Procedimiento y estrategias clave de la optimización para un método de inmunoensayo de basadas en electroforesis capilar automatizado

Se demuestra un inmunoensayo de capilar usando una plataforma comercial para medir las proteínas blanco de preparaciones de proteínas totales. Además, parámetros de ensayo del tiempo de exposición, concentración y dilución de anticuerpo están optimizados para un sistema de modelo de cultivo celular.

El objetivo general de este procedimiento es demostrar un inmunoensayo de electroforesis capilar utilizando una plataforma comercial. Esta plataforma distinguirá y cuantificará las dianas proteicas a partir de una muestra biológica que puede obtenerse de tejidos de cultivo celular y biofluidos. El proceso examina las proteínas en función de su tamaño, que oscila entre dos y 440 kilodaltons.

La ventaja de este procedimiento automatizado sobre los procedimientos tradicionales, como un Western blot, es que los inmunoensayos electroforéticos capilares eliminan la necesidad de geles, dispositivos de transferencia y lavados manuales. Además, la cantidad absoluta de proteína requerida es aproximadamente 10 veces menor, lo que hace que el procedimiento sea ideal para tipos de células raras o muestras limitadas. Además, los resultados se obtienen en tan solo tres horas utilizando sistemas automatizados y se ha demostrado que son más cuantitativos y reproducibles que los procedimientos convencionales de Western blot.

Prepare las muestras y los reactivos del kit, incluido el tampón de muestra, el ditiotreitol, la mezcla maestra fluorescente y la escalera biotinilada de acuerdo con el prospecto del producto del fabricante. Prepara las muestras de proteínas con tu método favorito. Aquí aislamos extracto de células enteras de cultivos celulares BEAS-2B.

Diluir las muestras de proteínas con tampón de muestra. Mezcle una parte de mezcla maestra fluorescente de cinco veces con cuatro partes de muestra diluida para lograr la concentración final de proteína deseada. Se muestra un ejemplo de cálculo para hacer 70 microlitros de 0,2 microgramos por microlitro de concentración final de proteína, comenzando con una concentración de stock de proteína de 1,2 microgramos por microlitro.

La mezcla maestra es 1/5 del volumen total, en este caso, 14 microlitros. Para calcular el volumen de reserva de proteína necesario, multiplique la concentración final deseada por el volumen total y divida por la concentración de reserva de proteína. Reste la mezcla maestra y los volúmenes de existencias del volumen total para calcular el volumen de tampón de muestra.

Desnaturalice las muestras preparadas y la escalera calentándolas a 95 grados centígrados durante cinco minutos. Tenga en cuenta que algunas proteínas pueden requerir condiciones de desnaturalización más suaves. Por ejemplo, 70 grados durante 10 minutos para evitar la agregación de proteínas y mejorar la migración.

Considere esta opción si hay manchas fuertes en los pesos moleculares más altos. Prepare las diluciones de anticuerpos deseadas en el diluyente proporcionado. Tenga en cuenta que los anticuerpos generalmente se usan en concentraciones más altas para el inmunoensayo basado en capilares que para el Western blot tradicional.

Prepare una mezcla uno a uno de luminol y peróxido fresco con cada uso. Pipetee las muestras y los reactivos en la placa de ensayo utilizando los volúmenes que se muestran en la plantilla. El código de colores representa la carga adecuada de reactivos y muestras en la placa de ensayo.

Escalera biotinilada con pipeta hasta el pocillo A1, muestras preparadas hasta los pocillos A2 a A25. El diluyente de anticuerpos suministrado a los pocillos B1 a B25 y al pocillo C1. Anticuerpo primario contra los pocillos C2 a C25. Estreptavidina HRP al pocillo D1. Anticuerpo secundario contra los pocillos D2 a D25.

Y mezcla de luminol y peróxido a los pocillos E1 a E25. Agregue tampón de lavado a las primeras tres filas de los pocillos más grandes de la placa media. Encienda el instrumento de inmunoensayo capilar y abra el software que lo acompaña.

Cargue el cartucho capilar y la placa de ensayo en la máquina de acuerdo con las instrucciones del fabricante e inicie la ejecución. Una vez finalizada la ejecución, compruebe que los patrones fluorescentes estén correctamente identificados y corríjalos si es necesario. Además, verifique que la escalera biotinilada muestre los picos de tamaño correctos para el kit utilizado.

