Name: Desarrollo de una polimerasa de amplificación ensayo cuantitativo recombinasa con un control positivo interno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprende a cuantificar concentraciones de ADN mediante amplificación con polimerasa recombinasa en tiempo real con control positivo interno. Este protocolo isotérmico ofrece una alternativa económica al PCR cuantitativo tradicional.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta investigación fue financiada por una subvención de la Fundación Bill y Melinda Gates a través de los Grandes Desafíos de la Iniciativa de Salud Mundial.

<ol><li>Yoon, J. -Y., Kim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-a-Chip+Pathogen+Sensors+for+Food+Safety%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Lab-on-a-Chip Pathogen Sensors for Food Safety.</a> Sensors. 12 (8), 10713-10741 (2012).</li>
<li>Quintero-Betancourt, W., Peele, E. R., Rose, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptosporidium+parvum+and+Cyclospora+cayetanensis%3A+A+review+of+laboratory+methods+for+detection+of+these+waterborne+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Cryptosporidium parvum and Cyclospora cayetanensis: A review of laboratory methods for detection of these waterborne parasites.</a> Journal of Microbiological Methods. 49 (3), 209-224 (2002).</li>
<li>Sedlak, R. H., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+diagnostics+in+the+era+of+digital+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Microbiology+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).</li>
<li>Asiello, P. J., Baeumner, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+isothermal+nucleic+acid+amplification%2C+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Miniaturized isothermal nucleic acid amplification, a review.</a> Lab on a Chip. 11 (8), 1420-1430 (2011).</li>
<li>Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+detection+using+recombination+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA detection using recombination proteins.</a> PLoS Biology. 4 (7), 1115-1121 (2006).</li>
<li>Krõlov, K., Frolova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+Rapid+Detection+of+Chlamydia+trachomatis+by+Recombinase+Polymerase+Amplification+Directly+from+Urine+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics+JMD%22%5BJournal%5D)">Sensitive and Rapid Detection of Chlamydia trachomatis by Recombinase Polymerase Amplification Directly from Urine Samples.</a> The Journal of Molecular Diagnostics JMD. 16 (1), 127-135 (2014).</li>
<li>Santiago-Felipe, S., Tortajada-Genaro, L. a, Puchades, R., Maquieira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinase+polymerase+and+enzyme-linked+immunosorbent+assay+as+a+DNA+amplification-detection+strategy+for+food+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Recombinase polymerase and enzyme-linked immunosorbent assay as a DNA amplification-detection strategy for food analysis.</a> Analytica Chimica Acta. 811 (1), 81-87 (2014).</li>
<li>Kersting, S., Rausch, V., Bier, F. F., von Nickisch-Rosenegk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+Plasmodium+falciparum+with+isothermal+recombinase+polymerase+amplification+and+lateral+flow+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of Plasmodium falciparum with isothermal recombinase polymerase amplification and lateral flow analysis.</a> Malaria Journal. 13 (1), 99(2014).</li>
<li>Crannell, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+Acid+test+to+diagnose+cryptosporidiosis%3A+lab+assessment+in+animal+and+patient+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nucleic Acid test to diagnose cryptosporidiosis: lab assessment in animal and patient specimens.</a> Analytical Chemistry. 86 (5), 2565-2571 (2014).</li>
<li>Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paper+and+plastic+device+for+performing+recombinase+polymerase+amplification+of+HIV+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A paper and plastic device for performing recombinase polymerase amplification of HIV DNA.</a> Lab on a Chip. 12 (17), 3082(2012).</li>
<li>Loo, J. F. C., Lau, P. M., Ho, H. P., Kong, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+aptamer-based+bio-barcode+assay+with+isothermal+recombinase+polymerase+amplification+for+cytochrome-c+detection+and+anti-cancer+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">An aptamer-based bio-barcode assay with isothermal recombinase polymerase amplification for cytochrome-c detection and anti-cancer drug screening.</a> Talanta. 115 (1), 159-165 (2013).</li>
<li>Euler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+panel+of+recombinase+polymerase+amplification+assays+for+detection+of+biothreat+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of a panel of recombinase polymerase amplification assays for detection of biothreat agents.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1110-1117 (2013).</li>
<li>Abd El Wahed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+portable+reverse+transcription+recombinase+polymerase+amplification+assay+for+rapid+detection+of+foot-and-mouth+disease+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A portable reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus.</a> PloS One. 8 (8), e71642(2013).</li>
<li>Escadafal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Molecular+Assays+for+the+Detection+of+Yellow+Fever+Virus+in+Low-Resource+Settings%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Rapid Molecular Assays for the Detection of Yellow Fever Virus in Low-Resource Settings.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (3), e2730(2014).</li>
<li>Hutson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T.+gondii+RP+Promoters+%26+Knockdown+Reveal+Molecular+Pathways+Associated+with+Proliferation+and+Cell-Cycle+Arrest%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">T. gondii RP Promoters & Knockdown Reveal Molecular Pathways Associated with Proliferation and Cell-Cycle Arrest.</a> PLoS ONE. 5 (11), 15(2010).</li>
<li>Segall, H. I., Yoo, E., Sutton, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+detection+of+artificial+replication-competent+lentivirus+of+altered+host+range%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range.</a> Molecular Therapy. 8 (1), 118-129 (2003).</li>
<li>DNA Extraction from Serum. Life Technologies. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/dna-extraction-protocols/dna-extraction-from-serum.html">http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/dna-extraction-protocols/dna-extraction-from-serum.html</a> (2014).</li>
<li>Crannell, Z. A., Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+HIV-1+DNA+using+Real-Time+Recombinase+Polymerase+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification of HIV-1 DNA using Real-Time Recombinase Polymerase Amplification.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), (2014).</li>
<li>Sollis, K. a, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+review+of+the+performance+of+HIV+viral+load+technologies+on+plasma+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Systematic review of the performance of HIV viral load technologies on plasma samples.</a> PloS one. 9 (2), e85869(2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+for+the+use+of+antiretroviral+agents+in+HIV-1-infected+adults+and+adolescents%22">Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents</a>. , Department of Health and Human Services. Washington D.C. 1-166 (2011).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Con el fin de obtener datos significativos de cuantificación utilizando el algoritmo de MATLAB, el usuario debe seleccionar valores de entrada apropiados cuando se le solicite. Después de iniciar cada secuencia de comandos en las secciones 5 y 6, todas las variables de entrada se solicitan automáticamente en la ventana de comandos y salidas se generan automáticamente. En la sección 5.7 se pide al usuario que seleccione un umbral de pendiente. El valor del umbral de pendiente afecta al cuadrado del coeficiente de correla...

