Name: Estudio de la expresión genética regulada por el ciclo celular mediante dos protocolos complementarios de sincronización celular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-06T15:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Aprende dos protocolos de sincronización celular para analizar la expresión génica regulada por el ciclo celular en células U2OS. Estos métodos permiten estudiar eventos transcripcionales en cáncer y evaluar efectos de quimioterapia.

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Agradecemos a los miembros de los laboratorios Zubiaga y Altmeyer por sus útiles debates y por su apoyo técnico. Este trabajo ha contado con el apoyo del Ministerio Español (SAF2015-67562-R, MINECO / FEDER, UE), el Gobierno Vasco (IT634-13 y KK-2015/89) y la Universidad del País Vasco UPV / EHU UFI11 / 20).

1. Sincronización Celular, Liberación y Monitoreo de la Progresión del Ciclo Celular <ol><li> Timidina y nocodazol (Thy-Noc) sincronización y liberación de células U2OS de la mitosis <ol><li> Preparar el medio de cultivo celular requerido. Las células U2OS se cultivan rutinariamente en medio DMEM-Glutamina complementado con FBS al 10% (vol / vol) (opcional: penicilina al 1% / estreptomicina). Realizar toda la preparación y manipulación del medio en condiciones estériles y calentar el medio complementado (de ahora en adelante denominado &quot;medio completo&quot;) a 37 ° C antes de su uso. </li><li> Sembrar 2 x 106 células U2OS por placa de 100 mm en 10 ml de medio de cultivo completo. Para calcular el número de platos necesarios, tenga en cuenta que cada plato de 100 mm proporciona típicamente suficientes células mitóticas para volver a planchar aproximadamente 5 pocillos de una placa de 6 pocillos (0,2 - 0,25 x 106 células / pocillo) (véase la Figura 1B ). Se requieren dos pozos por punto de tiempo seleccionadoEd en el experimento (1 pozo para la extracción de ARN y 1 pozo para el control del ciclo celular). Además, un tercer pocillo puede ser recogido por punto de tiempo para el análisis de proteínas. NOTA: Coloque las celdas en la noche (alrededor de las 7 pm) para que los siguientes pasos se puedan llevar a cabo durante las horas de trabajo los días siguientes. Incluya 2 pozos adicionales de células de crecimiento asíncrono para definir la configuración de compensación de análisis FACS. </li><li> Deje que las células se unan incubando platos de 100 mm a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% de CO 2 durante 24 h. </li><li> Para el bloque de timidina, preparar una solución madre de timidina 200 mM disolviendo 145,2 mg de polvo de timidina en 3 ml de H $ ₂ $ O (o cantidades equivalentes) y esterilizar la solución por filtración a través de un filtro de tamaño de poro de 0,2 μm. Un ligero calentamiento podría ayudar a disolver la timidina. Añadir 100 μl del preparado recién preparado 200 mM a cada placa de cultivo de 100 mm (concentración final 2 mM). Incubar las células con timidina durante 20 h a 37ºC76; C en una atmósfera humidificada con 5% de CO 2 . NOTA: Tratar las células por la noche (alrededor de las 7 pm), para tener tiempo para realizar tanto la liberación de timidina como el bloqueo de nocodazol al día siguiente. </li><li> Para liberar del bloque de timidina, eliminar el medio de crecimiento que contiene timidina en la tarde del día siguiente (3 pm); Lavar las células dos veces con 1x PBS precalentado y agregar 10 ml de medio completo a cada una de las placas de 100 mm. Incubar las células durante 5 h a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% de CO 2 . </li><li> Para detener las células mitóticas, añadir nocodazol a una concentración final de 50 ng / mL (8 pm). Preparar una solución madre disolviendo polvo de nocodazol en DMSO ( por ejemplo, 5 mg / ml) y almacenar congelado a -20 ° C. Incubar las células con nocodazol durante no más de 10 - 11 h a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% de CO 2 . </li><li> Liberación de la detención mediada por nocodazol en fase M temprana (sacudimiento mitótico) y recogida de muestras en poi tiempo(Comenzando a las 6-7 am). <ol><li> Separar las células redondeadas (mitóticas) agitando cada placa y pipeteando suavemente el medio de crecimiento que contiene nocodazol. Recoger el medio con células separadas de cada placa de 100 mm en tubos estériles de 50 ml, centrifugar (300 xg, 5 min, temperatura ambiente (RT)) y lavar las células dos veces añadiendo 1x