito de la diferenciación y las imágenes subcelulares de una manera que es compatible con plataformas de cribado de alto contenido, y otros ensayos relevantes para el descubrimiento de fármacos. La Figura 6 ilustra el flujo de trabajo general y los ejemplos de dichas aplicaciones.
Aunque aquí nos centramos en las neuronas deriv...

Las neuronas derivadas de células madre pluripotentes humanas (hiPSC) son cada vez más relevantes en las áreas de investigación básica, desarrollo de fármacos y medicina regenerativa. Los flujos de trabajo y procedimientos para optimizar su cultivo y mantenimiento, y mejorar la eficiencia de la diferenciación en subtipos neuronales específicos, están evolucionando rápidamente1,2. Para mejorar la utilidad y la rentabilidad de las neuronas derivadas de células madre humanas como sistemas modelo susceptibles de análisis de alto contenido en el descubrimiento de fármacos y la validación de objetivos, es útil disminuir el tiempo de cultivo necesario para generar neuronas, conservando al mismo tiempo la máxima robustez, reproducibilidad y relevancia fenotipo. Aunque los cultivos organoides tridimensionales están impulsando avances en la investigación de desarrollo neurológico3, los cultivos monocapa en 2 dimensiones son especialmente compatibles con aplicaciones automatizadas basadas en imágenes debido a su grosor mínimo de tejido.
Sin embargo, la adaptación de los métodos de detección basados en imágenes a modelos de enfermedades neurológicas y neurodesarrollo humanas se enfrenta a un desafío importante. El prolongado período de tiempo sobre el cual el sistema nervioso humano madura in vivo requiere un tiempo prolongado en el cultivo para acomodar programas naturales de expresión génica y lograr la maduración neuronal.
Una consecuencia práctica del programa de diferenciación neuronal prolongada es que el mantenimiento de cultivos monocapa derivados de hiPSC debe mantenerse durante muchas semanas para lograr una madurez adecuada de la sinapsis. Durante este tiempo, los progenitores neuronales que permanecen indiferenciados continúan dividiéndose. Estos pueden rápidamente sobrecrecer el cultivo y usurpar el contenido de nutrientes necesario para mantener neuronas postmitoticas viables. La división vigorosa de las células progenitoras neuronales (NNJ) también puede competir con las neuronas para el sustrato de crecimiento. Esto puede hacer que estos cultivos sean sujetos a problemas de mala adhesión, una condición inadecuada para ensayos basados en imágenes. Además, muchos investigadores encuentran que cuanto menor sea el volumen de cultivo, mayor será la dificultad para mantener poblaciones sanas de neuronas diferenciadas el tiempo suficiente para observar las últimas etapas de la diferenciación neuronal. En otras palabras, los ensayos de maduración de la sinapsis mediante enfoques de detección de alto contenido (HCS) pueden ser muy difíciles para las neuronas derivadas del ser humano.
Para eludir algunos de estos problemas, se ha utilizado un procedimiento de resupending y replating de neuronas derivadas de hiPSC previamente diferenciadas. En primer lugar, permite el estudio del crecimiento de neurita (o, más exactamente, regeneración de neurita) en una población de neuronas totalmente comprometidas. En segundo lugar, el replato de neuronas previamente diferenciadas de un formato de gran volumen (como placas de 10 cm o más), hasta formatos de volumen pequeño (como placas de microtíter compatibles con HCS de 96 o 384 pocillos) permite una reducción significativa en el tiempo total de cultivo en la condición de volumen pequeño. Esto facilita el estudio del montaje y maduración de la sinapsis durante las semanas posteriores in vitro.
Sin embargo, la replacación de neuronas maduras que ya han establecido neuritas largos y una compleja red de conectividad presenta varios desafíos, uno de los cuales es la tasa a veces alta y variable de muerte celular. Aquí, describimos un procedimiento de replating que resulta en una excelente supervivencia celular y reproducibilidad. Comúnmente, las neuronas están expuestas a enzimas proteolíticas durante períodos cortos de incubación (normalmente 3-10 min) con el fin de separar las células del sustrato antes de la trituración. Este breve tiempo de proteólisis se utiliza habitualmente para resuspender y pasar muchos tipos de células divisorias, incluyendo células no neuronales