Amplificación de ácidos nucleicos cuantitativa es una técnica importante para la detección del medio ambiente, transmitidas por los alimentos, y los patógenos transmitidos por el agua, así como para el diagnóstico clínico. Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR) es el método estándar de oro para la detección sensible, específica y cuantitativa de ácidos nucleicos, por ejemplo, para el VIH-1 pruebas de carga viral, la detección de patógenos bacterianos, y la detección de muchos otros organismos 1 - 3. Durante tiempo real qPCR, cebadores amplifican ADN del patógeno en ciclos, y una señal fluorescente que se genera es proporcional a la cantidad de ADN amplificado en la muestra en cada ciclo. Una muestra que contiene una concentración desconocida de ADN del patógeno puede ser cuantificada usando una curva patrón que relaciona la concentración de ADN inicial de muestras estándar y el tiempo en que la señal fluorescente alcanza un cierto umbral (es decir, el umbral de ciclo, o C T). <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Debido a tiempo real qPCR requiere costosos equipos de ciclo térmico y varias horas para recibir los resultados, las técnicas de amplificación isotérmica alternativos, tales como la amplificación recombinasa polimerasa (RPA), se han desarrollado 4. Estas plataformas generalmente proporcionan resultados más rápidos y amplifican los ácidos nucleicos en una, solo temperatura más baja, que se puede lograr con un equipo menos caro, más simple. RPA, que es particularmente atractivo para aplicaciones de punto de cuidado, amplifica ADN en minutos, requiere una temperatura de amplificación baja (37 ° C), y permanece activo en la presencia de impurezas 5,6. Ensayos de RPA se han desarrollado para una amplia gama de aplicaciones, incluyendo el análisis de alimentos, la detección de patógenos, detección de drogas cáncer, y la detección de agentes biothreat 7-12. Sin embargo, el uso de RPA para la cuantificación de ácidos nucleicos se ha limitado 13,14. En trabajos anteriores, que era shown que en tiempo real RPA cuantitativa (qRPA) es factible 15. Aquí, se proporciona un protocolo más detallado para el uso en tiempo real RPA cuantitativa para cuantificar muestras desconocidas utilizando una curva estándar, un método que es análogo a la cuantificación mediante qPCR. Este protocolo se describe cómo realizar una reacción RPA en un termociclador para detectar el VIH-1 de ADN como prueba de concepto, así como la forma de desarrollar un control positivo interno (IPC) para asegurar que el sistema está funcionando correctamente. La recolección de datos utilizando un termociclador o microscopio y análisis de datos para la construcción de una curva estándar utilizando datos de entrenamiento también se detalla. Por último, el método para cuantificar muestras desconocidas usando la curva estándar con un script personalizado se demuestra. Esta técnica qRPA permite la cuantificación de las muestras con concentraciones desconocidas y tiene muchas ventajas sobre en tiempo real tradicional qPCR.

