Name: Procedimiento y estrategias clave de la optimización para un método de inmunoensayo de basadas en electroforesis capilar automatizado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Aprende a realizar inmunoensayos automatizados basados en electroforesis capilar para cuantificar proteínas en muestras biológicas. Este método optimiza tiempos de exposición y diluciones de anticuerpos para obtener resultados reproducibles con menor cantidad de proteína que el Western blot tradicional.

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Los autores desean agradecer Keith Tarpley de la EPA oficina de equipo de investigación y desarrollo-Research Triangle Park (RTP-ORD) gráfica y los medios de comunicación para el desarrollo, grabación y edición de video instructivo. También nos gustaría dar las gracias a Deborah Pritchett de ProteinSimple para mantener conversaciones útiles con respecto a la optimización de nuestros datos de. Guynn JM fue apoyado por el Instituto de Oak Ridge para la ciencia y el programa de Educación de la investigación y la participación en la Agencia de protección ambiental de nosotros.

Nota: Asegúrese de que todos los reactivos y las muestras se preparan de acuerdo con el fabricante &#39; protocolo de s, se indica a continuación. Por favor, use equipo de protección personal apropiado durante este procedimiento, que incluye guantes de nitrilo, bata de laboratorio, zapatos cerrados y gafas de seguridad. Una tabla de materiales, reactivos y equipo necesario se suministra por separado. Concentración de proteína de las muestras debe determinarse previamente mediante metodologías establecidas que son compatibles con el lisado buffer utilizado, como el ensayo de Bradford 11.
 1. preparación de muestras y reactivos del paquete estándar como suministrado por el fabricante de <ol><li>para preparar la solución de trabajo de 400 mM de Ditiotreitol (DTT), añadir agua desionizada μl 40 para el tubo transparente que contiene la stock suministrado por el fabricante. Es importante evitar la introducción de burbujas a la solución al mezclar la solución con lentos y suaves pipeteo.</li>
	<li>Añadir 20 μl 10 X tampón y 20 μl de la solución preparada 400 mM TDT rosa tubo que contiene 5 fluorescente X master mix (véase la Tabla de materiales). 
	Nota: El Master Mix (MM) es sellada por el fabricante con una cubierta de aluminio y debe ser traspasado por una punta de pipeta. Mezcla suavemente transfiriendo lento para evitar salpicaduras de TDT en la pipeta.</li>
	<li>a continuación, añadir agua desionizada μl 16, suministra de 2 μl de 10 X tampón de muestra y 2 μl de la solución TDT preparado 400 mM blanco biotinilado escalera tubo suministrado por el fabricante. Mezclar suavemente y transferir a un tubo de 0.6 mL para desnaturalización.</li>
	<li>Preparar 0.1 x tampón diluyendo el suministrado 10 X solución 1: 100 con agua. Preparar suficiente 0.1 x tampón para diluir todas las muestras de.</li>
	<li>Calcular la cantidad de buffer de muestra x 0.1 que es agregado a una muestra, que dependerá de la concentración final deseada de la proteína total. Mezclar 1 parte 5 x fluorescente MM con 4 partes de muestra para conseguir la concentración final deseada diluida.
	<ol><li>Calcular volúmenes como sigue: (i) volumen 5 x fluorescente MM = (concentración de proteína final deseada) / 5; (ii) volumen de stock de proteína = (concentración de proteína final deseado x volumen Total necesario) / proteína accionario concentración; (iii) volumen 0.1 x buffer de la muestra = volumen Total - 5 x volumen m - proteína stock volumen.</li>
	</ol></li></ol> 2. Desnaturalización de las muestras y la escala <ol><li>lugar preparado muestras y escalera biotinilado en un bloque de calor de 95 ° C por 5 min los tubos Vortex inmediatamente después de la incubación, ejecutar un giro de ~ 5 s en un lugar de hielo y centrífuga de mesa 
	Nota: Algunas proteínas pueden exigir más condiciones de desnaturalización (p. ej., 70 o C durante 10 min) para evitar la agregación de la proteína y mejorar la migración en la matriz capilar. Considerar esta opción si hay manchas pesadas en los más altos pesos moleculares (ver video por ejemplo).</li>
</ol> 3. Preparación de anticuerpos <ol><li>según lo determinado por la optimización (véase Resultados de representante y video), preparar el deseado añadir de anticuerpo primario (p. ej., 1:50, 1: 100) de los anticuerpos suministrados Diluyente 2. 
	Nota: Los anticuerpos se utilizan generalmente en concentraciones más altas para inmunoensayo basado en el tubo capilar que por borrar occidental tradicional. El anticuerpo secundario suministrado está listo para usar sin dilución.</li>
</ol> 4. Preparación de Luminol-S y peróxido de <ol><li>preparar una mezcla de 1:1 de luminol-S y peróxido de.</li>
	<li>Vortex para mezclar y almacenar en hielo. 
	Nota: Es importante que esta mezcla se prepara fresca para cada ensayo experimental. mezcla total 250ul se necesita para ejecutar un plato completo.</li>
</ol> 5. Preparación de la placa de ensayo <ol><li>como se muestra en la figura 1, cargar las muestras y los reactivos preparados anteriormente en la placa de ensayo. Ver instrucciones detalladas a continuación para cada fila. Para minimizar la evaporación de los pozos, asegúrese que la tapa de la placa se sustituye entre adiciones de reactivo.</li>
	<li>En fila A, pipeta de 5 μl de escalera biotinilado en A1 bien. Para la fila restante, pipeta preparado muestras (5 μl) en los pocillos A2-A25. 
	Nota: Es imperativo que el A1 siempre contiene escalera, como el primer capilar en el cartucho está optimizado para ejecutar esta norma.</li>
	<li>En fila B, pipetee 10 μl de anticuerpo diluyente 2 en cada pocillo (B1-B25).</li>
	<li>En la fila C, pipetee 10 μl de anticuerpo diluyente 2 en pozo C1. En la fila restante C pozos, pipetee 10 μl de anticuerpo primario (pozos C2-C25).</li>