y progenitores indiferenciados4,5,6. Sin embargo, para las neuronas diferenciadas que soportan neuritas largos e interconectados, es esencial no sólo separar las células del sustrato, sino también para interrumpir la red dendrítica y axonal con el fin de aislar las células individuales mientras se minimiza el daño. De hecho, una malla gruesa de neuronas generalmente tiende a desprenderse del sustrato como una sola hoja, en lugar de como células individuales. Si no se tiene cuidado de aflojar la gruesa red de neurótesis, las neuronas no sólo se dañan irreversiblemente durante la trituración, sino que muchas de ellas no pasan a través del filtro utilizado para eliminar los grumos, lo que resulta en un rendimiento celular deficiente. A continuación describimos una simple modificación de un procedimiento de incubación de proteasa ampliamente utilizado para contrarrestar estas dificultades.
En el protocolo descrito a continuación, las neuronas se incuban durante 40-45 min con una proteasa leve, como la enzima proteolítica (por ejemplo, Accutase). Durante los primeros 5-10 minutos después de agregar la enzima, la red neuronal se levanta del sustrato como una hoja. La incubación con la proteasa procede durante 30-40 minutos adicionales antes de proceder con una suave trituración y filtrado. Este tiempo de incubación adicional ayuda a asegurar que la digestión del material relaja la red intercelular, asegurando así que la posterior trituración produzca una suspensión de células individuales. Este procedimiento maximiza la uniformidad de la distribución celular al replacar mientras minimiza la muerte celular. Hemos aplicado con éxito este método de replacado a cultivos neuronales derivados de hiPSC generados por varios protocolos de diferenciación7,8 y a partir de varias líneas de hiPSC. El procedimiento es nominalmente adecuado para su uso con la mayoría o todas las líneas de neuronas derivadas de células madre. Hemos observado que un tiempo de incubación de proteasa extendido no es absolutamente esencial para los cultivos de replacado a partir de placas de formato pequeño (por ejemplo, 35 mm de diámetro); sin embargo, como mostramos aquí, proporciona un beneficio significativo al replacar a partir de placas de gran diámetro (por ejemplo, 10 cm de diámetro o más), probablemente porque los neurófilos en tales placas pueden extender procesos muy largos y formar una matriz densamente interconectada.
Aquí demostramos este método e ilustramos brevemente su aplicación en ensayos para la neuritogénesis temprana y para la maduración de la sinapsis, que implica la agrupación de proteínas pre y postsinápticas a lo largo de las dendritas y axones, seguido de su posterior la colocación en sitios sinápticos. Los ejemplos destacan las ventajas que ofrece este protocolo para preservar la viabilidad y reproducibilidad celular. En primer lugar, permite a los investigadores estudiar los primeros pasos en la neuritogénesis humana. El entorno experimental es similar a los cultivos primarios comúnmente utilizados de neuronas corticales o hipocampales de roedores, donde las células se extraen del cerebro fetal tardío o postnatal temprano, se disocian por la trituración después de un tratamiento suave contra la proteasa, y se les permite iniciar neurites o regenerar neurites que fueron cortados en el procedimiento9,10. Al igual que estas neuronas primarias de roedores, las neuronas derivadas de hiPSC comienzan a formaro o regenerar sus neuritas en cuestión de horas después de la reposición, lo que permite tomar imágenes de conos de crecimiento y morfología de neurita en un entorno óptimo para imágenes de alta espaciotemporal con menos células indiferenciadas. Hemos observado que el crecimiento de neurita está más sincronizado en comparación con los retrasos variables y las diferentes tasas de crecimiento observadas cuando las neuronas comienzan a diferenciarse de una población progenitora. Además, el replating permite ensayos de neuronas que expresan marcadores neuronales de subtipo que normalmente aparecen más adelante en el desarrollo neuronal, como el factor de transcripción CTIP2 de capa cortical 5/6 (Transcripción del promotor de ovalbumina de pollo proteína interactúe n.o 2), o el marcador panneuronal NeuN11. Una característica especialmente útil del enfoque de replacado es que la sinaptogénesis continúa dentro de un marco de tiempo compatible con HCS.