<table><tbody><tr>Ensayo <td></td><td></td><td></td><td>qRPA</td></tr><tr><td>VIH-1 cebador directo</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td>oligos de ADN personalizados</td><td>5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3' &nbsp;</td></tr><tr><td>Imprimación inversa para el VIH-1</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>oligos de ADN personalizados</td><td>5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3' &nbsp;</td></tr><tr><td>Sonda de VIH-1</td><td>BioSearch Technologies&nbsp;</td><td>oligonucleótidos de ADN personalizado</td><td>5'- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3' &nbsp;</td></tr><tr><td>Sonda IPC</td><td>BioSearch Technologies&nbsp;</td><td>oligos de ADN personalizado</td><td>5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3'</td></tr><tr><td>Reactivos RPA exo (pellets, tampón de rehidratación, acetato de magnesio</td><td>TwistDx</td><td>TwistAmp exo</td><td></td></tr><tr><td>Tiras de tubo de PCR</td><td>BioRad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td>PCR tiras de tubo de tapa plana</td><td>BioRad</td><td>TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>Adhesivo Micro-seal</td><td>BioRad</td><td>558/MJ&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Diana del VIH-1 (pHIV-IRES- eYFP&Delta; Env y Delta; Vif&Delta; Vpr)</td><td></td><td></td><td>plásmido personalizado, véase: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Caracterización y detección de lentivirus competentes para la replicación artificial de un rango de huéspedes alterado. Terapia Molecular 8, 118&ndash; 129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).</td></tr><tr><td>ADN genómico masculino humano Applied</td><td>Biosystems</td><td>360486</td><td></td></tr><tr><td>bloque frío de 96 pozos</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-36700-48</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>BioRad</td><td>CFX96</td><td></td></tr><tr><td>MiniFuge</td><td>VWR</td><td>93000-196</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Tampón Tris 1,0 M, pH 8,0</td><td>EMD Millipore</td><td>648314</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M, pH 8,0</td><td>Promega</td><td>V4321</td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasas</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>IPC Development</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryptosporidium parvum IPC template</td><td>Waterborne Inc</td><td>P102C</td><td>También es posible pedir un objetivo sintético de doble cadena de IDT si el usuario no está equipado para trabajar con C. parvum (un agente infeccioso BSL-2). Los cebadores de PCR y RPA para C. parvum se diseñaron utilizando el número de acceso AF115377.1</td></tr><tr><td>de GenBank cebador de largo avance</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td>Oligos de ADN personalizados</td><td>5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3'</td></tr><tr><td>Imprimación inversa larga PCR</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>oligos de ADN personalizados</td><td>5'- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3'</td></tr><tr><td>Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Gel Kit de extracción</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>TAE 10X tampón</td><td>EMD Millipore</td><td>574797</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Experimentos de</td><td></td><td></td><td></td>microscopio</tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia vertical</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Imager.J1</td><td></td></tr><tr><td>Calentador de etapa</td><td>Bioscience Tools</td><td>TC-GSH</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura de alta estabilidad de precisión de 1 canal</td><td>Bioscience Tools</td><td>TC-1100S</td><td></td></tr><tr><td>CUBO DE FILTRO FAM/GFP Juego</td> de filtros <td>Zeiss</td><td>38 (000000-1031-346)</td><td>excitación BP 470/40 nm, emisión BP 520/50 nm</td></tr><tr><td>Cubo de filtro HEX</td><td>Chroma</td><td>49014</td><td>excitación BP 530/30 nm, emisión BP 575/40 nm</td></tr><tr><td>Cortadora láser</td><td>Engraver's Network</td><td>VLS3.60</td><td></td></tr><tr><td>1/8" acrílico negro</td><td>McMaster Carr</td><td>8505K113</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mm acrílico transparente</td><td>McMaster Carr</td><td>PD-72268940&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Súper pegamento</td><td>Office</td><td>Depot Duro súper pegamento &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral de grado PCR</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8662-5VL</td><td></td></tr><tr><td>Análisis de datos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MATLAB MATLAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m"</td><td>Incluido en el</td> script de SI <td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m"</td><td>Incluido en el</td> script de SI <td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m"</td><td>Incluido en SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_qRPA_well.ai</td><td>Incluido en SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_qRPA_base.ai</td><td>Incluido en SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software AxioVision</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_AxioVision_Script.ziscript</td><td>Incluido en SI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