PBS seguido de centrifugación. Se recomienda el uso de PBS frío o PBS más nocodazol para evitar el deslizamiento mitótico (ver sección de discusión). </li><li> Resuspender las células mitóticas recogidas de cada placa de 100 mm en 10 ml de medio completo. Ahorre 2 ml para la extracción de ARN y 2 ml para el análisis FACS para el punto de tiempo 0 h (aproximadamente 0,2-0,25 x 10 6 células por muestra). </li><li> Replantar las células mitóticas restantes para posteriores puntos de tiempo en placas de 6 pocillos (2 ml / pocillo, 0,2-0,25 x 106 células / pocillo). NOTA: Recuerde que se requieren 2 pozos por punto de tiempo seleccionado (1 para ARN y 1 para análisis FACS). </li></ol></li><li> Recoger muestras en selTiempo. Cada 1,5 a 3 h se recomienda para obtener un perfil adecuado de la progresión del ciclo celular. <ol><li> Para la extracción de ARN, retire el medio, enjuague bien con 2 mL de PBS 1x precalentado y agregue 1 mL de reactivo de aislamiento de ARN adecuado ( por ejemplo, TRIzol) en el pozo (realice este último paso en un gabinete de seguridad para productos químicos). Pipetar hacia arriba y hacia abajo para separar y lisar las células, transferir el lisado celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, incubar 5 min a RT y almacenar el tubo a -80 ° C hasta su uso posterior. </li><li> Para el análisis de FACS, enjuague bien con 2 mL de PBS 1x precalentado, añada una solución de tripsina-EDTA precalentada (0,3 mL / pocillo) para separar las células, bloquee Trypsin-EDTA añadiendo 1 mL de medio completo y recoja cada muestra en forma separada Tubo de 15 ml. <ol><li> Centrifugar las células (300 xg, 5 min, RT), excepto pellet celular y descartar el sobrenadante. Para fijar las células, resuspender las células en 1 ml de etanol enfriado al 70% (v / v) en 1x PBS agitando suavemente los tubos y colocarlos en hielo para aplicarlos.Aproximadamente 15 minutos antes de almacenar a 4ºC o para tinción para análisis posterior por FACS (descrito en los pasos 1.4 - 1.5). </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> HU-based sincronización y liberación de células U2OS desde el límite G1 / S <ol><li> Preparar el medio de cultivo celular completo como se describe en el paso 1.1. </li><li> Se añadieron 0,25 x 10 ^ { 6 } células U2OS por pocillo en placas de 6 pocillos (2 ml de medio de cultivo completo por pocillo). Para calcular el número de pozos necesarios para el experimento, tenga en cuenta que se necesitarán 2 pozos por punto de tiempo seleccionado (1 pozo para la extracción de RNA y 1 pozo para el monitoreo del ciclo celular) y que 2 pocillos adicionales de células asincrónicamente en crecimiento Necesarios para definir los ajustes de compensación de análisis FACS. </li><li> Las células se unen incubando placas de 6 pocillos durante la noche (O / N) a 37ºC en una atmósfera humidificada con 5% de CO2. </li><li> Retire el medio completo de los pozos la mañana siguiente y agregue 2 mLDe medio DMEM-Glutamina pre-calentado libre de FBS por pocillo. Incubar las células durante 24 h adicionales a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% de CO 2 . NOTA: Realice este paso en todos los pozos excepto en 2 (los guardados para definir ajustes FACS). La etapa de retirada del suero se puede omitir si se logra una sincronización eficiente simplemente incubando células con HU. </li><li> Cierre del ciclo celular G1 / S con HU. <ol><li> Preparar solución madre de HU fresca (500 mM) antes de cada uso. Añadir 2 ml de H $ ₂ $ O a 76,06 mg de HU de polvo y mezclar hasta que se disuelva completamente. Esterilizar la solución por filtración a través de un filtro de tamaño de poro de 0,2 μm. Mezclar 50 ml de medio completo con 400 μl de solución madre HU esterilizada con filtro para una concentración final de HU de 4 mM. </li><li> Eliminar el medio de todos los pocillos excepto de los 2 pocillos necesarios para definir los ajustes de FACS y reemplazarlos con un medio completo 4 mM HU recién preparado (2 ml / pocillo). </li><li> Incubar las células durante 24 h enHU que contiene medio a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% de CO 2 . </li></ol></li><li> Liberación de células de la detención mediada por HU. Quitar el medio que contiene HU de los pocillos y enjuagar los pocillos dos veces con 1x PBS precalentado (2 ml cada vez). Añadir 2 ml de medio completo por pocillo. Recoja 2 muestras para el punto de tiempo 0 h (1 para la extracción de RNA y 