	<li>En la fila D, pipetee 10 μl de estreptavidina-HRP en D1 bien. En la fila restante D pozos, pipetee 10 μl de anticuerpo secundario (pozos D2-D25).</li>
	<li>En fila E, pipetee 10 μl de la mezcla recién preparada de peróxido de luminol en cada pocillo (E1-E25).</li>
	<li>Por último, Añadir 500 μl de tampón de lavado por compartimiento a cada una de las filas del top 3 de los pozos de búfer. 
	Nota: Es importante minimizar la formación de burbujas pipeteando suavemente y no expulsando el volumen final de la punta como burbujas pueden interferir con el tubo capilar carga y ejecutar.</li>
	<li>Una vez que se cargan todos los pozos, centrifugar la placa a ~ 1000 x g durante 5 min a temperatura ambiente para eliminar las burbujas y el líquido esté en el fondo de los pozos. Pop burbujas visibles con una pequeña pipeta o aguja limpia (p. ej., estéril de calibre 25 &#34; top rep &#34; aguja).</li>
</ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig1.jpg" /> figura 1 . Plantilla de pipeteado para la placa de ensayo. Código de colores representa correctamente reactivos y las muestras (total hasta 24) añadidas a la placa de ensayo. Añadir biotinilado escalera a (naranja), bien A1 preparado muestras de pozos A2 hasta A25 (azul claro), anticuerpo 2 diluyente en los pocillos B1-B25 y C1 (verde claro), anticuerpo primario en los pocillos C2 hasta C25 (azul), estreptavidina-HRP a bien D1 (rosa oscuro), anticuerpo secundario para pozos D2 hasta D25 (verde oscuro) y la mezcla de peróxido de luminol en los pocillos E1 hasta E25 (morado). Tampón de lavado se añade a las primeras tres filas de la placa media grande pozos (azul oscuro). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig1large.jpg" target="_blank"> haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
 6. a partir del instrumento capilar inmunoensayo <ol><li>Asegúrese de encienden el instrumento y el equipo que lo acompaña. No tiempo de calentamiento es necesario.</li>
	<li>Abra el software de instrumentación en la computadora. En primer lugar, seleccione la &#34; ensayo &#34; ficha a la derecha de la ventana y &#34; nuevo ensayo &#34; bajo la &#34; menú Archivo &#34; a la izquierda. Seleccionar el tamaño, rango de tamaño (p. ej., 12-230 kDa) y cartucho de tipo (p. ej., tubo capilar 25) que fue utilizado para el ensayo particular. 
	Nota: Una entrada también de mayo ensayo los parámetros, incluyendo la concentración de proteína, el tipo de anticuerpo y dilución, si lo desea, pero éstos no están obligados a iniciar el análisis.</li>
	<li>Abrir la puerta en el instrumento presionando el botón en la parte superior del panel naranja.</li>
	<li>Cuidadosamente Desembale el cartucho capilar. Sin tocar los tubos capilares de vidrio, coloque el cartucho en el soporte del cartucho. Verificar asientos de cartucho mediante la observación de la luz interior cambia de naranja a azul.</li>
	<li>Sujetan firmemente sobre el Banco y retire cuidadosamente el sello de la evaporación de la parte inferior de la placa. Pop burbujas en estos pozos de matriz de separación con un smtodos los punta de la pipeta o aguja limpia (p. ej., estéril de calibre 25 &#34; top rep &#34; aguja).</li>
	<li>Coloque la placa de ensayo en el sostenedor de la placa, asegurando que esté completamente colocado y cierre la puerta instrumento.</li>
	<li>Haga clic en la &#34; Inicio &#34; en botón software. 
	Nota: Si no aparece ningún botón de inicio, la conexión con el instrumento se ha perdido. Elegir el instrumento en el menú superior izquierdo, luego conecte. Debe aparecer una ventana emergente con el número de serie del instrumento; Seleccione esta opción, a continuación, haga clic en conectar. El botón de inicio debería aparecer ahora.</li>
	<li>Cuando el plazo termine, deseche la placa. Quite el cartucho y coloque en un contenedor de objetos punzantes para su eliminación, junto con cualquier agujas que pueden haber sido usados para burbujas de pop. Deja el poder en para evitar problemas de conexión si se utiliza regularmente el instrumento (p. ej., al menos semanalmente).</li>
</ol> 7. Análisis de experimento <ol><li>antes del análisis, garantizar que se realizan los siguientes controles de calidad.
	<ol><li>Estándares fluorescentes verificar seleccionando la &#34; Mostrar normas &#34; icono. Verificar que las normas están correctamente identificadas en la &#34; vista gráfico &#34; ficha. Si son incorrectas, ir a la &#34; sola vista &#34; icono, haga clic en el pico correcto y seleccione &#34; estándar de fuerza &#34;, o haga clic en el pico incorrecta y seleccione &#34; no un estándar &#34;. Realizar esta comprobación para cada tubo capilar nuevo.</li>
		<li>Verificar biotinilado escalera haciendo clic en el &#34; muestras de &#34; y &#34; vista solo &#34; los iconos. Seleccione la escalera en la ficha del experimento. Si un pico es incorrectamente, haga clic derecho sobre él en &#34; vista gráfico &#34; y seleccione &#34; pico de quitar &#34;. 
		Nota: por ejemplo, la escalera biotinilado utilizada para el kit de kDa 12-230 debe mostrar 12, 40, 66, 116, 180 y 230 kDa picos de tamaño. Si no se realiza este paso, el tamaño de los picos muestra incorrectamente se calculará, producir falsos resultados.</li>
		<li>Ver y analizar los picos de la muestra. Obtener datos de la tabla de picos, como peso molecular, área de pico, altura máxima y señal a ruido (S/N), según sea necesario para los cálculos experimentales.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten. Este manuscrito ha sido revisado por la salud nacional y el laboratorio de investigación de efectos ambientales y aprobado para su publicación. El contenido no refleja necesariamente las opiniones de la EPA ni mención de nombres comerciales o productos comerciales constituye aprobación ni recomendación para su uso.