desarrollo de una polimerasa de amplificación ensayo cuantitativo recombinasa con un control positivo interno

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Recientemente se demostró que la amplificación de la polimerasa recombinasa (RPA), una plataforma de amplificación isotérmica para la detección de patógenos, puede utilizarse para cuantificar la concentración de muestras de ADN utilizando una curva estándar. En este manuscrito, se proporciona un protocolo detallado para desarrollar e implementar un ensayo cuantitativo de amplificación de polimerasa recombinasa en tiempo real (ensayo qRPA). Utilizando la cuantificación del ADN del VIH-1 como ejemplo, se describe el ensamblaje de reacciones de RPA en tiempo real, el diseño de una secuencia de control positivo interno (IPC) y la coamplificación del IPC y el objetivo de interés. Se proporcionan instrucciones y scripts de procesamiento de datos para la construcción de una curva estándar utilizando datos de múltiples experimentos, que se pueden utilizar para predecir la concentración de muestras desconocidas o evaluar el rendimiento del ensayo. Por último, se describe un método alternativo para recopilar datos de fluorescencia en tiempo real con un microscopio y un calentador de etapa como paso hacia el desarrollo de un ensayo qRPA en el punto de atención. El protocolo y los scripts proporcionados se pueden utilizar para el desarrollo de un ensayo qRPA para cualquier objetivo de ADN de interés.

Antes de seleccionar una secuencia para servir como el IPC en experimentos con qRPA objetivo (VIH-1) ADN, control positivo interno (IPC) candidatos se generan y se seleccionaron por su capacidad para amplificar en las reacciones qRPA sin el VIH-1 ADN presente. Candidatos IPC son más largos que el objetivo (VIH-1) DNA para prevenir la formación IPC desde fuera de la competencia del VIH-1 la formación de amplicón. Como se muestra en la Figura 2A, la generación de dos C. candidatos parvum...

Provided es un protocolo para desarrollar un ensayo de amplificación de polimerasa recombinasa en tiempo real para cuantificar la concentración inicial de muestras de ADN utilizando un termociclador o un microscopio y calentador de etapa. También se describe el desarrollo de un control positivo interno. Se proporcionan scripts para procesar datos de fluorescencia sin procesar en tiempo real.

Desarrollo de una polimerasa de amplificación ensayo cuantitativo recombinasa con un control positivo interno