<table><tbody><tr><td><Medios > repintado post-fuerte</></td><td></td><td></td><td></td>ácido</tr> <tr><td>L-ascórbico</td><td>fuerte Sigma</td><td>A4403</td><td>Agregue 1 mL de caldo de 200 mM a 1 L de medio N2B27</td></tr><tr><td>Dibutiril-cAMP</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>Agregue 1 &micro; M</td></tr><tr><td>Humano BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>10 ng/ml concentración final</td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17504044</td><td>Añadir 20 mL a 1 L N2B27 medio</td></tr><tr><td>DMEM/F12 con Glutamax</td><td>Thermofisher Scientific 31331093</td><td></td><td>Añadir N2 y distribuir en cónicos de 50 mL; tapas de envoltura de parafilm</td></tr><tr><td>Humano GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>10 ng/mL concentración final</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermofisher Scientific 35050038</td><td></td><td>Añadir 10 ml a 1 L N2B27 medio; suplemento de glutamina</td></tr><tr><td>Mouse Laminin</td><td>Sigma</td><td>P3655-10mg</td><td>Añadir 100 &micro; L a 50 mL N2B27</td></tr><tr><td>MEM Aminoácidos no esenciales</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11140035</td><td>Añadir 5 mL a 1 L N2B27 medio N2</td></tr><tr><td>(100x) Suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td>Añadir 5 mL a 500 mL de medio</td></tr><tr><td>Medios Neurobasal A</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10888022</td><td>Combínelo con DMEM/F12 para generar medios N2B27 para células CVB wt; medios A basales neurales</td></tr><tr><td>Medios</td> <td>neurobasalesThermofisher Scientific</td><td>21103049</td><td>para células WT126; medio basal neural</td></tr><tr><td>SM1 Suplemento</td><td>StemCell Technologies</td><td>5711</td><td>Añadir 1:50 a los medios</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25080-094</td><td>Añadir 10 mL a 1 L N2B27 media</td></tr><tr><td><fuerte>Preparación en placa</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm Platos de cultivo de tejidos</td><td>Fisher Scientific</td><td>08772-E</td><td>Platos de plástico tratados con TC</td></tr><tr><td>Platos de cultivo de tejidos de 6 pocillos</td><td>Thomas Scientific</td><td>1194Y80</td><td>Placas NEST</td></tr><tr><td>Laminin de ratón</td><td>Life Technologies</td><td>23017-015</td><td>Añadir 1:400 en plástico</td></tr><tr><td>Poly-Ornithine</td><td>Sigma</td><td>P3655-10mg</td><td>Añadir 1:1.000 en plástico</td></tr><tr><td>Agua destilada ultrapura</td><td>Life Technologies</td><td>10977-015</td><td>Para diluir Poly-L-Ornithine</td></tr><tr><td>Restrating Reagents</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM Filtro de células</td><td>Corning</td><td>431752</td> Placa estéril de 384 pocillos<td>, envuelta individualmente</td></tr><tr><td>, sin recubrimiento</td><td>PerkinElmer</td><td>6007550</td><td>Coat con PLO y Laminin</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190144</td><td>solución salina</td></tr> <tr><td>tamponada con fosfato de DulbeccoPlacas de 384 pocillos prerrecubiertas de poli-D-lisina</td><td>PerkinElmer</td><td>6057500</td><td>Enjuague antes de recubrir con laminina</td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>Aplique una placa de 1 mL/10 cm durante 30-45 min; enzima proteolítica</td></tr><tr><td><fuerte>Materiales de fijación</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37% formaldehído</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-1</td><td>disuelto en PBS</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-12</td><td>0,8 g por 10 mL de fijador</td></tr><tr><td><fuerte>Immunostaining Materials</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Cabra anti-ratón</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Cabra anti-pollo</td><td>Invitrogen</td><td>A-11041</td><td>anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Cabra anti-pollo</td><td>Invitrogen</td><td>A-21449</td><td>anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 561 Cabra anti-rata</td><td>Invitrogen</td><td>A-11077</td><td>anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Biotium</td><td>40043</td><td>visualiza el ADN</td></tr><tr><td>Anticuerpo de ratón contra b3-tubulina (TuJ-1)</td><td>Neuromics</td><td>MO15013</td><td>marcador neuronal en etapa temprana Anticuerpo</td></tr> de <tr><td>rata contra CTIP2</td><td>Abcam</td><td>ab18465</td><td>capa 5/6 cortical neuronas</td></tr><tr><td>Anticuerpo de pollo contra MAP2</td><td>LifeSpan Biosciences</td><td>LS-B290</td> marcador <td>neuronal en etapa temprana</td></tr><tr><td>Anticuerpo de pollo contra NeuN</td><td>Millipore</td><td>ABN91</td><td>marcador neuronal en etapa tardía</td></tr><tr><td>Anticuerpo de conejo contra MAP2</td><td>Shelley Halpain</td><td>N/A</td><td>marcador neuronal en etapa temprana</td></tr><tr><td>Anticuerpo de ratón contra PSD-95</td><td>Sigma</td><td>P-246</td><td>marcador postsináptico</td></tr><tr><td>Anticuerpo de conejo contra Sinapsina 1</td><td>Millipore</td><td>AB1543</td><td>marcador presináptico</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30574.02</td><td>10% en PBS para bloquear</td></tr><tr><td>Titon X-100</td><td>Sigma</td><td>9002931</td><td>Diluido a 0.2% en PBS para permeabilización</td></tr><tr><td><fuerte>Marcadores de viabilidad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vivafix 649/660</td><td>Biorad</td><td>135-1118 marcador de</td><td>muerte celular</td></tr><tr><td><fuerte>Calcium Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nombre del reactivo/equipo Número de</td><td>catálogo</td> de <td>la empresa</td><td>Comentarios/Descripción</td></tr><tr><td>AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE</td><td>THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility</td><td>N/A</td><td>reportero de calcio en un sistema de administración</td></tr> <tr><td>viral<strongstrong>hiPSCs derivados de NPCs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>WT 126 (Y2610)</td><td>Gage lab</td><td>N/A</td><td>Marchetto et al., 2010</td></tr><tr><td>CVB WT24</td><td>Yeo and Goldstein labs</td><td>N/A</td><td>inédito</td></tr></tbody></table>

