Estrategias para la optimización de la adquisición de datos de tomografía electrónica criogénica

La creciente demanda de recopilación de datos a gran escala en la tomografía electrónica criogénica requiere rutinas de adquisición de imágenes de alto rendimiento. Aquí se describe un protocolo que implementa los desarrollos recientes de estrategias de adquisición avanzadas destinadas a maximizar la eficiencia del tiempo y el rendimiento de la recopilación de datos tomográficos.

La configuración de una sesión de recopilación de datos a gran escala es un procedimiento que consume mucho tiempo y que puede reducir considerablemente el tiempo restante del microscopio disponible para la adquisición de series de inclinación. Este método permite una configuración rápida de la adquisición automatizada de datos de tomografía a gran escala para maximizar la eficiencia del tiempo de los experimentos de tomografía que requieren una selección cuidadosa de los objetivos de adquisición. Comience abriendo una instancia de SerialEM ficticia.

Una vez que se asigne el primer cuadrado de cuadrícula, utilice la combinación de opciones del menú del navegador SerialEM para ver el montaje en la instancia ficticia de SerialEM. Haga doble clic en la ventana del navegador para abrir el mapa cuadrado de la cuadrícula. Busque en el mapa y utilice la opción de navegador SerialEM ficticio para agregar puntos para agregar puntos de adquisición de imágenes en el objetivo de interés.

Después de asignar los nuevos cuadrados, guarde el archivo del navegador y vuelva a combinar el navegador. Continúe hasta que se asigneen todos los cuadrados de la cuadrícula. De nuevo, combine el archivo de navegador con la instancia de SerialEM ficticia.

Ejecute el script de mapas virtuales Pi EM desde el menú SerialEM ficticio. Seleccione herramientas y seleccione mapas de anclaje virtuales. Esto puede llevar algún tiempo dependiendo del tamaño y la cantidad de los mapas cuadrados de cuadrícula, así como de la unión de los mapas de vista y vista previa.

Para garantizar el rendimiento adecuado del microscopio, utilice la misma configuración de aumento y tamaño de haz para la adquisición de datos en el siguiente orden. Ejecute la alineación sin coma serialEM mediante CTF. Inserte y centrar una apertura de objetivo.

Ejecute serialEM correct astigmatism por CTF y GIF quick tune. En SerialEM, abra el nuevo archivo de navegador. Deseleccione todos los puntos A.

Seleccione los primeros mapas de vista. Seleccione contraer. Haga clic en A dos veces y deseleccione contraer.

Seleccione la primera posición del mapa de vista. Pulse Mayús T, seleccione la última posición del mapa de visualización y pulse Mayús T de nuevo. Elija imágenes de un solo fotograma en las propiedades del archivo para abrir un cuadro de diálogo.

En el siguiente cuadro de diálogo de propiedades del archivo, seleccione los parámetros deseados de acuerdo con las necesidades de imagen y la configuración del instrumento. Cuando se le solicite, asigne un nombre con un número y haga clic en guardar. Configure el controlador de la serie de inclinación para la primera posición de TS.

Cuando haya terminado, haga clic en Aceptar para establecer estos parámetros para todas las series de inclinación después de este elemento de adquisición. Todos los mapas de vista previa ahora se seleccionan como TS con un nombre de archivo numerado. Si es necesario, establezca la distancia de enfoque / pista para cada objetivo.

Haga doble clic en el mapa de vista para cargarlo. Seleccione el mapa de vista previa en la lista de navegadores. A continuación, seleccione editar enfoque en la ventana del navegador.

En el panel de control de dosis baja, deseleccione girar el eje entre áreas para colocar la prueba y enfocar a lo largo del eje de inclinación del escenario. Haga clic en la región deseada en el mapa de vista cargado para establecer la posición de prueba de enfoque para esta serie de inclinación y asegurarse de que el elemento del navegador tenga TSP establecido. Repita el procedimiento para todos los elementos.

Edite el rango de enfoque en el script PreTomo que se ejecuta antes de cada serie de inclinación. En el menú Serie de inclinación de SerialEM, compruebe ejecutar script en TS y seleccione el número de script de DuringTomo durante cada inclinación. Compruebe el nivel del tanque de nitrógeno y si el turbo de la cargadora automática está seleccionado.

Compruebe el espacio libre de almacenamiento de datos. En el menú Archivo SerialEM, anule la selección del guardado continuo para el archivo de registro. Cada serie de inclinación obtendrá su propio archivo de registro.

Después de hacer clic en adquirir en los elementos del menú de navegación, ejecute el script PreTomo. Seleccione la tarea principal adquirir serie de inclinación y, a continuación, seleccione ejecutar script después de PostTomo. Seleccione cerrar válvulas de columna al final y enviar correo electrónico al final, luego haga clic en ir.

Se seleccionaron 71 cuadrados adecuados en el mapa de cuadrícula con un aumento más bajo. Se adquirieron mapas de aumento medio con configuraciones que permiten la visualización directa e identificación de la muestra de interés, coronavirus en este caso. El tiempo de adquisición fue de tres minutos por cuadrado, tres horas y 45 minutos en total.

Cuando se creó el primer mapa cuadrado, se abrió una instancia ficticia de SerialEM en una computadora separada para visualizar el mapa cuadrado y agregar puntos en objetivos adecuados para la adquisición de series de inclinación. Se configuró SerialEM low dose y se tomaron imágenes de vista de referencia y vista previa y se guardaron como mapas. Estos últimos mapas podrían usarse inmediatamente en la instancia ficticia de SerialEM para generar la vista virtual y la vista previa virtual a partir de las imágenes de mapa cuadrado correspondientes.

Los mapas de vista virtual se utilizaron para un centrado inicial del objetivo, seguido de un centrado final realizado en la ampliación de adquisición de la serie de inclinación real utilizando el mapa de vista previa virtual. Los usuarios deben darse suficiente tiempo para explorar el paisaje de muestra. Después de haber buscado en algunos mapas, uno desarrolla una mejor sensación de áreas de buena calidad para recopilar datos.