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en utilizar la amplificación isotérmica mediada por recombinasa para cuantificar la concentración de ADN en muestras desconocidas. Esto se logra primero añadiendo al control interno positivo de ADN diana, cebadores de ADN y sondas marcadas con fluoróforo a la reacción. Como segundo paso, las reacciones se colocan en la máquina de PCR en tiempo real, que calienta las reacciones para activar las enzimas y monitorea la fluorescencia de las sondas para detectar la generación de amplicones diana y de control.A continuación, los datos fluorescentes se analizan mediante un script para generar la curva patrón y validar el ensayo. Los resultados muestran que las muestras de ADN pueden cuantificarse con precisión dentro de un orden de magnitud de la concentración correcta, según los experimentos de validación utilizados para cuantificar el ADN diana del VIH-1. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la PCR cuantitativa en tiempo real es que la RPA es isotérmica, por lo que no se requiere un termociclador costoso.La RPA también requiere una temperatura de amplificación más baja, es tolerante a muestras impuras, amplifica el objetivo hasta niveles detectables en minutos y utiliza enzimas liofilizadas que permiten un fácil transporte y almacenamiento a temperatura ambiente. Para comenzar, limpie todas las superficies del banco de trabajo y del equipo con una solución de lejía al 50% para crear un espacio de trabajo limpio antes de la amplificación, retire la solución de acetato de magnesio 280 milimolar, el tampón de rehidratación y los gránulos de reacción del congelador a menos 20 grados Celsius y deje que las soluciones se descongelen a temperatura ambiente. Luego, prepare una mezcla maestra transfiriendo 383,5 microlitros del tampón de rehidratación a un nuevo tubo microcentrífugo, agregue 41,6 microlitros de agua libre de nucleasas al tampón y vortexee para mezclar; coloque 35 microlitros de acetato de magnesio en un tubo separado.Devuelva el acetato de magnesio en las soluciones stock de tampón de rehidratación al congelador. Luego obtenga los cebadores y las sondas del refrigerador a cuatro grados Celsius. Colóquelos en el área de trabajo de preamplificación y apague las luces para minimizar la exposición a la luz; añada 27,3 microlitros de cada uno de los cebadores directo e inverso a 10 micromolares a la mezcla maestra.A continuación, agregue 7,8 microlitros de la sonda de ADN del VIH-1 marcada con hex, a una concentración de 10 micromolar, a la mezcla maestra y vortexee el tubo. Luego, devuelva los alícuotas del cebador y de la sonda a su almacenamiento. Los reactivos para el control interno positivo pueden añadirse aquí según se indica en el protocolo escrito para ensamblar las reacciones de ARNpc. Primero, coloque las pastillas enzimáticas liofilizadas en tubos individuales de tiras de ocho pocillos de paredes bajas, y agregue por pipeta 37,5 microlitros de la mezcla maestra a un tubo que contenga una pastilla.Agite suavemente el contenido del tubo con la punta de la pipeta para disolver el precipitado sin crear burbujas. Retire la punta de la reacción con cuidado para evitar una pérdida de volumen y asegúrese de cambiar las puntas de pipeta entre cada tubo. Transfiera los tubos a un bloque frío de 96 pocillos refrigerado durante al menos cinco minutos para enfriar la mezcla maestra.Mientras tanto, cargue el software del termociclador con el protocolo y la distribución de la placa indicada en el protocolo escrito. A continuación, corte dos tiras de adhesivos de sellado microscópico de plástico transparente de modo que sean ligeramente más anchas que los tubos de PCR. También obtenga dos tapas planas para tiras de tubos de PCR y alícuota la plantilla del plásmido VIH uno según se indica en el protocolo escrito.A continuación, agregue 10 microlitros de la plantilla al tubo de PCR correspondiente. Nuevamente, mezcle suavemente con la punta de la pipeta. Luego, añada 2,5 microlitros de acetato de magnesio a cada tapa de tubo y coloque suavemente las tapas encima de los tubos de reacción de modo que no queden completamente