1 para la verificación de detención del ciclo celular por FACS), así como 2 muestras guardadas para los ajustes FACS. Coloque los pocillos restantes en la incubadora. </li><li> Recoger las muestras cada 1,5 a 3 h con el fin de obtener una adecuada distribución de la progresión del ciclo celular. En cada punto de tiempo, realice el procesamiento de la muestra (para la extracción de ARN y para el análisis FACS) como se describe en 1.1.8.1-1.1.8.2. </li></ol></li><li> Tratamiento con agentes dañinos del ADN NOTA: Siempre que el objetivo sea elucidar el efecto de un compuesto ( por ejemplo , agentes dañinos del ADN) en eventos de ciclo celular, cualquiera de los métodos de sincronización descritos anteriormente puede serCombinado con el tratamiento de las células con el agente genotóxico. Con el fin de seleccionar el método de sincronización, es importante considerar la fase del ciclo celular que nos gustaría analizar. En general, el procedimiento Thy-Noc puede ser adecuado para estudiar el efecto de un compuesto en fase G1 o entrada en fase S, mientras que la sincronización mediada por HU puede ser más adecuada para estudiar el impacto en fases S a G2 o en la entrada a mitosis. <ol><li> Análisis del efecto de los agentes genotóxicos en la fase G1 o en la fase S <ol><li> Sincronice las celdas como se describe en 1.1.2. A 1.1.6. </li><li> Liberar las células del nocodazol y re-plancharlas como se describe en 1.1.7. Incubarlos a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% de CO 2 durante 3 h para dejar que se adhieren antes de agregar agente (período de incubación requerido puede variar dependiendo de la línea celular). </li><li> Agregue el agente y recoja las muestras como se describió anteriormente en 1.1.8. </li></ol></li><li> Análisis del efecto de los agentes genotóxicos en SG2 fases o entrada M <ol><li> Sincronice las celdas como se describe en 1.2.2. A 1.2.5. </li><li> Liberar las células de HU como se describe en 1.2.6. Y agregue el agente inmediatamente. </li><li> Recoger las muestras como se describe anteriormente en 1.8. </li></ol></li></ol></li><li> Seguimiento de la sincronización celular y la progresión a través del ciclo celular por tinción con yoduro de propidio (PI) y análisis FACS NOTA: Las muestras recogidas en todos los puntos de tiempo junto con las necesarias para definir ajustes FACS se pueden almacenar a 4 ° C una vez que se han fijado (como se menciona en 1.1.8.2). Realizar la tinción con solución PI seguido de análisis FACS para todas las muestras del experimento simultáneamente. PI se intercala en la ranura principal del ADN bicatenario produciendo una señal altamente fluorescente cuando se excita a 535 nm con un pico de emisión amplio alrededor de 600 nm. Puesto que PI también puede unirse a ARN de doble hebra, es necesario tratar las células con RNasa para una resolución óptima del ADN. <ol><li> Prepare una solución de tinción PI recién hecha. Se puede preparar una solución madre PI disolviendo el polvo PI en PBS ( por ejemplo, 5 mg / ml). Guarde la solución madre a 4 ° C (en la oscuridad). La solución de tinción se compone de PI (140 μM), citrato de sodio (38 mM) y Triton X-100 (0,01% v / v). </li><li> Calentar una superficie adecuada ( por ejemplo, horno) a 37 ° C. </li><li> Centrifugar las células fijas (450 xg, 5 min, RT), decantar el sobrenadante (etanol) y lavar una vez con 1x PBS. </li><li> Centrifugar de nuevo las células, eliminar PBS y añadir 300 μ l de solución de tinción PI por muestra (excepto a una de las muestras para FACS ajustes, añadir PBS a esta muestra en su lugar). </li><li> Transfiera las células a los tubos FACS (tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 ml). </li><li> Añadir 1 μl de RNasa A a cada muestra, mezclar e incubar las muestras durante 30 min en oscuridad a 37 ° C. Las muestras pueden almacenarse protegidas de la luz a 4 ° C durante un máximo de 2 - 3 días. </li><li> Analizar el contenido de ADN en muestras por flujoCitometría. Defina los ajustes de compensación de análisis FACS con muestras asíncronas teñidas con PI. Utilice una muestra en blanco (sin la solución de tinción PI) para verificar la autofluorescencia. Fundamentos de la tinción PI mediada por el análisis de contenido de ADN por citometría de flujo se ha descrito anteriormente [ 9] . </li></ol></li><li> Determinación del índice mitótico por doble fosfo-H3 (Ser 10) / tinción PI NOTA: Las células sometidas a mitosis pueden detectarse