replacado posterior a la diferenciación de las neuronas derivadas de células madre pluripotentes humanas para la detección de alto contenido de la neuritogénesis y la maduración de la sinapsis

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Las neuronas diferenciadas en el cultivo bidimensional de las células progenitoras neuronales derivadas de células madre humanas (NDC) representan un potente sistema modelo para explorar los mecanismos de la enfermedad y llevar a cabo pruebas de detección de alto contenido (HCS) para interrogar a un compuesto bibliotecas o identificar fenotipos de mutación genética. Sin embargo, con las células humanas la transición de NPC a funcional, neurona madura requiere varias semanas. Las sinapsis suelen comenzar a formarse después de 3 semanas de diferenciación en el cultivo monocapa, y varias proteínas específicas de la neurona, por ejemplo el marcador panneuronal nucina NucN, o el marcador de neurona cortical cerebral CTIP2 de capa 5/6, comienzan a expresar alrededor de 4-5 semanas después de la diferenciación. Este largo tiempo de diferenciación puede ser incompatible con las condiciones de cultivo óptimas utilizadas para plataformas HCS de pequeño volumen y varios pozos. Entre los muchos desafíos se encuentran la necesidad de células bien adheridas y distribuidas uniformemente con agrupamiento celular mínimo y procedimientos de cultivo que fomenten la viabilidad a largo plazo y la maduración funcional de la sinapsis. Un enfoque es diferenciar las neuronas en un formato de gran volumen, luego replacarlas en un momento posterior en multi-pozos compatibles con HCS. Algunos de los principales desafíos al utilizar este enfoque de replacado se refieren a la reproducibilidad y la viabilidad celular, debido a la interrupción estresante de la red dendrítica y axonal. Aquí demostramos un procedimiento detallado y confiable para resuspender enzimáticamente las neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el ser humano (hiPSC) después de su diferenciación durante 4-8 semanas en un formato de gran volumen, transfiriéndolas a microtíterdes de 384 polos placas, y el cultivo de ellos para otros 1-3 semanas con excelente supervivencia celular. Este replato de neuronas humanas no sólo permite el estudio del ensamblaje y maduración de la sinapsis dentro de las dos semanas posteriores al replating, sino que también permite estudios de regeneración de neurita y características del cono de crecimiento. Proporcionamos ejemplos de ensayos escalables para neuritogénesis y sinaptogénesis utilizando una plataforma de 384 pozos.

El replating de las neuronas derivadas de hiPSCs que se han diferenciado durante varias semanas ofrece varias ventajas. Sin embargo, separar y replacar las neuronas diferenciadas que tienen dendritas y axones largos e interconectados (Figura1A) puede resultar en una fracción alta de neuronas dañadas irreversiblemente.
Como se describe en la sección de protocolo, utilizamos la incubación con una enzima proteolítica para separar las neuronas del sus...

