Un método de cuantificación sensible y específica para la determinación de suero miosina cardíaca proteína de unión-C por inmunoensayo electroquimioluminiscencia

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar simultáneamente la proteína C de unión a miosina cardíaca y la troponina I cardíaca en muestras de suero. Esto se logra recubriendo primero una placa de 96 pocillos con un anticuerpo C de proteína C de unión a miosina cardíaca para un ensayo plex, o mediante el uso de un ensayo triple precodificado. En el segundo paso, las placas recubiertas se incuban con calibradores y muestras de suero.

A continuación, se añaden anticuerpos de detección marcados en el paso final, se produce una señal de quimioluminiscencia que es detectada por el lector de placas. En última instancia, los niveles de las proteínas cardíacas de interés presentes en las muestras de suero pueden determinarse mediante inmunoensayos únicos o múltiples. El día antes del experimento, pipeteó 30 microlitros de anticuerpo C anti proteína C de unión a miosina monoclonal de ratón sin gelatina en la esquina inferior de cada pocillo de una placa estándar desnuda de descubrimiento a escala miso de 96 pocillos.

A continuación, golpee los lados de la placa para esparcir la solución de anticuerpos sobre el fondo de cada pocillo. Después de sellar, incube la placa durante la noche a cuatro grados centígrados sin agitar. A la mañana siguiente, golpea la solución sobre un fregadero y luego sobre una pila de toallas de papel.

A continuación, añada 150 microlitros de 1% de bloqueador A en PBS a cada pocillo para bloquear la unión inespecífica. Incubar la placa sellada durante una hora a temperatura ambiente mientras se agita a 700 RPM durante el paso de bloqueo, diluir el fragmento de proteína C de unión a miosina cardíaca recombinante a una concentración inicial de 2000 nanogramos por mililitro en el bloqueador A al 1% en PBS. A continuación, diluya en serie esta solución por un factor de cinco para un total de siete estándares.

Ahora retire la solución de bloqueo como se acaba de demostrar, y luego lave la placa tres veces con 150 microlitros de 0.05% entre 20 en PBS. Después del tercer lavado, golpee vigorosamente el plato sobre un fregadero y luego golpee firmemente el plato con una capa de toallas de papel hasta que esté completamente seco. A continuación, pipetee 25 microlitros de cada patrón y tome la muestra en los pocillos adecuados.

Luego, mientras la placa sellada se incuba en el agitador durante una hora a temperatura ambiente, diluya el anticuerpo de detección de proteína C de unión a miosina cardíaca hecho a medida marcado con sul oag a un microgramo por mililitro en el bloqueador A al 1% en PBS. Después de lavar cuidadosamente la placa como se acaba de demostrar, agregue 25 microlitros de solución de anticuerpos de detección a cada pocillo y luego incube la placa sellada durante una hora a temperatura ambiente mientras agita durante el período de incubación, ejecute la placa de demostración con luces LED para garantizar el funcionamiento adecuado del generador de imágenes y el software del sector, diluya el Reid Buffer también en este momento. Después de lavar cuidadosamente la placa como se demostró anteriormente, use una pipeta multicanal para agregar 150 microlitros de tampón Reid a cada pocillo, teniendo cuidado de evitar burbujas de aire, y luego escanee inmediatamente la placa en el generador de imágenes del sector antes de comenzar el ensayo de tres dimensiones.

Permita que la placa triple de 96 pocillos y las soluciones diluyentes se equilibren a temperatura ambiente. Luego agregue 25 microlitros de bloqueador A al 1% en PBS a la placa, asegurándose de que todo el pocillo esté cubierto por solución e incube la placa sellada a temperatura ambiente durante 30 minutos mientras agita. Mientras tanto, diluya la proteína de unión a miosina cardíaca recombinante C-C-K-M-B y la troponina I cardíaca juntas en el bloqueador A al 1% en PBS para crear un estándar que contenga 2000 nanogramos por mililitro de proteína C de unión a miosina cardíaca, 100 nanogramos por mililitro de CKMB y 25 nanogramos por mililitro de troponina cardíaca.

A continuación, diluyo en serie esta mezcla por un factor de cinco hasta un volumen final de al menos 100 microlitros por cada muestra estándar diluida dos veces con un bloqueador A al 1% en PBS. A continuación, agregue 2 réplicas técnicas de 25 microlitros de los estándares, así como las muestras a los 25 microlitros de tampón de bloqueo ya presentes en los pocillos de la placa de tres plex, incluya un blanco de diluyente solo después de incubar la placa sellada mientras agita, diluya los tres anticuerpos de detección de SUL oag juntos hasta una concentración final de un microgramo por mililitro cada uno en el bloqueador de solución al 1% A y PBS después de dos horas. Lave la placa como se acaba de demostrar y, a continuación, utilice una pipeta multicanal para añadir 25 microlitros de solución de anticuerpos de detección a cada una.

Incubar bien la placa sellada durante una hora mientras se agita a 700 RPM durante el período de incubación. Ejecute la placa de demostración y diluya el búfer Reid como se acaba de demostrar. A continuación, después de lavar la placa con 0,05%tween 20 en PBS, utilice la pipeta multicanal para añadir 150 microlitros de Reid Buffer a cada pocillo evitando las burbujas de aire y escanee inmediatamente la placa en el generador de imágenes del sector.

En esta figura, se compara la curva estándar de la proteína C de unión a miosina cardíaca en el ensayo de plex con la de la proteína C de unión a miosina cardíaca en el ensayo de tres plex. Ambos ensayos muestran una sensibilidad muy alta y un alto rango dinámico. El área de detección del ensayo se muestra en gris, tanto plex como tres plex.

Las curvas estándar de la proteína C de unión a miosina cardíaca son similares. El límite inferior de detección, el límite inferior de cuantificación y el límite superior de niveles de cuantificación son comparables tanto en los ensayos plex como en los triples. Estos gráficos muestran las curvas estándar de troponina I cardíaca y CKMB de la placa triplex.

Ambos calibradores mostraron una alta sensibilidad y un gran rango dinámico. El área de detección del ensayo se muestra en gris. La reactividad cruzada de los anticuerpos de detección con los otros dos calibradores se estudió incubando las curvas estándar individuales de los tres calibradores con anticuerpos de detección única, solo se observó una baja cantidad de reactividad cruzada entre el calibrador CKMB y los anticuerpos de detección de troponina I cardíaca y proteína C de unión a miosina cardíaca.

Si bien no se observó reactividad cruzada entre los otros calibradores y los anticuerpos de detección como prueba de la aplicabilidad del ensayo para la detección de lesiones cardíacas, los niveles séricos de 16 sujetos con infarto de miocardio se compararon con un grupo de control que utilizó los tres niveles séricos de placa compleja de proteína de unión a miosina cardíaca C-C-K-M-B y troponina cardíaca. Se determinó que los tres biomarcadores estaban aumentados en los pacientes con infarto de miocardio en comparación con el grupo control.