Consulte la guía de referencia rápida del fabricante o el manual del producto para obtener más detalles. La optimización de las condiciones del ensayo, como el tiempo de exposición, la concentración de proteínas y la dilución de anticuerpos, es importante para obtener resultados precisos y reproducibles. Estas condiciones son específicas de cada combinación de anticuerpos del sistema modelo y, por lo tanto, deben determinarse empíricamente para cada nuevo ensayo.

La capacidad de generar resultados cuantitativos depende del análisis de un tiempo de exposición en el que el sustrato de luminol no se agota rápidamente, ya que el agotamiento del sustrato provoca la pérdida de señal o el agotamiento de la señal. Esto se puede determinar examinando los datos a diferentes tiempos de exposición a la quimioluminiscencia, como se muestra en la figura dos. Las exposiciones con el instrumento utilizado oscilaron entre cinco y 480 segundos.

Las vistas de Lane mostraron concentraciones decrecientes de proteínas para los extractos de BEAS-2B sondeados con el anticuerpo p53 DO-1 en una dilución de uno a 500. Los coeficientes de la señal de quimioluminiscencia informados como alturas máximas en el software del instrumento se superponen. Las intensidades de las bandas visuales son ajustadas automáticamente por el instrumento y no son comparables de un panel a otro.

El coeficiente de la señal disminuye con exposiciones secuencialmente más largas si el luminol se agota, como se ve aquí. La señal comienza a desaparecer y el pico se divide en las dos exposiciones más largas. Debido a esto, se eligió un tiempo de exposición corto de 15 segundos para el análisis de los datos.

La entrada total de proteínas también debe optimizarse para cada ensayo y sistema modelo en particular. Para la evaluación cuantitativa, las mediciones deben realizarse dentro del rango dinámico lineal de cada ensayo. Donde los cambios en la señal, medidos por el área del pico, son proporcionales a los cambios en la cantidad de proteína en la muestra.

La titulación de lisado muestra las vistas de carril del lisado de BEAS-2B cuando se sondea con un anticuerpo de alfa-tubulina de uno a 500 p53 DO-1 o de uno a 50 alfa-tubulina. El análisis de regresión lineal confirma que los ensayos son lineales en todo el rango probado. Las concentraciones totales de proteínas en el medio del rango lineal se eligieron para acomodar la variación potencial de la proteína objetivo en cualquier dirección.

Como consideración final de optimización, se debe evaluar la dilución adecuada del anticuerpo primario. El uso de anticuerpos en concentraciones de sutura ayuda a garantizar que cualquier cambio de señal medido se deba solo a cambios en la cantidad de proteína. Dos muestras de proteína BEAS-2B, representadas por los puntos azules y naranjas, se sondearon con un anticuerpo alfa-tubulina diluido en serie.

La señal de quimioluminiscencia, medida como área de pico, se graficó frente a la dilución de anticuerpos. La saturación se observó cerca de la dilución de uno a 50, donde la curva comienza una meseta notable. Por lo tanto, se eligió de uno a 50 como la dilución óptima para este anticuerpo.

Después de ver este vídeo, debería sentirse cómodo preparando muestras, cargando muestras y ejecutando análisis en el instrumento de inmunoensayo capilar ProteinSimple Wes. Una vez que haya dominado este procedimiento, la ejecución completa se puede realizar en tres horas con 25 muestras. Al analizar una tirada, es importante realizar un control de calidad para cada capilar y muestra.

Esto incluye la verificación de los estándares fluorescentes en una escalera biotinilada. Si los picos se identifican incorrectamente, el software de análisis debe utilizarse principalmente para identificar los picos correctos y eliminar los picos identificados incorrectamente. Al igual que con todas las técnicas de biología molecular en el laboratorio, use el equipo de protección personal adecuado para protegerse a sí mismo y a sus muestras.

Esto incluye bata de laboratorio, guantes, gafas de seguridad y zapatos cerrados. Es importante tener en cuenta que la optimización debe realizarse para cada nuevo objetivo que se mida o cuando se utilicen diferentes fuentes de muestra. Los pasos de validación y seguimiento incluyen la evaluación de la especificidad y la señal del anticuerpo mediante proteína purificada o epítopo.

Probar el rango dinámico del ensayo utilizando una serie de diluciones de la muestra y optimizar la dilución de anticuerpos mediante la evaluación de la saturación de la señal en un rango de concentración de anticuerpos. Una vez optimizado, este procedimiento de inmunorología capilar debería proporcionar un método más rápido y cuantitativo para medir la proteína objetivo de las muestras biológicas en comparación con los métodos tradicionales como el Western blot.