Durante décadas, ha habido interés sostenido en el desarrollo de métodos de inmunoanálisis basados en electroforesis capilar debido a baja muestra y reactivo de gasto, disminuido de procesamiento tiempo comparado con los métodos tradicionales y alta compatibilidad automatizar el procedimiento4,15. Hay un número de diferentes protocolos para la separación de las proteínas que han utilizado los capilares, como polímero electroforético, electrocinético, tamizado y métodos isoeléctricos, que aislar proteínas de diferentes propiedades (respectivamente, carga electrostática, equilibrio de partición, tamizado de propiedades de la matriz de separación y pH)16. Aquí, describimos un método de electroforesis capilar basados en anticuerpos (o inmunoensayo), utilizando un polímero tamizado separación, que ha sido automatizado y comercialmente adoptado3. Las ventajas de este sistema incluyen facilidad de uso y operación, reactivos estandarizados y disponibles en el mercado y mediciones fiables y sensibles que requieren menos reactivo y las muestras en comparación con ensayos de proteínas tradicionales como la western blot inmunoensayo ligado a enzimas y otros formatos de3,4,5. Se ha observado en las evaluaciones previas de esta tecnología que la gama del tamaño de la proteína que puede ser evaluada ha sido limitada por la separación disponible matriz4, ofertas sin embargo recientes han ampliado la gama de valores medibles de 2 a kDa 44017 . Además, algunos buffers lisados son conocidos por ser incompatible con el ensayo18, por lo tanto selección de los reactivos experimentales usados debe considerarse previamente.
Una ventaja importante de un procedimiento automatizado con componentes disponibles en el mercado es la consistencia de resultados a través de métodos estandarizados y reactivos. Esto minimiza las posibilidades de fracaso de ensayo mediante la automatización de pasos críticos en el procedimiento. Sin embargo, es importante tener en cuenta que ciertas prácticas deben respetarse durante el protocolo para minimizar los problemas con el inmunoensayo basadas en electroforesis capilar. En primer lugar, es crítico que la mezcla de luminol-S/peróxido se prepara fresco e inmediatamente antes de placa de carga. Constante tiempo resultará en luminiscencia constante después de agrega el agente oxidante, que dará como resultado mediciones constantes para un ensayo determinado anticuerpo después de ensayo. Además, es importante que se utilicen reactivos no caducados, que afecta sobre todo a la potencia del agente oxidante. Además, es importante que el orden de carga de muestras, anticuerpos y otros reactivos estrictamente seguida (ver figura 1). Cualquier reactivo pipetea fuera de lugar resultará en fracaso de ensayo y una carrera desperdiciada.
Además de estos pasos críticos, temas primarias experimentadas con la técnica generalmente pueden ser superados mediante optimización. De hecho, estas condiciones son específicas para cada combinación de sistema anticuerpos de modelo y por lo tanto deben determinarse empíricamente para cada nuevo ensayo. En este artículo, nos centramos en tres procedimientos comunes de optimización: tiempo de exposición, valoración lisado y dilución del anticuerpo primario. Depende de la capacidad para generar resultados medibles en el análisis de un tiempo de exposición cuando el sustrato del luminol no es ser rápidamente agotado, como resultado de agotamiento de sustrato en pérdida de señal. Valoración lisado determina el rango dinámico lineal de cada ensayo, que puede variar con diferentes modelo de los sistemas, así como diversos anticuerpos, incluso para el mismo objetivo de proteína. Las diluciones de anticuerpo elegidas en o cerca de concentraciones de saturación garantizar cambios en la señal no será afectados por la escasez de anticuerpos libres, pero sólo por diferentes cantidad de proteína disponible objetivo del epítopo. Otras consideraciones durante el proceso de optimización pueden incluir tiempo de incubación del anticuerpo y apilamiento/carga de la muestra. En la mayoría de los casos la configuración por defecto para el instrumento ofrece el mejor equilibrio entre sensibilidad y resolución. Sin embargo, en algunos casos, mala resolución o sensibilidad puede mejorarse mediante el ajuste de estos parámetros.
Métodos de inmunoensayo basadas en electroforesis capilar ofrecen las mediciones de proteína rápida, eficiente y reproducible. Mientras que estos métodos se han utilizado principalmente en entornos de investigación y desarrollo, la coherencia de estas tecnologías tiene utilidad potencial en usos clínicos y regulatorios. Por ejemplo, la identificación de subpoblaciones sensibles a tóxicos medioambientales o en pacientes con progresión de la enfermedad puede basarse en proteínas biomarcadores medidos en matrices de acceso, tales como sangre, orina y saliva. Como reactivo y caída de los costos de operación y el número de muestras y blancos que pueden ser evaluados al mismo tiempo aumenta, probablemente veremos métodos de inmunoanálisis basados en electroforesis capilar utilizados para este tipo de aplicaciones.

