Desarrollo de una polimerasa de amplificación ensayo cuantitativo recombinasa con un control positivo interno

El objetivo general del siguiente experimento es utilizar la simplificación cuantitativa de la polimerasa recombinasa para cuantificar la concentración de ADN de muestras desconocidas. Esto se logra agregando primero el control positivo interno del ADN objetivo, cebadores de ADN y sondas marcadas con fluorescencia a la reacción. Como segundo paso, las reacciones se colocan en la máquina de PCR en tiempo real, que calienta las reacciones para activar las enzimas y monitorea la fluorescencia de las sondas para detectar la generación de dianas y controlar los amplicones.

A continuación, los datos fluorescentes se analizan mediante un script para generar la curva estándar y validar el ensayo. Los resultados muestran que las muestras de ADN se pueden cuantificar con precisión dentro de un orden de magnitud de la concentración correcta sobre la base de los experimentos de validación utilizados para cuantificar un ADN objetivo del VIH. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la PCR cuantitativa en tiempo real, es que el RPA es isotérmico, por lo que no se necesita un costoso termociclador.

La RPA también requiere una amplificación a temperatura más baja, es tolerante a muestras sucias, amplifica el objetivo a niveles detectables en cuestión de minutos y utiliza enzimas lly para permitir un fácil transporte y almacenamiento a temperatura ambiente. Para comenzar, limpie todas las superficies de la mesa de trabajo y del equipo con una solución de lejía al 50% para crear un espacio de trabajo limpio de preamplificación, retire la solución de acetato de magnesio de 280 milimolares, el tampón de rehidratación y los gránulos de reacción del congelador a menos 20 grados centígrados y descongele las soluciones a temperatura ambiente. A continuación, ensamble una mezcla maestra transfiriendo 383,5 microlitros del tampón de rehidratación a un nuevo tubo de microfuga a 41,6 microlitros de agua libre de nucleasa al tampón y al vórtice para mezclar 35 microlitros de acetato de magnesio a un tubo separado.

Regrese el acetato de magnesio en las soluciones de reserva de rehidratación al congelador. A continuación, obtenga la imprimación y el prob quas del refrigerador a cuatro grados centígrados. Colóquelos en el espacio de trabajo de preamplificación y apague las luces para minimizar la exposición a la luz a 27,3 microlitros de cada uno de los 10 cebadores micromolares hacia adelante y hacia atrás a la mezcla maestra.

A continuación, a 7,8 microlitros del hexágono de 10 micromolares etiquetado con VIH 1D NA. Sonda a la mezcla maestra y vórtice el tubo. A continuación, devuelva el cebador y las soluciones madre de la sonda al almacenamiento, se pueden añadir aquí los reactivos para el control positivo interno como se indica en el protocolo de texto para ensamblar las reacciones QRPA. Primero coloque los gránulos de enzimas liofilizados en tubos individuales de dos tiras de tubos de PCR de ocho pocillos de baja altura pipetean 37,5 microlitros de la mezcla maestra en un tubo que contiene un gránulo.

Agite suavemente el contenido del tubo con la punta de la pipeta para disolver el pellet sin crear burbujas. Retire la punta de la reacción con cuidado para evitar una pérdida de volumen y asegurarse de cambiar las puntas de pipeta entre cada tubo. Transfiera los tubos a un bloque frío de 96 pozos refrigerados durante al menos cinco minutos para enfriar la mezcla maestra.

Mientras tanto, cargue el software del termociclador con el protocolo y el diseño de la placa se indica en el protocolo de texto. A continuación, corte dos tiras de adhesivos de microsellado de plástico transparente para que sean ligeramente más anchas que los tubos de PCR. Y también obtenga dos tapas planas de tiras de tubo de PCR, alícuota de la plantilla de plásmido VIH uno como se indica en el protocolo de texto.

Y luego agregue 10 microlitros de la plantilla al tubo de PCR apropiado. De nuevo, remueva suavemente la mezcla con la punta de la pipeta. A continuación, agregue 2,5 microlitros de acetato de magnesio a cada tapa de tubo y luego coloque suavemente las tapas encima de los tubos de reacción para que no queden completamente sellados.

