Integración de la Extracción de Fase Sólida Miniaturizada y la Detección de LC-MS / MS de 3-Nitrotirosina en Orina Humana para Aplicaciones Clínicas

El objetivo general de este ensayo de extracción en fase sólida miniaturizada combinada con LC-MS/MS es cuantificar con precisión la 3-nitrotirosina libre en orina humana para aplicaciones clínicas. La 3-nitrotirosina libre proporciona rendimientos y sirve como biomarcador del estrés oxidativo. Sin embargo, seguirá siendo un desafío especial cuantificar con precisión la 3-nitrotirosina en emergencias biológicas para aplicaciones clínicas debido a una sensibilidad y selectividad insuficientes, así como a preparaciones de muestras engorrosas.

Esta técnica, que incorpora una extracción en fase sólida eficaz en una interacción LC-MS/MS altamente sensible, permite la determinación rápida, específica y precisa de niveles bajos de 3-nitrotyrosina endógena en orina humana sin necesidad de constitución ni cromatografía líquida bidimensional. Aunque este método puede aportar información sobre la investigación del estrés oxidativo, también puede aplicarse a otras condiciones patológicas, como trastornos inflamatorios complejos y enfermedades neurodegenerativas. Las implicaciones de esta técnica podrían extenderse al monitoreo de la eficacia del tratamiento antioxidante, ya que el nivel de 3-nitrotyrosina puede reducirse mediante antioxidantes. Para comenzar este procedimiento, agite mediante vórtex muestras de orina previamente preparadas y descongeladas, estándares y muestras de control de calidad.

Después de agitar en vórtex, añada 250 microlitros de cada muestra y estándar a 32 pozos de una placa de recolección limpia de 96 pozos de dos mililitros. Añada 50 microlitros de la solución de trabajo del estándar interno previamente preparada a cada pozo, excepto al pozo de la muestra doble blanco. Luego añada 50 microlitros de agua grado LC-MS con 0,01 % de ácido fórmico al pozo de la muestra doble blanco.

A continuación, agregue 250 microlitros de agua grado LC-MS con 0,1 % de ácido fórmico a los pocillos. Luego, mezcle las soluciones tres veces con una pipeta de ocho canales y cubra la placa hasta la carga para la extracción en fase sólida (SPE). A continuación, coloque una microplaca de extracción de 96 pocillos con intercambio catiónico mixto y un depósito de recolección en un procesador de presión positiva.

La extracción en fase sólida que utiliza una microplaca de intercambio catiónico de modo mixto permite la limpieza simultánea de la muestra y el enriquecimiento de 3-nitrotirosina en una sola extracción. Condicione la placa de extracción pasando 200 microlitros de metanol de grado LC-MS a través del sorbente. Gire el botón de ajuste de presión en el procesador de presión positiva para establecer una presión positiva baja con el fin de permitir que la mezcla fluya lentamente a través del sorbente, ajustando la presión si es necesario.

Equilibrar haciendo pasar 200 microlitros de agua grado LC-MS con 2% de ácido fórmico a través del sorbente. Utilizando una pipeta de ocho canales, cargar cuidadosamente todo el volumen de cada una de las muestras premezcladas en la placa de extracción acondicionada previamente. Establecer una presión positiva baja en el procesador de presión positiva para permitir que la mezcla fluya lentamente a través del sorbente, ajustando la presión según sea necesario.

A continuación, lave los pocillos haciendo pasar 200 microlitros de agua grado LC-MS con 2% de ácido fórmico a través del sorbente. Después de lavar con 200 microlitros de metanol y agua, coloque el procesador de presión positiva a alta presión para secar los pocillos. Una vez que los pocillos estén secos, sustituya el depósito por una placa de recolección limpia de 96 pocillos de dos mililitros.

Ahora, aplique 50 microlitros de una solución de acetato de amonio 25 milimolar para eluir lentamente el analito retenido y el estándar interno de la placa de extracción. Luego, agregue 50 microlitros de agua grado LC-MS con 5% de ácido fórmico para neutralizar el eluyente. La aplicación de una solución suave de acetato de amonio para la elución de 3-nitrotirosina proporciona una selectividad y sensibilidad considerablemente mejoradas.

Mezcle las muestras tres veces con una pipeta de ocho canales como preparación para el análisis por cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem. Después de configurar el instrumento LC-MS/MS, equilibre el método LC-MS/MS de 3-nitrotirosina durante 10 minutos con la elución en gradiente de LC. Al equilibrar el método, el gradiente de LC se equilibrará hasta el inicio de la elución en gradiente.

La temperatura del muestreador automático se ajustará a cuatro grados Celsius y la temperatura del horno se ajustará a 30 grados Celsius. Cree una lista de lotes que incluya las muestras de orina, los patrones y las muestras de control de calidad. A continuación, inicie el lote inyectando las muestras preparadas.

Después de completar todas las inyecciones, establezca una curva patrón con un rango de 10 a 2.500 picogramos por mililitro para la cuantificación de 3-nitro-tirosina mediante regresión lineal de la relación del área del pico de 3-nitro-tirosina y el estándar interno frente a la concentración nominal de 3-nitro-tirosina. Finalmente, cuantifique todas las demás muestras utilizando la curva patrón establecida y determine si las muestras de control de calidad caen dentro del rango establecido. Los datos de LC de muestras de orina humana muestran que la 3-nitro-tirosina se separa cromatográficamente de otros análogos estructuralmente similares de tirosina bajo la condición optimizada, lo que elimina interferencias por coelución debidas a estos compuestos ampliamente excesivos y, en consecuencia, mejora el grado de selectividad del ensayo.

No se observa una señal de 3-nitrotirosina en el cromatograma de monitoreo de reacciones múltiples de la muestra doble en blanco, lo que indica que la 3-nitrotirosina no se forma durante todo el proceso. Aquí se muestran cromatogramas representativos de monitoreo de reacciones múltiples de 3-nitrotirosina y del estándar interno para un individuo sano. No se observaron señales interferentes en los tiempos de retención de la 3-nitrotirosina y del estándar interno.

Se muestra aquí una curva estándar representativa. El límite de detección, definido como la concentración más baja con una relación señal-ruido mayor que tres, se determinó que era de dos picogramos por mililitro. El límite inferior de cuantificación se determinó que era de 10 picogramos por mililitro y se define como la concentración más baja con una imprecisión y exactitud dentro del 20 % y una relación señal-ruido mayor que 10.

El ensayo de integración finamente ajustado ofrece una especificidad, sensibilidad y capacidad significativamente mejoradas, con un efecto de matriz reducido, menor uso de sorbente y menor disposición de residuos. Con este ensayo sencillo y rápido, la muestra de orina puede procesarse en menos de 24 horas. Téngase en cuenta el muestreo de orina no invasivo y de bajo costo.

Este método notablemente mejorado es muy adecuado para evaluar el papel del 3-nitrotirosina como biomarcador de estrés oxidativo en estudios preclínicos y clínicos.