Inmunoensayos electroforéticos capilares medida expresión de la proteína en los lysates de la célula utilizando sistemas de separación de tamaño o carga y ofrecen varias ventajas sobre el tradicionales inmunoensayos. Por ejemplo, en comparación con western blot, el procedimiento automatizado basado en el tubo capilar elimina la necesidad de geles, dispositivos de transferencia, y lavado manual. Además, la cantidad absoluta de proteínas necesaria es aproximadamente 10 veces menos, haciendo sistemas de tubo capilar ideal para el uso con tipos raros de la célula o limitada muestra1,2. Resultados se obtienen en tan sólo 3 h utilizando sistemas automatizados y anteriormente se han demostrado para ser más cuantitativa y reproducible que convencional occidental blot procedimientos3,4,5. El proceso de ensayos de tamaño consiste en cargar las muestras que contienen sulfato de sodio dodecyl (SDS), dithiothreitol (DTT) y fluorescencia con la etiqueta marcadores de peso molecular en columnas capilares que contienen matrices de apilamiento y de separación. Voltaje aplicado a los tubos capilares separa las proteínas en las muestras según el tamaño, y la luz UV inmoviliza las proteínas separadas de la pared capilar. El capilar es inmuno-sondeado con destino específico primaria rábano picante y el anticuerpo peroxidasa (HRP)-anticuerpo secundario conjugado. Luminol y peróxido de catalizan la generación de luz quimioluminiscente que es medido por una cámara de carga dispositivo acoplado (CCD) y analizada para cuantificar proteínas.
A pesar de la relativa facilidad y velocidad de una plataforma automatizada basada en tubo capilar electroforético inmunoensayo, optimización de condiciones de ensayo como el tiempo de exposición, dilución de anticuerpo y la concentración de proteína es importante para la obtención precisa y reproducible resultados. En general, los siguientes procedimientos se deben realizar para optimizar un análisis para estos sistemas:
1) una pantalla se debe realizar para evaluar y elegir los anticuerpos para la señal y especificidad a la meta de proteína. Si está disponible, proteína purificada o epitopo de destino puede utilizarse para evaluar la especificidad; sin embargo, sigue siendo importante evaluar potencial señal inespecífica en proteína total proviene del sistema modelo.
2) a continuación, el rango dinámico del ensayo debe ser determinado. En una situación ideal, señal de doblar (medido mediante el área de pico) se observa como se duplica la concentración de la muestra; sin embargo, en la práctica, un cambio proporcional en la señal de entrada de manera predecible (p. ej., linear fit) es suficiente para la cuantificación de proteína. Además, esta optimización define la concentración de proteína con alta señal, pero todavía dentro del rango lineal para el modelo experimental.
3) determinar la concentración óptima del anticuerpo con la concentración de proteína fijo elegida en el paso 2 de la optimización. Como la concentración de anticuerpos aumenta, la señal aumenta hasta mesetas en saturación. Una concentración de anticuerpo cerca de este nivel de saturación es necesaria para una medición precisa de la concentración de la proteína.
El proceso utilizado para optimizar las concentraciones de proteína, las diluciones de anticuerpo y tiempos de exposición para un tamaño basado en el tubo capilar automatizado análisis6 se demuestra usando los extractos de células enteras aislados de BEAS-2B, un humano de SV-40 transformado bronquial línea de células epiteliales. Aislamiento de proteínas de los extractos de célula o tejido se puede realizar usando un número de protocolos publicados7,8,9 y no se tratarán aquí. Resultados de un experimento de prueba usando las condiciones optimizadas son también registrados por total y fosforila p53 (serina 15, serina 20) en cultivos expuestos a doxorrubicina (un agente quimioterapéutico común que induce la apoptosis de la célula10) en 1.2, 1.8, y media de 2,4 μg/mL para 4 h antes de la cosecha. Las áreas de pico de p53 se normalizan para ɑ-tubulina, que se utiliza como un control de carga.