fácilmente mediante citometría de flujo con anticuerpos específicos para la fosfo-histona H3 en Serina 10 (pH3). Una tinción concomitante de PI es útil para determinar la distribución basada en el contenido de ADN de la población celular. Se requieren 5 muestras para las configuraciones óptimas de las configuraciones FACS: blanco, sólo PI, sólo pH3, sólo anticuerpo secundario y doble tinción. <ol><li> Centrifugar las células fijas (450 xg, 5 min, 4 ° C) y descartar el sobrenadante. Se describen los siguientes pasos para realizar tinción en tubos de 15 mL. </li><li> Lavar las células añadiendo 1Ml de PBS - T (PBS + Tween - 20 al 0,05%) al sedimento y centrífuga (450 xg, 5 min, 4ºC). Eliminar el sobrenadante. </li><li> Añadir el anticuerpo anti-pH3 diluido (1: 500) en 100-200 μL de PBS-T + BSA al 3%, e incubar con balanceo durante 2 h a RT (o O / N a 4 ° C). </li><li> Añadir 2 ml de PBS-T (PBS + 0,05% de Tween-20) y centrifugar (450 xg, 5 min, 4 ° C). Eliminar el sobrenadante. </li><li> Lavar una vez más añadiendo 2 ml de PBS-T al sedimento, centrifugar y desechar el sobrenadante. </li><li> Se añade un anticuerpo secundario (anti-conejo AlexaFluor 488 en el caso del anticuerpo pH3 seleccionado) diluido (1: 500) en 100-200 μL de PBS-T + BSA al 3% y se incuba con balanceo durante 1 h a RT (o O / N A 4 ° C). Proteger las muestras de la luz. </li><li> Lavar dos veces con PBS-T (2 mL) por centrifugación como se describe en el paso 1.5.4. </li><li> Realizar tinción PI como se describe (pasos 1.4.1 a 1.4.6). </li></ol></li></ol> 2. Recolección y procesamiento de muestras para el análisis de la expresión génica <ol><li> Tomar1,5 mL microcentrífuga muestras en el reactivo de aislamiento de ARN fuera del congelador y dejarlos descongelar a RT dentro de un armario de seguridad para los productos químicos. </li><li> Añada 400 μl de cloroformo a cada muestra y agite vigorosamente (pero no vórtice) hasta completar la mezcla. Incubar las muestras durante 5 min a RT. </li><li> Centrifugar los tubos durante 15 min (≥8.000 xg, 4 ° C) en una microcentrífuga de sobremesa. </li><li> Transferir la fase acuosa (superior) a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y registrar el volumen transferido (para simplificar el procedimiento, se recomienda recoger volúmenes iguales en todas las muestras del experimento). </li><li> Añadir 1 volumen de etanol 100% lentamente (gota a gota) a la fase acuosa mientras se mezcla. No centrifugar. </li><li> Lleve a cabo los siguientes pasos con el kit de mini preparación para ARN comerciales. Pipetee hasta 700 μl de cada muestra, incluyendo cualquier precipitado que se haya formado, en una columna giratoria en un tubo de recogida de 2 ml (suministrado por el fabricante). </li><li> Cierra elTapa y centrifugadora (≥ 8.000 g, RT) durante 15 s. Deseche el flujo. Repita el paso anterior con la muestra restante (si existe). </li><li> Siga las instrucciones del fabricante para el lavado y la elución de ARN (eluir cada muestra en 30-40 μl de H 2 O libre de nucleasa para lograr una concentración de ARN apropiada para el siguiente paso). </li><li> Determine la concentración de ARN y la pureza de las muestras mediante mediciones de absorbancia (una relación A 260/280 de 2,0-2,1 indica una buena pureza de la muestra de ARN). Almacene muestras de ARN a -80 ° C hasta su uso para el análisis RT-qPCR. </li><li> Para la conversión de ARN en ADNc y PCR cuantitativa subsiguiente, tomar 1 μg de ARN por muestra y preparar la reacción de retrotranscriptasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras de ADNc obtenidas se pueden almacenar a 4ºC (durante un par de días) oa -20ºC (durante períodos de tiempo más prolongados). NOTA: La preparación de la muestra, el diseño del cebador y otras consideraciones para la PCR en tiempo real han sido exTensivamente descrito en la literatura 22 , 23 . </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El análisis de la regulación fina de los genes regulados implicados en papeles transitorios y específicos en el ciclo celular requiere una población celular uniforme. Muchos investigadores usan rutinariamente líneas de células tumorales establecidas desde hace mucho tiempo para estos propósitos, y se han desarrollado una variedad de métodos para obtener poblaciones de células síncronas (o parcialmente sincrónicas), con el objetivo de acumular tantas células como sea posible en fases definidas de ciclo celular. Además, s...

