Integración de la Extracción de Fase Sólida Miniaturizada y la Detección de LC-MS / MS de 3-Nitrotirosina en Orina Humana para Aplicaciones Clínicas

El objetivo general de esta extracción en fase sólida miniaturizada combinada con el ensayo LC-MS/MS es cuantificar con precisión la 3-nitrotirosina libre en la orina humana para aplicaciones clínicas. La 3-nitrotirosina libre ayuda a mejorar los rendimientos y es un biomarcador del estrés oxidativo. Sin embargo, seguirá siendo un desafío especial cuantificar con precisión la 3-nitrotirosina en emergencias biológicas para aplicaciones clínicas debido a la sensibilidad insuficiente, la selectividad y las engorrosas preparaciones de las muestras.

Esta técnica, que incorpora una extracción efectiva en fase sólida en una interacción LC-MS/MS altamente sensible, permite la determinación rápida, específica y precisa de niveles bajos de 3-nitrotirosina endógena en la orina humana sin la necesidad de constitución y LC bidimensional. Aunque este método puede proporcionar información sobre la investigación del estrés oxidativo, también se puede aplicar a otras condiciones patológicas como trastornos inflamatorios y neurodegenerativos complejos. Las implicaciones de esta técnica podrían extenderse hacia el seguimiento de la eficacia del tratamiento antioxidante, ya que los antioxidantes pueden reducir el nivel de 3-nitrotirosina. Para comenzar este procedimiento, el vórtice preparó y descongeló previamente muestras de orina, patrones y muestras de control de calidad.

Después del vórtice, agregue 250 microlitros de cada muestra y estándar a 32 pocillos de una placa de recolección limpia de dos mililitros de 96 pocillos. Agregue 50 microlitros de solución de trabajo estándar interna previamente preparada a cada pocillo, excepto el pocillo de muestra en blanco doble. A continuación, añada 50 microlitros de agua de grado LC-MS con un 0,01% de ácido fórmico al pocillo de muestra en blanco doble.

A continuación, agregue 250 microlitros de agua de grado LC-MS con 0.1% de ácido fórmico a los pozos. A continuación, mezcle las soluciones tres veces con una pipeta de ocho canales y cubra la placa hasta que se cargue el SPE. A continuación, coloque una microplaca de extracción de 96 pocillos de intercambio catiónico de modo mixto y un depósito de recolección en un procesador de presión positiva.

La extracción en fase sólida que utiliza una microplaca de intercambio catiónico de modo mixto permite la limpieza simultánea de la muestra y el enriquecimiento de 3-nitrotirosina en una sola extracción. Acondicione la placa de extracción haciendo fluir 200 microlitros de metanol de grado LC-MS a través del sorbente. Gire la perilla de ajuste de presión en el procesador de presión positiva para establecer una presión positiva baja para permitir que la mezcla fluya lentamente a través del sorbente, ajustando la presión si es necesario.

Equilibre haciendo fluir 200 microlitros de agua de grado LC-MS con ácido fórmico al 2% a través del sorbente. Con una pipeta de ocho canales, cargue cuidadosamente todo el volumen de cada una de las muestras premezcladas en la placa de extracción preacondicionada. Establezca una presión positiva baja en el procesador de presión positiva para permitir que la mezcla fluya lentamente a través del sorbente, ajustando la presión según sea necesario.

Después de esto, lave los pozos haciendo fluir 200 microlitros de agua de grado LC-MS con ácido fórmico al 2% a través del sorbedor. Después de lavar con 200 microlitros de metanol y agua, ajuste el procesador de presión positiva a alta presión para secar los pocillos. Una vez que los pozos estén secos, reemplace el depósito con una placa de recolección limpia de dos mililitros de 96 pocillos.

Ahora, aplique 50 microlitros de una solución de acetato de amonio de 25 milimolares para eluir lentamente el analito retenido y el patrón interno de la placa de extracción. Luego agregue 50 microlitros de agua de grado LC-MS con ácido fórmico al 5% para neutralizar el eluyente. La aplicación de una solución suave de acetato de amonio para la elución de 3-nitrotirosina proporciona una selectividad y sensibilidad sustancialmente mejoradas.

Mezcle las muestras con una pipeta de ocho canales tres veces en preparación para el análisis de espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida. Después de configurar el instrumento LC-MS/MS, equilibre el método LC-MS/MS de 3-nitrotirosina durante 10 minutos con la elución en gradiente LC. Al equilibrar el método, el gradiente LC se equilibrará con la elución del gradiente inicial.

La temperatura del muestreador automático se establecerá en cuatro grados centígrados y la temperatura del horno se establecerá en 30 grados centígrados. Cree una lista de lotes que incluya las muestras de orina, los estándares y las muestras de control de calidad. A continuación, inicie el lote inyectando las muestras preparadas.

Después de completar todas las inyecciones, establezca una curva estándar con un rango de 10 a 2.500 picogramos por mililitro para la cuantificación de 3-nitrotirosina mediante regresión lineal de la relación de área máxima de 3-nitrotirosina y el patrón interno frente a la concentración nominal de 3-nitrotirosina. Finalmente, cuantifique todas las demás muestras utilizando la curva estándar establecida y determine si las muestras de control de calidad se encuentran dentro del rango establecido. Los datos de LC de muestras de orina humana muestran que la 3-nitrotirosina se separa cromatográficamente de otros análogos de tirosina estructuralmente similares en la condición optimizada que elimina las interferencias de coelución debidas a estos compuestos enormemente excesivos y, en consecuencia, mejora el grado de selectividad del ensayo.

No se observa una señal de 3-nitrotirosina en el cromatograma de monitoreo de reacción múltiple de la muestra en blanco doble, lo que indica que no se forma 3-nitrotirosina durante todo el proceso. Aquí se muestran cromatogramas representativos de monitoreo de reacciones múltiples de 3-nitrotirosina y patrón interno para un individuo sano. No se observaron señales interferentes en los tiempos de retención de 3-nitrotirosina y patrón interno.

Aquí se muestra una curva estándar representativa. Se determinó que el límite de detección definido como la concentración más baja con una relación señal/ruido superior a tres era de dos picogramos por mililitro. Se determinó que el límite inferior de cuantificación es de 10 picogramos por mililitro y se define como la concentración más baja dentro del 20% de imprecisión y exactitud con una relación señal/ruido superior a 10.

El ensayo de integración afinado ofrece una especificidad, sensibilidad y rendimiento significativamente mejorados con un efecto de matriz, uso de sorbente y eliminación de residuos reducidos. Con este ensayo simple y rápido, la muestra de orina se puede procesar en 24 horas. Hay que tener en cuenta la toma de muestras de orina no invasiva y económica.

Este método notablemente mejorado es muy adecuado para evaluar el papel de la 3-nitrotirosina como biomarcador de estrés oxidativo en estudios preclínicos y clínicos.