<table><tbody><tr><td>Instrumento Wes</td><td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)</td><td>004-600</td><td></td></tr><tr><td>P53 DO-1 anticuerpo primario</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-126</td><td></td></tr><tr><td>P53 fosforilado (SER 15) anticuerpo primario</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>9286</td><td></td></tr><tr><td>P53 fosforilado (SER 20) Anticuerpo primario</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>9287</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo primario de alfa-tubulina</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>3873</td><td>utilizada como control de carga</td></tr><tr><td>Compass Software</td><td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)</td><td></td><td>provisto con el</td></tr><tr><td>kit Wes 12-230 kDa Master</td><td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)&nbsp;</td><td>PS MK02 (desde entonces reemplazado por un nuevo kit #)</td><td></td></tr><tr><td></td><td>www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html</td><td>INCLUYE Nº DE PIEZA: Tampón de lavado (60 mL) 042-202 Tampón de muestra 10X (440 &mu; L) 042-195 Microplacas precargadas (8) PS-PP01 Cartuchos capilares (8) PS-CC01 Diluyente de anticuerpos II (20 mL) 042-203 Luminol-S (1,5 mL) 042-233 Peróxido (1,5 mL) 042-234 Estreptavidina-HRP (132 &mu; L) 042-414 Paquete Estándar (8): Escalera biotinilada, mezcla maestra fluorescente 5X, DTT y tubo vacío de 0,6 mL PS-ST01 Anticuerpo Secundario Anti-Conejo 042-206 o Anticuerpo Secundario Anti-Ratón 042-205</td><td></td></tr><tr><td>Name&nbsp; <</td><td>strong>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Cultivo celular, tratamiento y cosecha (utilizando protocolos recomendados por el proveedor; protocolos no incluidos en el manuscrito)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colección Americana de Cultivos de Tipo de Células BEAS-2B</td><td>(ATCC, Manassas, VA)</td><td>CRL-9609</td><td></td></tr><tr><td>medio de crecimiento de queratinocitos, KGM Gold</td><td>Lonza Ltd (Basilea, Suiza)</td><td>192152</td><td>para cultivo celular</td></tr> medio <tr><td>basal de queratinocitos, KBM Gold</td><td>Lonza Ltd (Basilea, Suiza)</td><td>192151</td><td>medio libre de suero para dosificación química</td></tr><tr><td>doxorrubicina</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>D1515</td><td></td></tr><tr><td>Azul de Coomassie Ensayos Bradford</td><td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td><td>23200</td><td>para la cuantificación de proteínas</td></tr><tr><td>Kit de extracto nuclear</td><td>Active Motif (Carlsbad, CA)</td><td>D1515</td><td>utilizado para preparar lisados de células enteras</td></tr><tr><td></td><td></td><td>INCLUYE:</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Tampón de lisis AM1</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>1M ditiotreitol (DTT)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Cóctel</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> de inhibidores de proteasa <td>10X PBS& nbsp;</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Inhibidores de la</td><td></td> fosfatasa</tr></tbody></table>

procedimiento y estrategias clave de la optimización para un método de inmunoensayo de basadas en electroforesis capilar automatizado

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

Nuevas tecnologías que utilizan inmunoensayos basados en tubo capilar prometen evaluación más rápido y más cuantitativa de proteína comparado con inmunoensayos tradicionales. Sin embargo, otros ensayos basados en anticuerpos de la proteína, optimización de parámetros de inmunoensayo basado en el tubo capilar, tales como concentración de proteína, dilución de anticuerpo y tiempo de exposición es un requisito previo importante para la generación de significativos y confiables datos. Las mediciones deben estar dentro del rango lineal del ensayo donde los cambios en la señal son directamente proporcionales a los cambios en la concentración de lisado. El proceso de elección de las concentraciones adecuadas de lisado, las diluciones de anticuerpo y tiempos de exposición en la línea de células epiteliales bronquiales humanas, BEAS-2B, se demuestra aquí. Linealidad de ensayo se muestra en un rango de concentraciones de proteína Extracto de células enteras con anticuerpos p53 y α-tubulina. Un ejemplo de quemadura de la señal se ve en las concentraciones más elevadas con tiempos de exposición largos, y se muestra una curva de dilución de anticuerpo de α-tubulina demostrando saturación. Además, se reportan resultados experimentales ejemplo para células tratadas con doxorrubicina con parámetros optimizados.