La transición a través de todas las fases del ciclo celular se acopla a un programa de expresión génica fuertemente regulado. Se supone que esta coordinación &quot;en y fuera&quot; de la transcripción de genes a lo largo del ciclo celular está bajo el control de sistemas reguladores transcripcionales complejos, regulando no sólo el momento sino también los niveles de expresión génica. Se sabe que la desregulación de los componentes clave del ciclo celular contribuye al desarrollo de varias enfermedades y es un sello bien establecido de la tumorigénesis 1 , 2 . Los análisis transcriptómicos de todo el genoma llevados a cabo en células de levadura y de mamífero han revelado que un gran número de genes exhiben patrones de expresión génica periódicos en el ciclo celular, lo que sugiere que la fluctuación transcripcional durante el ciclo celular es un reflejo del requisito temporal de un producto génico dado En una fase precisa 3 , 4 , </suP&gt; 5 . Una tarea importante en el estudio de la expresión de genes regulados por el ciclo celular es la sincronización de células en fases específicas del ciclo celular. La sincronización celular ayuda a interpretar la asociación de un patrón de expresión génica a una transición de fase particular del ciclo celular, y ha conducido a una mejor comprensión de la regulación y la función de numerosos genes. La sincronización celular también es importante para el estudio del mecanismo de acción de los fármacos contra el cáncer, ya que los agentes quimioterapéuticos se sabe que afectan tanto la expresión de genes, así como la cinética del ciclo celular [ 6 , 7] . Sin embargo, a menudo es difícil determinar si las diferencias de expresión génica resultantes del tratamiento con estos agentes son una respuesta directa al tratamiento o son meramente la consecuencia de cambios en los perfiles del ciclo celular. Para distinguir entre estas posibilidades, la expresión génica debe analizarse en células que han sido sYnchronized antes de la adición del fármaco quimioterapéutico. Con la excepción de algunas células primarias tales como células linfoides recién aisladas -que constituyen una población celular homogénea sincronizada en G08-, las líneas celulares establecidas in vitro crecen asincrónicamente en cultivo. Bajo condiciones de crecimiento regular, estas células de ciclo asincrónico se encuentran en todas las fases del ciclo celular, pero, preferentemente en G1 9 . Por lo tanto, este contexto no proporciona un escenario óptimo para el análisis funcional o de expresión génica en una fase específica del ciclo celular ( por ejemplo , G1, S, etc.). Las líneas celulares inmortalizadas no transformadas ( por ejemplo, fibroblastos) pueden sincronizarse con los llamados métodos fisiológicos 10 . Estos métodos se basan en las características de células primarias retenidas de las células no transformadas, tales como la inhibición del contacto celular y la dependencia del factor de crecimiento con el fin de continuar el ciclo. EliminaciónDe suero en combinación con inhibición de contacto hace que las células no transformadas sean detenidas en G0 / G1. Sin embargo, la sincronización del ciclo celular de entrada y la progresión a menudo requiere de subcultura, que también implica el desprendimiento artificial de las células y re-chapado [ 10] . Más importante aún, este método no es adecuado para la sincronización de líneas celulares transformadas, la gran mayoría de líneas celulares establecidas actualmente en uso, caracterizado por carecer de inhibición del crecimiento mediada por contacto celular o respuesta a la retirada del factor de crecimiento. Por lo tanto, es evidente que se requieren métodos alternativos para la sincronización celular eficiente en fases específicas del ciclo celular. En términos generales, los métodos de sincronización más utilizados se basan en la inhibición química o farmacológica transitoria de un punto definido del ciclo celular, típicamente síntesis de ADN o formación de huso mitótico. La inhibición de la síntesis de ADN sincroniza las células deteniéndolas en fase G1 tardía o temprana. Esto puede hacerse12 , aphidicolin, un inhibidor de ADN polimerasas 13 , 14 , hidroxiurea, un inhibidor de ribonucleotide reductasa 15 , 16 o por cantidades en exceso de timidina 17 , 18 . Por otra parte, los inhibidores de la polimerización de los microtúbulos, tales como la colchicina o el nocodazol, son capaces de bloquear la formación del huso mitótico que conduce a la sincronización celular a principios de la fase M 19 , 20 , 21 . En este trabajo se describe un método que implica dos protocolos de sincronización complementarios basados ​​en la inhibición química transitoria para el estudio de la expresión de los genes regulados por el ciclo celular en el mRNAnivel. Este método es fundamental para definir el papel de los genes del ciclo celular en procesos específicos del ciclo celular. Además, proporciona un marco general para estudiar el impacto de los tratamientos contra el cáncer con el fin de detectar con precisión genes fármacos sensibles y para minimizar las interpretaciones erróneas derivadas de las perturbaciones en la progresión del ciclo celular generado por estos fármacos.