Este protocolo describe un procedimiento detallado para recuperar y cultivar neuronas derivadas de células madre humanas que previamente se diferenciaron de los progenitores neuronales in vitro durante varias semanas. El procedimiento facilita ensayos basados en imágenes de neurótesis, sinapsis y marcadores neuronales de expresión tardía en un formato compatible con microscopía ligera y cribado de alto contenido.

Replacado posterior a la diferenciación de las neuronas derivadas de células madre pluripotentes humanas para la detección de alto contenido de la neuritogénesis y la maduración de la sinapsis

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Este protocolo facilita el uso de neuronas derivadas de células madre pluripotentes humanas para aplicaciones de cribado de alto contenido. Es particularmente adecuado para el ensayo de sinapsis, que en las neuronas humanas requieren largos períodos de cultivo. Demostramos el replata de las neuronas de platos de gran formato en pozos múltiples compatibles con HCS de una manera que preserva su viabilidad.De manera anti-intuitiva, mostramos que extender la incubación de la proteasa antes de resuspending y replating produce una supervivencia neuronal mejorada. Las neuronas derivadas de células madre pluripotentes humanas son cada vez más relevantes en las áreas de investigación básica, desarrollo de fármacos y medicina degenerativa. Este método de valoración suave se puede utilizar para resuspend cualquier gran monocapa de células que tengan una gruesa red de procesos.Además de los iPSC humanos, se puede utilizar para reoplatar el cultivo de las neuronas primarias o para resuspenderlos para la clasificación de hechos o la secuenciación de una sola célula. Es importante seguir los pasos de los protocolos cuidadosamente y con frecuencia monitorear el desprendimiento mediado por la proteasa de las neuronas de la placa. El tiempo óptimo de incubación puede variar, dependiendo del cultivo.La demostración visual permite incluso a los investigadores inexpertos reproducir este procedimiento. Comience enjuagando suavemente la placa de neuronas diferenciadas con PBS. Disperse el PBS por la pared de la placa y no directamente en las células para evitar interrumpirlos.Aspirar el PBS desde el borde del plato mientras lo inclina, teniendo cuidado de no tocar las células. Aplicar al menos un mililitro de enzima proteolítica por placa de 10 centímetros. Y devolver las células a la incubadora durante 40 a 45 minutos.Durante la incubación, revise las neuronas en un microscopio de contraste por fases y continúe el tratamiento con proteasa hasta que la red neuronal se separe completamente de la placa y comience a separarse. Cuando las neuronas se hayan desprendido, detenga la digestión añadiendo cinco mililitros de medios FRESCOS DEMEM por cada mililitro de proteasa. Utilice una pipeta serológica para valorar suavemente las células contra la placa de cinco a ocho veces, asegurándose de no aplicar demasiada presión.Tensar las células a través de una malla de 100 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros, gota a gota. Y enjuague el colador con cinco mililitros adicionales de medios DMEM frescos. Utilice una centrífuga de sobremesa para girar las células hacia abajo a 1000 veces G durante cinco minutos.Después de la centrifugación, devuelva el tubo cónico al gabinete de bioseguridad y aspire la mayoría de los medios, dejando 250 microlitros para mantener las células húmedas. Resuspender suavemente las células en dos mililitros de medios DMEM frescos y luego pasarlas a través del final de una pipeta serológica de cinco mililitros. Finalmente, invierta el tubo de dos a tres veces.Usa un hemociclo y un azul tripan para contar las células viables. Y luego DMEM a la concentración deseada. Añadir suplementos apropiados al tubo, dependiendo de los requisitos de la línea celular específica y mezclar suavemente las células inclinando el tubo cónico de dos a tres veces.Aspirar el recubrimiento de laminin de una placa de 24 pozos y enjuáguelo una vez con PBS. Aspirar el PBS. Y aplique la solución celular a cada pozo en un movimiento de la figura ocho para evitar el aglutinamiento.Cuando termine de enchapar las células, devuelva la placa a la incubadora establecida en 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Brevemente vórtice la solución de acciones del reportero de muerte celular temprana y agréguelo a los pozos de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Espera 20 minutos.Y luego imagen de las células vivas y muertas en los múltiples pozos de fondo de vidrio. La prolongación de la incubación de la proteasa permite aflojar la red neuronal dentro de la hoja levantada de células. Esto se traduce en una reducción de la muerte celular en el momento de la disociación, así como resulta en una recuperación más eficiente en los días siguientes.Utilizando el procedimiento de incubación enzimática extendida, los cultivos exhiben una duplicación aproximada de la viabilidad celular durante los días después del replating y una menor densidad de células muertas o moribundas. La fase de transición de la diferenciación neuronal tiene lugar durante varios días, durante los cuales las células expresan gradualmente marcadores neuronales en etapa tardía. Estos marcadores se detectan inmediatamente en cultivos que fueron replatados después de cuatro semanas de pre-diferenciación.El protocolo de proteasa extendida también mejora moderadamente el crecimiento de la neurida. Se mejora tanto la longitud total de la neurida como el crecimiento de la dendrita. Replating también es útil para estudiar las sinapsis.Apenas una semana después del replating, se observaron marcadores para las proteínas pre y post-sinápticas. Además, la actividad eléctrica a partir de la despolarización espontánea y las corrientes impulsadas sinápticamente es detectable utilizando imágenes de calcio o matrices multielectrodos. Este procedimiento de replating se puede adaptar a muchos tipos de aplicaciones.Además de la detección de alto contenido para identificar posibles compuestos terapéuticos, podría utilizarse para imágenes de conos de crecimiento o grabaciones de matrices multielectrodos. La disociación mecánica de las neuronas que ya han formado largos procesos es estresante. La incubación enzimática alargada y la valoración suave de las células son pasos esenciales para el éxito de este procedimiento.