selladas.El acetato de magnesio debe ser claramente visible a través de la tapa. Coloque las tiras de tubos PCR en una microcentrífuga y centrifugue los tubos durante 10 segundos para reunir todo el líquido en el fondo del tubo y eliminar cualquier burbuja. La combinación de la solución de acetato de magnesio con la mezcla maestra inicia la reacción de QRPA.Retire rápidamente los tubos de PCR al bloque frío para detener la reacción. A continuación, retire lentamente las tapas para evitar contaminar las reacciones y selle los tubos con una película adhesiva transparente para microplacas. Transfiera los tubos al termociclador según las ubicaciones indicadas en el diseño de la placa.Cierre la tapa del termociclador y haga clic en iniciar corrida. Asegúrese de designar un nombre de archivo para el experimento cuando finalice la corrida. Visualice los datos brutos de fluorescencia y expórtelos a una hoja de cálculo, lo que creará un archivo llamado resultados de amplificación de cuantificación.Para construir la curva estándar. Primero, descargue el script de la curva estándar, luego abra MATLAB o un programa similar de análisis de datos. Abra el script y presione ejecutar para correr el script.Escriba el número de archivos de datos que se analizarán cuando se le solicite. A continuación, escriba el número de muestras y el número de réplicas en cada archivo de entrenamiento en la ventana de comandos.Escriba la concentración más baja de ADN en copias basadas en logaritmo de 10 que se utilizó para construir la curva estándar y presione enter. En el ejemplo mostrado aquí, la concentración más baja es una copia basada en logaritmo de 10.Luego, escriba la diferencia en concentración entre cada estándar de ADN en el símbolo del sistema y presione enter aquí. El intervalo de concentración es de un logaritmo basado en 10 copias. A continuación, introduzca el valor del umbral de pendiente en la ventana de comandos y presione enter.Este valor suele estar entre tres y cinco. Escriba el número de desviaciones estándar por encima del fondo para el umbral positivo, también conocido como Z, y luego presione enter; los valores típicos de Z oscilan entre uno y cinco. A continuación, especifique el equipo que se utilizó para recopilar los datos en este caso.Escriba uno para el termociclador y luego presione enter. Si hay un control interno positivo, seleccione el valor predeterminado o un valor nuevo para el umbral escribiendo S o N según sea necesario un umbral nuevo. Finalmente, seleccione todos los archivos de hoja de cálculo que se utilizarán para construir la curva estándar.El script importará y analizará automáticamente todos los datos. Se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real (QRPA) en muestras duplicadas que contenían diferentes números de copias de ADN de VIH 1D. El inicio de la amplificación detectable, indicado por un aumento en la fluorescencia, ocurre antes en muestras con mayores números de copias de ADN que en muestras con menores números de copias. Los datos brutos de fluorescencia se utilizaron para generar una curva estándar a partir de la amplificación de concentraciones conocidas de ADN de VIH 1D. Estos datos se ajustaron a una curva exponencial, y el valor de R cuadrado indica un alto grado de ajuste.La curva estándar se utilizó para predecir las concentraciones de muestras adicionales de ADN de concentración conocida. Ajustar el valor de Z a uno permite una predicción precisa de concentraciones bajas de ADN. En contraste, las concentraciones altas de ADN se predicen mejor con un valor de Z de cinco.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la RPA carece de ciclos verdaderos para limitar la tasa de amplificación del ADN. Por lo tanto, la tasa de amplificación debe controlarse con precisión. La consistencia entre experimentos es crucial, así que asegúrese de utilizar los mismos alícuotas de cebadores para todos los experimentos.Proteja los componentes de la reacción del calor y la luz. Añada acetato de magnesio inmediatamente antes de comenzar la recopilación de datos y mantenga las reacciones en el bloque frío hasta el inicio. El experimento.