<table><tbody><tr><td>DMEM, glucosa alta, suplemento GutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61965-059</td><td></td></tr><tr><td>FBS, calificado, aprobado por la UE, origen de América del Sur</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Tripsina-EDTA (1x), rojo fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>SIGMA</td><td>T1895-5G</td><td>Recién preparado. Un ligero calentamiento podría ayudar a disolver la timidina.</td></tr><tr><td>Nocodazol</td><td>SIGMA</td><td>M-1404</td><td>Solución madre en DMSO almacenada a -20 &ordm; C en pequeñas alícuotas</td></tr><tr><td>Hidroxiurea</td><td>SIGMA</td><td>H8627</td><td>Mitomicina C recién preparada</td></tr><tr><td>de Streptomyces caespitosus</td><td>SIGMA</td><td>M4287</td><td>1,5 mM solución madre en H2O estéril protegida de la luz y almacenada a 4 &ordm; C</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>SIGMA</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Yoduro de propidio</td><td>SIGMA</td><td>P4170</td><td>Solución madre en PBS estéril a 5 mg/ml, almacenado a 4 &ordm; C protegido de la luz.</td></tr><tr><td>PBS pH 7.6</td><td></td><td></td><td>Etanol casero</td></tr><tr><td></td><td>PANREAC</td><td>A3678,2500</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>SIGMA</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sodio</td><td>PANREAC 131655</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>ARNasa A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo</td> <td>TRIzolLifeTechnologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Cyclin E1 Anti-Cyclin E1</td><td>Cell Signaling</td><td>4129</td><td>dilución 1:1000 en leche al 5%, o/n, 4 &ordm; C</td></tr><tr><td>Anticiclina B1 anticuerpo</td><td>Cell Signaling</td><td>4135</td><td>dilución 1:1000 en leche al 5%, o/n, 4 &ordm; C</td></tr><tr><td>Anti-&beta;-actina</td><td>SIGMA</td><td>A-5441</td><td>dilución 1:3000 en leche al 5 %, 1 hr, RT</td></tr><tr><td>Anti-pH3 (Ser 10) antiboty</td><td>Millipore</td><td>06-570</td><td>Especificado en el protocolo</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-conejo AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>R37116</td><td>Especificado en el protocolo</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-ratón-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3697</td><td>Dilución 1:3000 en leche al 5 %, 1 hora,</td></tr><tr><td>anticuerpo RT Forward E2F1 (humano) &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; TGACATCACCAACGTCCTTGA</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Diseñado por la herramienta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Anticuerpo E2F1 inverso (humano)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; CTGTGCGAGGTCCTGGGTC</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Diseñado por la herramienta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Forward E2F7 anticuerpo (humano)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; GGAAAGGCAACAGCAAACTCT</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Diseñado por la herramienta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Anticuerpo E2F7 inverso (humano)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGA</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Diseñado por la herramienta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Forward p21Cip1 anticuerpo (humano)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; AGCAGAGGAAGACCATGTGGAC</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Diseñado por la herramienta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Reverso p21Cip1 anticuerpo (humano)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAG</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Diseñado por la herramienta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Forward TBP antibody (humano) gen de referencia&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Diseñado por la herramienta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Anticuerpo TBP inverso (humano)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Diseñado por la herramienta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Forward Oxa1L anticuerpo (humano) gen de referencia&nbsp; &nbsp; CACTTGCCAGAGATCCAGAAG&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Diseñado por la herramienta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Oxa1L inverso &nbsp; anticuerpo (humano)&nbsp; &nbsp; &nbsp; CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Diseñado por PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Power SYBRGreen PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4368702</td><td></td></tr><tr><td>FACS Tubes&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>551578</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Placa de reacción óptica de 96 pocillos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 mm Placa de cultivo con TC</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar placas de cultivo celular Corning 3506 de 6 pocillos</td><td>Microcentrífuga</td> refrigerada de sobremesa Corning <td>3506</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5415 R</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga refrigerada de sobremesa Jouan CR3.12</td><td>Jouan</td><td>743205604</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Lite espectrofotómetro</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-LITE-PR</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCalibur citómetro de flujo</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3 Sistema de PCR en tiempo real</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A28567</td><td></td></tr></tbody></table>