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Neurociencia

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Nosotros, basándonos en el conocimiento de la biología del desarrollo y la investigación publicada, desarrollamos un protocolo optimizado para generar de manera eficiente neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo A9 a partir de células madre embrionarias humanas y células madre pluripotentes inducidas humanas, que serían útiles para el modelado de enfermedades y la terapia de reemplazo celular para la enfermedad de Parkinson.

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Se describe un protocolo personalizado para diferenciar células madre embrionarias de ratón en poblaciones definidas de neuronas de alta pureza que exhiben sinapsis funcionales y comportamiento de red emergente. El análisis electrofisiológico demuestra la pérdida de la transmisión sináptica tras la exposición a los serotipos de neurotoxina botulínica /A-/G y neurotoxina tetánica.

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Las espinas dendríticas de las neuronas piramidales son los sitios de la mayoría de las sinapsis excitadoras en la corteza cerebral de los mamíferos. Este método describe un análisis cuantitativo 3D de morfologías de la columna vertebral en las neuronas glutamatérgicas piramidal corticales humanos derivadas de células madre pluripotentes inducidas.

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Modificamos e implementar un protocolo previamente publicado que describe la diferenciación rápida, reproducible y eficiente de los inducidos por el hombre células madre pluripotentes (hiPSCs) en neuronas corticales excitatorios 12. Específicamente, nuestra modificación permite el control de la densidad celular neuronal y su uso en matrices de micro-electrodos para medir las propiedades electrofisiológicas en el nivel de red.

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El protocolo presentado describe un método para un ensayo de crecimiento de neurito y la evaluación de la neurotoxicidad de compuestos de moléculas pequeñas.

Un ensayo de crecimiento de neurita y evaluación de neurotoxicidad con neuronas derivadas de células de progenitor neuronales humanos

Mostramos la automatización de cultivos de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) y diferenciaciones neuronales compatibles con imágenes y análisis automatizados.

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Describimos la producción de cultivos mixtos de astrocitos y células precursoras de oligodendrocitos derivadas de células madre neurales fetales o adultas que se diferencian en oligodendrocitos maduros, y el modelado in vitro de estímulos nocivos. El acoplamiento con una técnica de detección de alto contenido basada en células construye un sistema de detección de drogas confiable y robusto.

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Replacado posterior a la diferenciación de las neuronas derivadas de células madre pluripotentes humanas para la detección de alto contenido de la neuritogénesis y la maduración de la sinapsis (Video) | JoVE Journal

Replacado posterior a la diferenciación de las neuronas derivadas de células madre pluripotentes humanas para la detección de alto contenido de la neuritogénesis y la maduración de la sinapsis

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