Cuantificación simultánea de kynureninas seleccionadas analizadas por cromatografía líquida-espectrometría de masas en medio recogido de cultivos celulares oncológicos

Las quinureninas se asocian con la regulación de la respuesta inmunitaria en varias enfermedades, incluido el cáncer. Los métodos fiables y validados para identificar múltiples quinureninas ayudan en el desarrollo de terapias más eficaces. Nuestro protocolo utiliza cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas para identificar los diferentes metabolitos de triptófano generados por la vía de la quinurenina en medio recogido de cultivos de células cancerosas.

Los usuarios sin experiencia pueden tener algunas dificultades durante la preparación de la muestra o los pasos de adquisición e interpretación de datos. Siguiendo nuestro protocolo y recomendaciones, se pueden evitar errores y obtener datos fiables. Para preparar soluciones madre de los reactivos, pese 0,3 miligramos de cada reactivo en un vial con la máxima precisión y disuelva cada reactivo en 300 microlitros del disolvente adecuado para obtener soluciones madre de un gramo por litro de cada reactivo.

Para preparar un medio de cultivo tratado con carbón, pese 280 miligramos de carbón activado en un tubo cónico y agregue cinco mililitros del medio líquido preparado para cultivar las células de interés. Agite el tubo con el medio y el carbón en un balancín durante dos horas a temperatura ambiente y 50 oscilaciones por minuto. Al final de la incubación, sedimente el carbón por centrifugación y recoja cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el carbón, luego filtre el medio con un filtro de jeringa de 0,45 micrómetros.

Para preparar la solución de calibración, agregue el medio de cultivo tratado con carbón vegetal con 0,75 microlitros de solución 3NT de 0,1 gramos por litro y agregue quinurenina 3-H, quinurenina 3-HAA y ácido xanturénico a al menos seis concentraciones diferentes para cubrir todos los rangos de calibración hasta un volumen final de 150 microlitros por muestra. Después del vórtice, agregue 150 microlitros de metanol frío de menos 20 grados Celsius suplementado con ácido fórmico al 1% a cada tubo para la desproteinización de la muestra y vuelva a tapar y vórtice los tubos. Después de una incubación de 40 minutos a menos 20 grados centígrados, centrifugar las muestras y utilizar una pipeta automática para transferir 270 microlitros de cada sobrenadante a viales individuales de vidrio de fondo plano.

Coloque los viales en un evaporador y utilice el programa adecuado para las fracciones de metanol de agua para evaporar suavemente los componentes volátiles durante unos 30 minutos. Cuando los tubos estén secos, reconstituya cada muestra en 60 microlitros de ácido fórmico al 0,1% en agua y agite las muestras antes de transferir cada solución a tubos individuales de 1,5 mililitros para la centrifugación. Sin alterar el sedimento, transfiera los sobrenadantes a viales cromatográficos con inserciones cónicas de vidrio y coloque los viales en un muestreador automático LC-MS.

Antes de procesar las muestras, purgue el sistema LC con la fase móvil para eliminar las burbujas y cebar todos los canales de solvente. A continuación, enjuague el protector y la columna analítica con acetonitrilo al 100 % durante unos 30 minutos antes de lavar el sistema con un disolvente A al 100 % hasta que se observe una presión estable en la columna, luego configure los parámetros de LC apropiados en el software de adquisición de datos y construya una lista de trabajo para ejecutar las muestras en el sistema de LC. Para construir la curva de calibración, en el software de adquisición de datos, agregue los estándares de calibración a la lista de trabajo y ejecute los patrones por triplicado, luego integre y mida el área máxima correspondiente a 3-hidroxiquinurenina, quinurenina, ácido 3-hidroxiantranílico, 3-nitrotirosina y ácido xanturénico en un tiempo de retención de aproximadamente 4,4, 10, 16, 21 y 30 minutos respectivamente.