estudio de la expresión genética regulada por el ciclo celular mediante dos protocolos complementarios de sincronización celular

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

El programa de expresión génica del ciclo celular representa un paso crítico para comprender los procesos dependientes del ciclo celular y su papel en enfermedades como el cáncer. El análisis de expresión de genes regulado por el ciclo celular depende de la sincronización celular en fases específicas. Aquí se describe un método que utiliza dos protocolos de sincronización complementarios que se utiliza comúnmente para estudiar la variación periódica de la expresión génica durante el ciclo celular. Ambos procedimientos se basan en el bloqueo transitorio del ciclo celular en un punto definido. El protocolo de sincronización mediante el tratamiento con hidroxiurea (HU) conduce a la detención celular en la fase tardía G1 / S temprana, y la liberación de la detención mediada por HU proporciona una población celular que progresa uniformemente a través de S y G2 / M. El protocolo de sincronización mediante el tratamiento con timidina y nocodazol (Thy-Noc) bloquea células en mitosis temprana y la liberación de la detención mediada por Thy-Noc proporciona una población celular sincronizada adecuada para la fase G1 y la fase SIntente estudios La aplicación de ambos procedimientos requiere la monitorización de los perfiles de distribución del ciclo celular, que se realiza típicamente después de la tinción con yoduro de propidio (PI) de las células y el análisis mediado por citometría de flujo del contenido de ADN. Se muestra que el uso combinado de dos protocolos de sincronización es un enfoque robusto para determinar claramente los perfiles transcripcionales de los genes que se regulan diferencialmente en el ciclo celular ( es decir, E2F1 y E2F7), y por lo tanto para tener una mejor comprensión de su papel en el ciclo celular Procesos. Además, se demuestra que este enfoque es útil para el estudio de los mecanismos subyacentes a las terapias basadas en fármacos ( es decir, la mitomicina C, un agente anticancerígeno), ya que permite discriminar los genes que responden al agente genotóxico de los afectados exclusivamente por las perturbaciones del ciclo celular Impuesto por el agente.

Representación esquemática de los protocolos Thy-Noc y HU para la sincronización celular. La Figura 1 resume los pasos requeridos para la sincronización de células U2OS y la posterior recogida de muestras con el fin de verificar la progresión a través del ciclo celular y realizar análisis de expresión génica. Phospho-H3 y tinción PI son buenos parámetros ...

Presentamos dos protocolos de sincronización celular que proporcionan un contexto para el estudio de eventos relacionados con fases específicas del ciclo celular. Mostramos que este enfoque es útil para analizar la regulación de genes específicos en un ciclo celular no perturbado o en la exposición a agentes que afectan el ciclo celular.

Estudio de la expresión genética regulada por el ciclo celular mediante dos protocolos complementarios de sincronización celular

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

El objetivo general de este protocolo es proporcionar un contexto para el análisis de la expresión génica de manera específica al ciclo celular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer relacionadas con eventos transcripcionales dependientes del ciclo celular que subyacen a la transformación maligna, así como al tratamiento contra el cáncer. La principal ventaja de este protocolo es que establece con precisión los patrones de expresión génica específicos de cada fase del ciclo celular, tanto en dos condiciones diferentes como tras la exposición a quimioterapia.Las células U2OS se utilizan para este experimento y deben sembrarse en placas de 100 milímetros por la tarde alrededor de las siete p.m. para que los pasos subsiguientes puedan realizarse durante la jornada laboral. Permita que las células se adhieran incubando las placas a 37 grados celsius en una atmósfera humedecida con 5%CO2 durante 24 horas.Al día siguiente, examine las células para confirmar que se encuentran al 50 % de confluencia. Para el bloqueo con timidina, agregue 100 microlitros de una solución stock de timidina recién preparada a 200 milimolares a cada placa de cultivo de 100

studying-cell-cycle-regulated-gene-expression-two-complementary-cell

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Determinar la posición del ciclo celular de una población de células, o la comprensión de cómo afectan a la proliferación de señales, puede ser fácilmente medido por citometría de flujo utilizando este protocolo. Se presenta un enfoque simple experimental para la tinción de células y la cuantificación de su posición en el ciclo celular.