Tiempo de exposición - Burnout de señal de determinación
Quemadura de la señal puede ocurrir cuando el sustrato peróxido y luminol se agota demasiado rápido. Se puede determinar mediante el examen de los datos en tiempos de exposición distintos de la quimioluminescencia. En el software de análisis, vaya a "Editar – &#62; análisis – &#62; imágenes". Las exposiciones van desde 5 hasta 480 s. El eje y en un electroferograma informa/tiempo de la señal, por lo que los datos de cada exposición deben tener un coeficiente de tiempo de la señal similar. Este coeficiente disminuye con exposiciones prolongadas secuencialmente si luminol se convierte en agotados, como se ha visto con el p53-1 anticuerpo (figura 2). Por agotamiento del substrato, este ensayo puede considerarse medible hasta la concentración de μg/μl 0.2 sólo en las exposiciones de s 5-30. Por lo tanto, en este ejemplo, 15 s se determinó que el tiempo de exposición de análisis de datos óptima para p53.
Valoración de lisado - Determinar el rango dinámico lineal
Es importante que se tomen medidas dentro del rango dinámico lineal de cada ensayo, donde los cambios en la señal medida por el área de pico son proporcionales a los cambios en la cantidad de proteína en la muestra. Utilizando el tiempo de exposición óptimo de 15 elegidos de s en la sección anterior, se demuestra linealidad de ensayo para p53 y ɑ-tubulina durante más de una gama de 15 dobleces de concentración (figura 3). En nuestra experiencia, un valor de R2 de &#62; 0.9 de una regresión lineal de ajuste se considera aceptable para un rango de dilución de la proteína purificada de cantidad conocida (si es una medida cuantitativa absoluta) o muestra lisado de proteínas objetivo desconocido (si ensayo es una medida cuantitativa relativa).
Optimización de dilución del anticuerpo
Usando los anticuerpos a saturar las concentraciones ayuda a asegurar que los cambios de señal medidos sean debidos a cambios en la cantidad de proteína. Como demostración, dos líneas de células BEAS-2B (0,2 μg/μl proteína total cargado en el ensayo) los extractos de células enteras se sondeaba con concentraciones de anticuerpos diluidos en serie ɑ-tubulina que van desde 1:25 - 1: 800 (figura 4). Señal quimioluminiscente (aquí, medida como área de pico) se traza contra la dilución del anticuerpo. Saturación fue observada cerca de la 1:50 donde la curva comienza una notable meseta de dilución.
Ensayo experimental - tratamiento de doxorrubicina en las células BEAS-2B
Usando las condiciones analíticas optimizadas, cultivo de células BEAS-2B fue tratado con tres diferentes concentraciones de doxorrubicina (1.2, 1.8 y 2.4 μg/mL) durante 4 h (figura 5, tabla 1). Activación de p53 a través de modificaciones poste-de translación media varias respuestas celulares, incluyendo la detención del ciclo celular, senescencia y apoptosis12. Específicamente, la fosforilación de la serina 15 se ha atribuido a la activación transcripcional de p53, resultando en la apoptosis después de la doxorrubicina tratamiento13. En esta demostración, ɑ-tubulina normalizado pico áreas se presentan como doble del control. Curiosamente, 3.5 aumentos 4 veces en p53 fosforilación en serina se observaron incrementos de 15 y 2 veces en el nivel de p53 fosforilada en serina 20 después de la exposición de 4 h a la doxorrubicina. Estos resultados indican la activación de p53; sin embargo, no hay respuesta a la dosis se considera para las concentraciones elegidas (por el contrario, la dosis más baja probada produce la respuesta más alta). Total p53 no demostró una respuesta clara en este sistema de modelo. Previamente hemos observado la activación de la fosforilación de p53 en la ausencia de aumento de los niveles de p53 total bajo condiciones similares en tratados con zinc de las células BEAS-2B14.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig2v3.jpg"> 
Figura 2 . Comparación de exposición de imagen para detectar señales de agotamiento. Lane vistas mostrar disminución de las concentraciones de proteína para lisados de BEAS-2B sondeado con p53-1 anticuerpo a una dilución 1: 500. Coeficientes de señal QL, como alturas de pico en el software del instrumento, se superponen. A diferencia de las alturas de pico, las intensidades de la banda visual se generan automáticamente y ajustar el instrumento para facilitar la visualización de las bandas y no es comparable de un panel a otro. Tenga en cuenta la disminución en la señal de la quimioluminescencia como aumento del tiempo de exposición, con la señal comienza a desaparecer (split pico) en las dos exposiciones más largas, que indica agotamiento de sustrato. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig2v3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig3v3.jpg"> 
Figura 3 . Valoración lisado que muestra las vistas de carril. Valoración lisado mostrando el carril considera (A) de BEAS-2B lisado cuando sondeado con 1: 500 p53-1 o 1:50 ɑ-tubulina. A diferencia de los valores de área de pico, las intensidades de la banda visual se generan automáticamente y ajustar el instrumento para facilitar la visualización de las bandas y no es comparable de un panel a otro. Análisis de regresión lineal (B) confirma que los análisis son lineales en toda la gama probada, de 0.01 a 0.20 μg/μl y 0.025 a 0.40 μg/μl, con valores de2 R de 0.999 y 0.985, respectivamente. Las concentraciones de proteínas totales en el medio de la gama lineal fueron escogidas para dar cabida a posibles variaciones de proteína objetivo en cualquier dirección (e.g., 0,2 μg/μl de α-tubulina). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig3v3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig4.jpg"> 
Figura 4 . Curvas de dilución del anticuerpo α-tubulina para dos BEAS-2B separadas proteína lisados con y sin normalización de la línea de base. Una definitiva departura de linealidad se ve en el 1:50 (0,02) dilución, lo que indica saturación. 1:50, por tanto, fue elegida como la dilución óptima para este anticuerpo. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig5.jpg"> 
Figura 5. Efecto del tratamiento con doxorrubicina (DXN) 4 h en total y la serina fosforilados expresión de la proteína p53 de las células BEAS-2B. Áreas de pico son normalizadas a α-tubulina y trazadas como doble del control (CTL). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/55911/55911tbl1.jpg"> 
Tabla 1. Efecto del tratamiento con doxorrubicina (DXN) 4 h en total y la serina fosforilados expresión de la proteína p53 de las células BEAS-2B. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911tbl1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta mesa.</a>