Para recolectar muestras de sobrenadante de un cultivo celular in vitro, después de 48 horas de cultivo celular estándar de las células de interés, transfiera 500 microlitros de sobrenadante de cada pocillo a tubos individuales de 1,5 mililitros y elimine los restos celulares por centrifugación, luego transfiera los sobrenadantes medios a nuevos tubos para el almacenamiento a menos 80 grados Celsius hasta el análisis y mantenga los gránulos celulares a menos 20 grados Celsius hasta el análisis de estimación de proteínas. Para preparar muestras para el análisis de LC-MS, transfiera 149,25 microlitros de cada muestra de medio de cultivo descongelado a un nuevo tubo de 1,5 microlitros y agregue 0,75 microlitros de solución 3NT de 0,1 gramos por litro a cada tubo. Después de preparar las muestras como se ha demostrado, agregue 150 microlitros de metanol de menos 20 grados Celsius suplementado con ácido fórmico al 1% a cada tubo y prepare la muestra para el análisis de LC-MS como se demuestra.

Cuando la lista de trabajo esté completa, mida el área máxima de cada analito y utilice una ecuación de calibración lineal individual dedicada a cada analito para calcular las concentraciones de los analitos presentes en cada muestra experimental. Para evaluar el contenido de proteínas celulares correspondientes a la muestra de medio de cultivo, vuelva a suspender cada gránulo celular en 100 microlitros de PBS y congele las muestras a menos 20 grados centígrados durante una hora antes de descongelarlas en hielo. Después de congelar-descongelar las muestras tres veces, recoja los lisados celulares por centrifugación y transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos sin alterar los gránulos.

Diluir la muestra 10 veces con PBS fresco y añadir los volúmenes apropiados de solución patrón de albúmina sérica bovina por duplicado a los pocillos apropiados de una placa de 96 pocillos. Cargue de 10 a 15 microlitros de cada sobrenadante de muestra de lisado de celda en los pocillos apropiados de la placa de 96 pocillos y llene tanto el pocillo estándar como el pocillo de muestra hasta un volumen final de 50 microlitros de PBS por pocillo. A continuación, añada 200 microlitros de un reactivo Bradford diluido cinco veces con agua ultrapura a cada pocillo e incube la placa durante al menos cinco minutos a temperatura ambiente.

Al final de la incubación, cargue la placa en un lector de microplacas y mida la absorbancia a 595 nanómetros, luego construya una curva de calibración para permitir el cálculo de la cantidad de proteína en cada muestra y divida la concentración de cada quinurenina por el contenido total de proteína para normalizar la cantidad de quinurenina en cada muestra por un microgramo de proteína. Estos son los resultados de la espectrometría de masas de cuadrupolo simple obtenidos durante el análisis del medio que contenía 4,5 gramos por litro de D-glucosa y 10% de suero bovino fetal. Observe el pequeño pico que indica la presencia de quinurenina dentro de la muestra.

Ejecute una muestra de control de calidad antes de requerir los datos reales de la muestra para confirmar los tiempos de retención adecuados de los analitos, ya que se puede observar un cambio en las señales de LC o discordancias. Los componentes de la matriz coeluyente pueden generar iones con la relación de carga maestra seleccionada para los analitos objetivo. Por ejemplo, en este análisis, el pico del compuesto desconocido apareció en el período de escaneo durante el cual se monitoreó la relación de iones de carga maestra 206.

Debido a la incompatibilidad del tiempo de retención, la señal no correspondía al analito. Aunque el isótopo de triptófano compartía el mismo ion que la relación de carga maestra 206, el análisis cromatográfico reveló que la señal de triptófano estaba bien separada de la señal de ácido xanturénico, lo que indica que el nivel de triptófano presente en el medio de células cancerosas analizado no afectó la cuantificación del ácido xanturénico. Este análisis del medio de cultivo de dos tipos de líneas celulares cancerosas demuestra que las células epiteliales de cáncer de mama humano evaluadas liberaron diferentes cantidades de metabolitos de triptófano, mientras que las células de cáncer de ovario humano analizadas produjeron niveles significativamente más altos de quinurenina.

El uso de un estándar interno durante la preparación de la muestra ayuda a la adquisición de datos fiable. La normalización de los datos al contenido de proteínas corrige las variabilidades del número de células dentro de los pocillos individuales. Nuestro protocolo puede ampliarse aún más para determinar analitos adicionales, pero pueden acumularse en el medio de cultivo en diferentes condiciones experimentales.