Estudio de la expresión genética regulada por el ciclo celular mediante dos protocolos complementarios de sincronización celular

El objetivo general de este protocolo es proporcionar un contexto para el análisis de la expresión génica de una manera específica del ciclo celular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer relacionadas con los eventos transcripcionales dependientes del ciclo celular que subyacen a la transformación maligna, así como al tratamiento contra el cáncer. La principal ventaja de este protocolo es que establece con precisión patrones de expresión génica específicos de la fase del ciclo celular, tanto en condiciones de número dos como después de la exposición a quimioterapia.

Para este experimento se utilizan células U2OS, que deben sembrarse en placas de 100 milímetros por la noche, alrededor de las siete de la tarde, para que los pasos posteriores puedan llevarse a cabo durante las horas de trabajo. Deje que las células se adhieran incubando las placas a 37 grados centígrados en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 durante 24 horas.

Al día siguiente, examine las celdas para confirmar que están al 50% de confluencia. Para el bloque de timidina, agregue 100 microlitros de un caldo de timidina de 200 milimolares recién preparado a cada placa de cultivo de 100 milímetros. Incubar las células con timidina a 37 grados centígrados en una atmósfera humidificada con 5%CO2 durante 20 horas.

Al día siguiente, alrededor de las tres p.m., libere células del bloque de timidina mediante la eliminación del medio de crecimiento que contiene timidina. Lave las celdas dos veces con PBS 1X precalentado.

Y luego agregue 10 mililitros de medio completo a cada plato de 100 milímetros. Incubar las células a 37 grados centígrados durante cinco horas. Para la detención de células mitóticas, agregue nocodazol hasta una concentración final de 50 nanogramos por mililitro.

Incubar las células con nocodazol durante no más de 10 a 11 horas. A la mañana siguiente, entre las seis y las siete de la mañana, se revisan las células bajo el microscopio para confirmar que efectivamente están bloqueadas en G2-M, lo que se indica por su apariencia redondeada.

Separe las células mitóticas agitando cada placa y pipeteando suavemente el medio de crecimiento que contiene nocodazol con células desprendidas de cada placa de 100 milímetros. Combine las células mitóticas de todos los platos en un tubo estéril de 50 mililitros. Centrifugar 300 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.

Lave las celdas dos veces agregando PBS frío 1X, seguido de centrifugación. Después de retirar el PBS del segundo lavado, vuelva a suspender las células mitóticas en un medio de cultivo completo. Guarde dos mililitros para la extracción de ARN y dos mililitros para el análisis FACS para el punto de tiempo de cero horas.

Vuelva a colocar las células mitóticas restantes para los puntos de tiempo posteriores en placas de seis pocillos. Para comenzar este procedimiento, siembre 0,25 veces 10 a la sexta celda U2OS por pocillo en placas de seis pocillos. En la cubierta de cada placa de seis pocillos, escriba la condición experimental de cada pozo.

Por ejemplo, no tratados o tratados con diferente concentración de fármaco y puntos de tiempo. Deje que las células se adhieran incubando las placas de seis pocillos durante la noche. A la mañana siguiente, examine las celdas para confirmar que están al 50% de confluencia.

Retire el medio completo de los pocillos y agregue dos mililitros de medio DMEM-glutamina precalentado y libre de FBS por pocillo. Incuba las células durante 24 horas más. Para detener las células con hidroxiurea, retire el medio de los pocillos y reemplácelo con cuatro hidroxiureas micromolares recién preparadas que contengan medio completo.

Incubar las células en un medio que contenga hidroxiurea durante 24 horas. Antes de liberar células del paro mediado por hidroxiurea, revise las células para confirmar que están detenidas. Retire el medio que contiene hidroxiurea de los pocillos y enjuague los pocillos dos veces con PBS 1X precalentado.

Después de quitar el PBS del segundo lavado, agregue dos mililitros de medio completo por pocillo. Mantenga las placas en la incubadora hasta la recolección de la muestra. Las muestras de ambos protocolos de sincronización se recogen de la misma manera para el análisis FACS y para la extracción de ARN.

Para el análisis de FACS, enjuague cada pocillo con dos mililitros de PBS 1X precalentado y luego agregue 0,3 mililitros de solución de tripsina-EDTA precalentada para separar las celdas. Pasados cinco minutos, inactive la tripsina-EDTA añadiendo un mililitro de medio completo. Recoja cada muestra en un tubo separado de 15 mililitros.