Se demuestra un inmunoensayo de capilar usando una plataforma comercial para medir las proteínas blanco de preparaciones de proteínas totales. Además, parámetros de ensayo del tiempo de exposición, concentración y dilución de anticuerpo están optimizados para un sistema de modelo de cultivo celular.

Procedimiento y estrategias clave de la optimización para un método de inmunoensayo de basadas en electroforesis capilar automatizado

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar un inmunoensayo por electroforesis capilar utilizando una plataforma comercial. Esta plataforma distinguirá y cuantificará dianas proteicas a partir de una muestra biológica que puede obtenerse de tejidos de cultivo celular y fluidos biológicos. El proceso examina proteínas basándose en su tamaño, que varía entre dos y 440 kilodaltons.La ventaja de este procedimiento automatizado frente a los procedimientos tradicionales, como el Western blot, es que los ensayos inmunológicos por electroforesis capilar eliminan la necesidad de geles, dispositivos de transferencia y lavados manuales. Además, la cantidad absoluta de proteína requerida es aproximadamente 10 veces menor, lo que hace que el procedimiento sea ideal para tipos celulares raros o muestras limitadas. Asimismo, los resultados se obtienen en tan solo tres horas utilizando sistemas automatizados y se ha demostrado que son más cuantitativos y reproducibles que los procedimientos convencionales de Western blot.Prepare las muestras y los reactivos del kit, incluyendo tampón de muestra, ditiotreitol, mezcla maestra fluorescente y escalera biotinilada según el inserto del producto del fabricante. Prepare las muestras de proteína utilizando su método preferido. Aquí aislamos extracto total de células de cultivos celulares BEAS-2B.Diluya las muestras de proteína con tampón de muestra. Mezcle una parte de la mezcla maestra fluorescente 5X con cuatro partes de la muestra diluida para alcanzar la concentración final deseada de proteína. A continuación se muestra un ejemplo de cálculo para preparar 70 microlitros de una concentración final de 0,2 microgramos por microlitro, partiendo de una concentración de stock de proteína de 1,2 microgramos por microlitro.La mezcla maestra representa 1/5 del volumen total, en este caso, 14 microlitros. Para calcular el volumen de la solución stock de proteína necesario, multiplique la concentración final deseada por el volumen total y divida entre la concentración de la solución stock de proteína. Reste los volúmenes de la mezcla maestra y de la solución stock del volumen total para calcular el volumen de tampón de muestra.Deshacer las muestras y la escalera preparadas calentando a 95 grados centígrados durante cinco minutos. Tenga en cuenta que algunas proteínas pueden requerir condiciones de desnaturalización más suaves. Por ejemplo, 70 grados durante 10 minutos para prevenir la agregación de proteínas y mejorar la migración.Considere esta opción si hay un fuerte desenfoque en los pesos moleculares más altos. Prepare las diluciones deseadas de anticuerpos en el diluyente proporcionado. Tenga en cuenta que, por lo general, los anticuerpos se utilizan a concentraciones más altas para inmunoensayos basados en capilaridad que para el inmunoblot tradicional.Prepare una mezcla uno a uno de luminol y peróxido fresca en cada uso. Pipetee las muestras y los reactivos en la placa de ensayo utilizando los volúmenes indicados en la plantilla. La codificación por colores representa la carga adecuada de reactivos y muestras en la placa de ensayo.Pipetear la escala biotinilada en el pocillo A1 y las muestras preparadas en los pocillos A2 a A25. Agregar el diluyente de anticuerpo suministrado a los pocillos B1 a B25 y al pocillo C1. Agregar el anticuerpo primario a los pocillos C2 a C25. Agregar estreptavidina HRP al pocillo D1. Agregar el anticuerpo secundario a los pocillos D2 a D25.Y añada la mezcla de luminol-peróxido a los pocillos E1 a E25. Añada tampón de lavado a las primeras tres filas de los pocillos más grandes del centro de la placa. Encienda el instrumento de inmunoensayo capilar y abra el software correspondiente.Cargue el cartucho capilar y la placa de ensayo en la máquina según las instrucciones del fabricante e inicie la corrida. Cuando la corrida haya finalizado, verifique que los estándares fluorescentes se hayan identificado correctamente y corrija si es necesario. Además, compruebe que la escalera biotinilada muestre los picos de tamaño correctos para el kit utilizado.Consulte la guía de referencia rápida o el manual del producto del fabricante para obtener más detalles. La optimización de las condiciones del ensayo, como el tiempo de exposición, la concentración de proteína y la dilución del anticuerpo, es importante para obtener resultados precisos y reproducibles. Estas condiciones son específicas para cada combinación de sistema modelo y anticuerpo, y por lo tanto, deben determinarse empíricamente para cada nuevo ensayo.La capacidad de generar resultados cuantitativos depende del análisis de un tiempo de exposición en el que el sustrato de luminol no se agote rápidamente, ya que el agotamiento del sustrato provoca la pérdida de señal o la saturación de