Análisis de la posición del ciclo celular en células de mamífero

Rastreo cambios sutiles en la progresión y la cinética de las fases del ciclo celular puede llevarse a cabo mediante el uso de una combinación de marcaje metabólico de los ácidos nucleicos con BrdU y tinción de ADN genómico total a través de yoduro de propidio. Este método evita la necesidad de sincronización química de ciclo de las células, impidiendo así la introducción de daño en el DNA no específico, que a su vez afecta a la progresión del ciclo celular.

Célula de medida Cinética la progresión del ciclo con el etiquetado metabólico y Citometría de Flujo

La sincronización de las células bacterianas es esencial para los estudios del ciclo y desarrollo de las células bacterianas.  Caulobacter crescentus es sincronizable a través de la centrifugación por densidad, lo que permite una herramienta rápida y potente para el estudio del ciclo celular bacteriano.  Aquí proporcionamos un protocolo detallado para la sincronización de las células Caulobacter.

Sincronización de<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Para la Investigación del Ciclo Celular Bacteriana

Este protocolo describe el uso de bromodesoxiuridina (BrdU) para permitir la absorción de la seguimiento temporal de las células que estaban en fase S en un punto específico en el tiempo. La adición de colorantes de ADN y el etiquetado de anticuerpos facilita el análisis detallado del destino de las células en fase S en épocas posteriores.

Seguimiento temporal de la progresión del ciclo celular El uso de citometría de flujo sin la necesidad de sincronización

Presentamos un protocolo para sincronización de timidina doble de células HeLa, seguido por el análisis mediante microscopía confocal de alta resolución. Este método es clave para la obtención de gran número de células que proceden síncrono de fase S de la mitosis, lo que permite estudios sobre roles mitotic de proteínas multifuncionales que también poseen las funciones de interfase.

Combina la sincronización celular mitótica y microscopia Confocal de alta resolución para estudiar el papel de las proteínas multifuncional ciclo celular durante la Mitosis

Este protocolo describe un método no invasivo para identificar eficientemente las células de fase S para estudios de microscopía aguas abajo, como la medición del reclutamiento de proteínas de reparación del ADN mediante microirradiación láser.

Microirradiación láser para estudiar el reclutamiento de ADN durante la fase S

Un desafío de analizar experimentos sincronizados de series de tiempo es que los experimentos a menudo difieren en la duración de la recuperación de la sincronía y el período del ciclo celular. Por lo tanto, las mediciones de diferentes experimentos no pueden analizarse en conjunto o compararse fácilmente. Aquí, describimos un método para alinear experimentos para permitir comparaciones específicas de fase.

Alineación de datos sincronizados de series temporales utilizando el modelo de caracterización de la pérdida de sincronía del ciclo celular para comparaciones entre experimentos

El siguiente protocolo presenta la detección de focos de ADN monocatenario en la fase G1 del ciclo celular utilizando la sincronización del ciclo celular seguida de la tinción inmunofluorescente de RPA2.

Visualización de focos de ADN monocatenario en la fase G1 del ciclo celular

Este protocolo detalla dos métodos de detención del ciclo celular de levadura y liberación opcional, y elabora el uso de microscopía de fluorescencia para estudiar los procesos dependientes del ciclo celular en S. cerevisiae.

Manipulación y análisis de procesos dependientes del ciclo celular en levaduras en ciernes

Aquí, describimos los ajustes para monitorear en paralelo la bioluminiscencia circadiana y la actividad secretora de las células de los islotes humanos y los miotubos primarios. Para ello, empleamos la administración de genes lentivirales de un indicador de reloj central de luciferasa, seguido de sincronización in vitro y recolección del medio de salida por perifusión celular continua.

La medición paralela de la expresión de genes circadianos del reloj y Hormona en cultivos celulares primarios humanos

Aprende dos protocolos de sincronización celular para analizar la expresión génica regulada por el ciclo celular en células U2OS. Estos métodos permiten estudiar eventos transcripcionales en cáncer y evaluar efectos de quimioterapia.

Estudio de la expresión genética regulada por el ciclo celular mediante dos protocolos complementarios de sincronización celular (Video) | JoVE Journal

Estudio de la expresión genética regulada por el ciclo celular mediante dos protocolos complementarios de sincronización celular

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