Manipulación y análisis de procesos dependientes del ciclo celular en levaduras en ciernes

Estudiamos cómo las células en división transmiten fielmente sus cromosomas durante la mitosis, centrándonos en las máquinas moleculares y los mecanismos que aseguran una segregación precisa de los cromosomas. Sincronizamos células para estudiar procesos moleculares que cambian con el ciclo celular. Sin estos métodos, los cambios clave estarían ocultos en una población celular no sincronizada.

En comparación con otros métodos de sincronización, el arresto por factor alfa en mutantes BAR1 proporciona un arresto G1 más limpio y reversible, permitiéndonos seguir el progreso sincrónico de un cultivo de levadura completo a lo largo del ciclo. Nuestro trabajo revela cambios dinámicos en la localización y actividad de proteínas a lo largo del ciclo celular, arrojando luz sobre procesos mitóticos clave, como la segregación cromosómica y el mantenimiento del husoma. Para empezar, inocular la levadura en 25 mililitros de medio YPAD e incubar durante la noche para alcanzar una densidad óptica de 600 nanómetros entre 0,5 y 2,0.

Diluir las células de levadura hasta una densidad óptica de 600 nanómetros de 0,5. Añade factor alfa al cultivo para alcanzar una concentración final de un microgramo por mililitro. Entre 2,5 y 3,5 horas después de la adición del factor alfa, se cuenta el porcentaje de células shmooed no gemeadas bajo un microscopio para evaluar la detención celular.

Luego, centrifuga el cultivo en una centrifugadora a 3.000g durante tres a cinco minutos a 23 grados Celsius. Vierte cuidadosamente el sobrenadante para eliminar el factor alfa. Resuspende el pellet celular en 25 mililitros de YPAD que contienen 1% de dimetil sulfóxido para lavar las células.

Transfiere el pellet celular a un tubo nuevo y repite los lavados dos veces más, para un total de tres lavados y eliminar cualquier factor alfa residual. A continuación, añade YPAD a las células lavadas para llevar el volumen final a 25 mililitros y transfiere la suspensión a un nuevo matraz para su posterior incubación o uso. Recoge la muestra de punto temporal de cero minutos inmediatamente después de la liberación y fija la muestra.

A los 60 minutos tras la liberación, evalúa la sincronía de la población celular bajo un microscopio óptico. Si se desea, añadir el factor alfa de nuevo a los 60 minutos después de la liberación a una concentración final de un microgramo por mililitro para bloquear la progresión hacia el siguiente ciclo celular. Continúa recogiendo muestras de puntos de tiempo cada 15 minutos hasta 180 minutos o durante el tiempo que sea necesario.

Para fijar las células de levadura, centrifuga un mililitro de cultivo durante un minuto a máxima velocidad. Aspira completamente el sobrenadante. Luego, resuspende el pellet en 500 microlitros de solución fijadora e incuba a 23 grados Celsius durante dos a quince minutos.

Tras centrifugar las células fijas, aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón de fosfato potásico de 0,1 molares a pH 6,4. Antes de la imagen, centrifuga las celdas fijas a 23 grados Celsius durante un minuto a máxima velocidad. Una vez aspirado el sobrenadante, resuspende el pellet en 10 a 100 microlitros de solución de Triton, DAPI y sorbitol.

Pipetear aproximadamente 0,8 microlitros de la suspensión de celda teñida directamente sobre el centro de una cubierta limpia. Utiliza una punta de pipeta para extender suavemente la gota en una zona circular de aproximadamente un centímetro cuadrado. Coloca la cubierta sobre una lámina de microscopía.

Con un Kimwipe, presiona suavemente alrededor de los bordes de la funda para distribuir la muestra de forma uniforme. Luego, sella los bordes de la cubierta con esmalte de uñas para asegurar la muestra. Lleva el portaobjetos preparado a un microscopio equipado con un aumento de 60 veces, un objetivo de inmersión en aceite con apertura numérica de 1,42 y un conjunto láser y filtro rojo, verde, azul y rojo lejano.

Enfoca el microscopio en las células de levadura adheridas al abrigo. Una vez enfocado, ajusta los ajustes de exposición de cada canal de fluorescencia para lograr una relación señal-ruido de al menos tres a uno. Ajusta la configuración de adquisición para recoger entre 14 y 20 imágenes de la pila z, con cada corte separado por 0,2 micrómetros, cubriendo una profundidad z total de dos a cuatro micrómetros.

En microscopios equipados con módulos de postprocesamiento, selecciona las opciones de Deconvolución y Proyección Rápida para cada imagen de la pila z. Adquiere pilas z de la muestra, capturando suficientes imágenes para registrar aproximadamente entre 100 y 200 células de levadura para cada condición experimental o punto temporal. Para el análisis, abre las imágenes proyectadas en el software ImageJ.

Ajusta el brillo y el contraste de cada canal de fluorescencia para mejorar la visibilidad. Para analizar la progresión del ciclo celular, cuenta 100 células para cada punto temporal y clasifícalas como conteniendo uno o dos núcleos. Para calcular el porcentaje de celdas que muestran puntos Stu2-GFP, estandariza los ajustes de brillo del canal verde en todas las imágenes.

Las células de conteo muestran puntos Stu2-GFP que co-localizan con Spc110-mCherry puncta como positivos para localización de cinetocores. A continuación, para cuantificar la intensidad de los puntos proteicos, utiliza la herramienta de selección a mano alzada para delinear la región de interés alrededor de la señal. Añade la selección al Administrador de Regiones de Interés pulsando T o eligiendo la opción en el menú del Gestor de ROI.

En el Gestor de ROI, haz clic en Medir para calcular la intensidad del punto. Para visualizar los cambios a lo largo del tiempo, grafica la intensidad media con intervalos de confianza del 95% para cada momento temporal. Cuenta aproximadamente 100 células por condición.

En células detenidas por G1, Stu2-GFP se localizó en un único punto proximal de polo del husillo con señal adicional dispersa a lo largo de los microtúbulos citoplasmáticos. A los 60 minutos de su lanzamiento, Stu2-GFP se localizó como dos puntos adyacentes a polos duplicados del husillo marcados por Spc110-mCherry. A los 90 minutos, durante la anáfase, Stu2-GFP apareció tanto cerca de los polos del husillo como a lo largo de los microtúbulos que abarcan el eje único.

Tras la salida mitótica, a los 120 minutos, Stu2-GFP reapareció en los microtúbulos astrales del citoplasma. La cuantificación reveló que la intensidad de Stu2-GFP cerca de los polos del huso aumentó durante la mitosis temprana, alcanzando su pico antes de la anáfase y disminuyendo posteriormente. El porcentaje de células binucleadas alcanzó un pico de aproximadamente 90 minutos, indicando una entrada sincronizada en anafase.