la señal. Esto puede determinarse examinando los datos a diferentes tiempos de exposición de quimioluminiscencia, como se muestra en la figura dos. Las exposiciones con el instrumento utilizado oscilaron entre cinco y 480 segundos.Las vistas de las bandas mostraron una disminución en las concentraciones de proteína para los extractos de BEAS-2B analizados con el anticuerpo p53 DO-1 a una dilución de uno a 500. Los coeficientes de la señal quimioluminiscente, reportados como alturas de pico en el software del instrumento, se superponen. Las intensidades visuales de las bandas son ajustadas automáticamente por el instrumento y no son comparables entre un panel y otro.El coeficiente de la señal disminuye con exposiciones secuencialmente más largas si el luminol se agota, como se observa aquí. La señal comienza a desaparecer y el pico se divide en las dos exposiciones más largas. Debido a esto, se eligió un tiempo de exposición corto de 15 segundos para el análisis de datos.La cantidad total de proteína debe optimizarse también para cada ensayo y sistema modelo particular. Para la evaluación cuantitativa, las mediciones deben realizarse dentro del rango dinámico lineal de cada ensayo, donde los cambios en la señal, medidos por el área del pico, son proporcionales a los cambios en la cantidad de proteína en la muestra.La titulación del lisado muestra las vistas de las bandas del lisado BEAS-2B cuando se utiliza de uno a 500 de p53 DO-1 o de uno a 50 de anticuerpo anti-alfa-Tubulina. El análisis de regresión lineal confirma que los ensayos son lineales en todo el rango probado. Se eligieron concentraciones totales de proteína en la parte media del rango lineal para acomodar posibles variaciones del proteína diana en cualquier dirección.Como consideración final de optimización, se debe evaluar la dilución adecuada del anticuerpo primario. Utilizar anticuerpos en concentraciones saturantes ayuda a garantizar que cualquier cambio en la señal medida se deba únicamente a variaciones en la cantidad de proteína. Dos muestras de proteína BEAS-2B, representadas por los puntos azules y naranjas, fueron analizadas con diluciones en serie del anticuerpo contra alfa-Tubulina.La señal de quimioluminiscencia, medida como área del pico, se representó frente a la dilución del anticuerpo. Se observó saturación cerca de la dilución de uno a 50, donde la curva comienza una meseta notable. Por lo tanto, se eligió la dilución de uno a 50 como la dilución óptima para este anticuerpo.Después de ver este video, debería sentirse cómodo preparando muestras, cargando muestras y ejecutando el análisis en el instrumento de inmunoensayo basado en capilares ProteinSimple Wes. Una vez que domine este procedimiento, todo el análisis se puede realizar en tres horas con 25 muestras. Al analizar un ensayo, es importante realizar un control de calidad para cada capilar y muestra.Esto incluye verificar los patrones fluorescentes en una escalera biotinilada. Si los picos se identifican incorrectamente, el software de análisis debe utilizarse principalmente para identificar los picos correctos y eliminar los picos identificados de forma errónea. Como con todas las técnicas de biología molecular en el laboratorio, use el equipo de protección personal adecuado para protegerse a sí mismo y a sus muestras.Esto incluye bata de laboratorio, guantes, gafas de seguridad y calzado cerrado. Es importante tener en cuenta que se debe realizar una optimización para cada nuevo objetivo que se mida o cuando se utilicen diferentes fuentes de muestras. Los pasos de validación y seguimiento incluyen evaluar la especificidad del anticuerpo y la señal utilizando proteína purificada o epítopo.Prueba del rango dinámico del ensayo mediante una serie de diluciones de la muestra y optimización de la dilución del anticuerpo al evaluar la saturación de la señal en un rango de concentraciones de anticuerpo. Una vez optimizado, este procedimiento inmuno por capilaridad debería proporcionar un método más rápido y más cuantitativo para medir la proteína diana en muestras biológicas en comparación con métodos tradicionales como el Western blot.

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Research

Investigación

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Biology

Biología

Este video muestra un protocolo de inmunoensayo de electroforesis capilar para detectar un biomarcador de proteínas asociado con la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) a partir de plaquetas de la sangre humana. La confirmación de la presencia de la proteína biomarcador de ELA se logra mediante la separación basada en el tamaño de las proteínas plaquetarias seguida de una detección quimioluminiscente.

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Aquí, presentamos un protocolo completo de electroforesis de zona capilar para la evaluación de la heterogeneidad fisicoquímica intrínseca de los anticuerpos monoclonales como un atributo de calidad.

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Desarrollo y validación de una sola molécula ultrasensible matriz Digital análisis de enzima-ligado del inmunosorbente para interferón-α humano

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