El acetato de magnesio debe ser claramente visible a través de la tapa. Coloque las tiras de tubos de PCR en una microcentrífuga y centrifuga los tubos durante 10 segundos para recoger todo el líquido en el fondo del tubo y eliminar las burbujas. La combinación de la solución de acetato de magnesio con la mezcla maestra inicia la reacción QRPA.

Retire rápidamente los tubos de PCR del bloque frío para detener la reacción. A continuación, retire lentamente las tapas para evitar contaminar las reacciones y selle los tubos con una película de sellado micros transparente. Transfiera los tubos al termociclador de acuerdo con las ubicaciones en el diseño de la placa.

Cierre la tapa del termociclador y haga clic en iniciar ejecución. Asegúrese de designar un nombre de archivo para el experimento una vez finalizada la ejecución. Vea los datos de fluorescencia sin procesar y expórtelos a una hoja de cálculo que creará un archivo llamado resultados de amplificación de cuantificación.

Para construir la curva estándar. En primer lugar, descargue el script de curva estándar y, a continuación, abra MATLAB o un programa de análisis de datos similar. Abra el script y presione ejecutar para ejecutar el script.

Escriba el número de archivos de datos que se analizarán cuando se le solicite. A continuación, escriba el número de muestras y el número de réplicas en cada archivo de entrenamiento. En la ventana de comandos.

Escriba la concentración de ADN más baja en 10 copias basadas en logaritmos que se usaron para construir la curva estándar y presione enter. En el ejemplo de aquí. La concentración más baja es de un logaritmo basado en 10 copias.

A continuación, escriba la diferencia de concentración entre cada estándar de ADN en el símbolo del sistema y pulse Intro aquí. El intervalo de concentración es de un registro basado en 10 copias. A continuación, introduzca el valor del umbral de pendiente en la ventana de comandos y pulse Intro.

Este valor suele estar entre tres y cinco. Escriba el número de desviaciones estándar sobre el fondo para el umbral positivo, también conocido como Z, y, a continuación, presione Entrar, los valores Z típicos oscilan entre uno y cinco. A continuación, especifique el equipo que se utilizó para recopilar los datos en este caso.

Escriba uno para el termociclador y, a continuación, presione Entrar. Si hay un control positivo interno, seleccione el valor predeterminado o un nuevo valor para el umbral escribiendo Y o N en función de si es necesario un nuevo umbral. Por último, seleccione todos los archivos de hoja de cálculo que se utilizarán para construir la curva estándar.

A continuación, el script importará y analizará automáticamente todos los datos. Se realizó QRPA en tiempo real en muestras duplicadas que contenían diferentes números de copias de HIV 1D NA. El inicio de la amplificación detectable indicada por un aumento de la fluorescencia se produce antes para las muestras con un número de copias de ADN más alto que para las muestras con un número de copias más bajo. Los datos brutos de fluorescencia se utilizaron para generar una curva estándar a partir de la amplificación de concentraciones conocidas de NA 1D del VIH. Estos datos se ajustaron a una curva exponencial, y el valor de R cuadrado indica una alta bondad de ajuste.

Se utilizó la curva estándar para predecir las concentraciones de muestras de ADN adicionales de concentración conocida. Ajustar el valor de Z a uno permite una predicción precisa de bajas concentraciones de ADN. Por el contrario, las altas concentraciones de ADN se predicen mejor con un valor Z de cinco.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que RPA carece de ciclos verdaderos para limitar la tasa de amplificación del ADN. Por lo tanto, la tasa de amplificación debe controlarse con precisión. La coherencia entre los experimentos es crucial, así que asegúrese de utilizar las mismas alícuotas de cebador para todos los experimentos.

Proteja los componentes de reacción del calor y la luz. Agregue acetato de magnesio inmediatamente antes de que comience la recopilación de datos y mantenga las reacciones en el bloque frío hasta que comience. El experimento.