Centrifugar las celdas a 300 veces G a temperatura ambiente durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante, lave con 1X PBS y vuelva a centrifugar. Retire el PBS y guarde el pellet celular.

Para fijar las células, vuelva a suspender cada gránulo celular en un mililitro de etanol refrigerado al 70% mediante un suave vórtice. Coloque las células en hielo durante aproximadamente 15 minutos antes de la tinción con yoduro de propidio y el análisis FACS. Para la extracción de ARN, retire el medio y enjuague cada pozo con dos mililitros de PBS 1X precalentado.

Lleve la placa a un armario de seguridad y añada un mililitro de reactivo de aislamiento de ARN adecuado por pocillo. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para pipetear y lisar las células y, a continuación, transferir cada lisado celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Comience el procedimiento de extracción de ARN recuperando del congelador los tubos de microcentrífuga con muestras en reactivo de aislamiento de ARN y descongelándolos a temperatura ambiente dentro de un gabinete de seguridad para productos químicos. Agregue 400 microlitros de cloroformo a cada muestra y agite vigorosamente sin vórtice hasta que esté completamente mezclado. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Centrifugar los tubos durante 15 minutos en una microcentrífuga de sobremesa. Transfiera la fase acuosa de cada muestra a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 milímetros. Agregue un volumen de etanol 100% lentamente, gota a gota, a la fase acuosa mientras mezcla.

No centrifugar. Transfiera hasta 700 microlitros de cada muestra, incluido cualquier precipitado que pueda haberse formado, en una columna de centrifugación en un tubo de recolección de dos mililitros proporcionado por un minikit comercial de preparación de ARN, y cierre la tapa. Centrifugar durante 15 segundos.

Deseche el flujo continuo. Si se parte de más de 700 microlitros por muestra, transfiera la muestra restante a la columna de centrifugación y vuelva a centrifugar. Después de lavar el ARN según las instrucciones del fabricante, eluya cada muestra pipeteando de 30 a 40 microlitros de agua libre de nucleasa en la columna de centrifugación y centrifugando a temperatura ambiente durante un minuto.

Determine la concentración de ARN y la pureza de las muestras mediante mediciones de absorbancia. Almacene las muestras de ARN a menos 80 grados centígrados hasta que se utilicen para el análisis de expresión génica. El tratamiento mediante el protocolo timidina-nocodazol detiene las células U2OS en la entrada de la fase m y proporciona una población celular que progresa sincrónicamente a través de la fase G1 y hacia la fase S, como se muestra en el análisis de citometría de flujo.

El tratamiento mediante el protocolo de hidroxiurea detiene las células en el límite G1/S. Tras la liberación, las células hacen la transición sincrónica a través de las fases S y G2. El protocolo timidina-nocodazol es el más adecuado para analizar los perfiles de ARNm de genes con máxima expresión durante la fase G1.

Como se muestra para la expresión E2F1. Por el contrario, el protocolo de hidroxiurea funciona mejor para el análisis de genes con expresión preferencial en S o G2, como se ilustra para la expresión de E2F7. El ciclo celular suele ser perturbado por fármacos antitumorales, se muestra una detención permanente de la fase G2 impuesta por la mitomicina C en células sincronizadas con hidroxiurea.

La sincronización celular ayuda a discriminar los genes que responden al agente antitumoral de aquellos que se ven afectados únicamente por las perturbaciones del ciclo celular impuestas por el agente, por ejemplo, una reducción en los niveles de ARNm E2F1 después del tratamiento con mitomicina C es probablemente un efecto indirecto del fármaco en la dinámica del ciclo celular. Por el contrario, el pico de expresión de ARNm de p21-Cip1 después del tratamiento con mitomicina C es directamente el resultado de un programa transcripcional desencadenado por este fármaco. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar análisis transcriptómicos y proteómicos de todo el genoma, con el fin de desentrañar los cambios globales en la expresión génica que afectan a fases específicas del ciclo celular.

Ya sea en las condiciones número dos o en tratamientos antitumorales. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de los procedimientos que se requieren para realizar análisis de expresión génica en cultivos celulares sincronizados. No olvide que trabajar con yoduro de propidio o reactivos de aislamiento de ARN puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como guantes y gabinete de seguridad para productos químicos al realizar este procedimiento.