development-quantitative-recombinase-polymerase-amplification-assay

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un método de bajo costo, de alto rendimiento para la detección simultánea de hasta 43 blancos moleculares se describe. Las solicitudes de MPCR / RLB son la tipificación de microorganismos y la detección de múltiples patógenos de muestras clínicas.

Multiplex PCR y Blot Línea ensayo de hibridación reversa (MPCR / RLB)

El estudio describe un método costo-efectivo para la identificación de la fuente de contaminación fecal / orina o la contaminación por nitratos en el agua utilizando qPCR para la cuantificación específica de los virus de ADN humano / porcino / bovino, adenovirus y poliomavirus, propuesto como herramientas de MST.

Método rentable para el Rastreo de uso microbiana específica virus humanos y animales

En este video, demostramos la técnica de PCR digital dúplex (ddPCR), una modificación de la técnica de PCR tradicional que es útil para detectar dos marcadores genéticos diferentes simultáneamente. Una sola reacción de PCR se divide en gotas emulsionadas del tamaño de un nanolitro que se amplifican de forma independiente, y la detección de señales de amplificación de fluorescencia de diferentes colores a partir de la fracción de gotas se utiliza para calcular la concentración inicial de las...

PCR digital dúplex para la cuantificación simultánea de marcadores genéticos duales

Aquí, describimos un método para la cuantificación simultánea de círculos de escisión del receptor de células T (TRECs) y círculos de escisión de recombinación de eliminación de K (KRECs). El ensayo TREC/KREC se puede utilizar como marcador de la diuresis tímica y de la médula ósea.

La cuantificación simultánea de T-Cell Círculos Receptor Excision (TRECs) y Círculos K-Eliminación recombinación Excision (KRECs) por PCR en tiempo real

Aquí, presentamos un protocolo para el desarrollo y validación de un método de PCR cuantitativo utilizado para la detección y cuantificación de ADN EHV-2 en fluidos respiratorios equinos. El protocolo de validación de qRT-PCR EHV-2 implica un procedimiento de tres partes: desarrollo, caracterización del ensayo qRT-PCR solo y caracterización de todo el método analítico.

Desarrollo y validación de un método de PCR cuantitativa para Equid herpesvirus-2 Diagnóstico en los flujos respiratorios

Se describe un sistema integrado para la secuenciación dirigida de próxima generación de muestras oncológicas. Este sistema multiplataforma está optimizado para biopsias tumorales de baja calidad y baja cantidad, se adapta a entradas de ADN bajas, incluye controles multivariantes bien caracterizados y cuenta con un nuevo llamador de variantes que se basa en medidas cuantitativas de control de calidad preanalítico.

Integración de Procesos húmedo y en seco de banco Optimiza Targeted secuenciación de próxima generación de baja calidad y biopsias de tumores de baja cantidad

Este manuscrito describe el procedimiento experimental y el análisis de software para un ensayo de sitio de integración bidireccional que puede analizar simultáneamente el ADN de unión vector-huésped aguas arriba y aguas abajo. Los productos de PCR bidireccionales pueden utilizarse para cualquier plataforma de secuenciación aguas abajo. Los datos resultantes son útiles para una comparación cuantitativa de alto rendimiento de dianas de ADN integradas.

Sitio de Integración Retroviral Bidireccional Metodología de PCR y Flujo de Trabajo de Análisis de Datos Cuantitativos

Los ensayos de ADN ambiental requieren un diseño riguroso, pruebas, optimización y validación antes de que pueda comenzar la recopilación de datos de campo. Aquí, presentamos un protocolo para llevar a los usuarios a través de cada paso del diseño de un ensayo qPCR específico de la especie, basado en sondas para la detección y cuantificación de un ADN de especies objetivo a partir de muestras ambientales.

Desarrollo y pruebas de ensayos cuantitativos de PCR específicos de especies para aplicaciones de ADN ambiental

Se proporcionan instrucciones detalladas para construir un fluorímetro modular de código abierto que sea compatible con muchos calentadores de bajo costo para realizar la amplificación cuantitativa de ácidos nucleicos cuantitativos en tiempo real.

Fluorímetro miniatura de código abierto para monitorear las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos isotérmicos en tiempo real en entornos de recursos limitados

Los ensayos de captura de bucle D (DLC) y extensión de bucle D (DLE) utilizan el principio de ligadura de proximidad junto con PCR cuantitativa para cuantificar la formación de bucle D, la extensión del bucle D y la formación de productos en el sitio de una ruptura ducible de doble cadena en Saccharomyces cerevisiae.

Detección de intermediarios de recombinación homóloga mediante ligadura de proximidad y PCR cuantitativa en Saccharomyces cerevisiae

Para facilitar la detección rápida y precisa de Acinetobacter baumannii, presentamos un protocolo que emplea la amplificación de la polimerasa recombinasa (RPA) junto con la endonucleasa LbaCas12a para identificar infecciones por A. baumannii .

Detección rápida y específica de infecciones por Acinetobacter baumannii mediante un sistema de amplificación de polimerasa recombinasa/Cas12A

Aprende a cuantificar concentraciones de ADN mediante amplificación con polimerasa recombinasa en tiempo real con control positivo interno. Este protocolo isotérmico ofrece una alternativa económica al PCR cuantitativo tradicional.

Desarrollo de una polimerasa de amplificación ensayo cuantitativo recombinasa con un control positivo interno

Explorar más videos