Modelos Experimentales para Estudiar la Neuroprotección del Acondicionamiento Acido Contra la Isquemia Cerebral
31 de julio de 2017
El postcondicionamiento ácido protege contra la isquemia cerebral. Aquí presentamos dos modelos para ejecutar APC. Se consiguen respectivamente transfiriendo rebanadas corticostriatales a un tampón ácido después de la privación de oxígeno-glucosa in vitro e inhalando 20% de CO 2 después de la oclusión de la arteria cerebral media in vivo .
El objetivo general del tratamiento de la acidosis en un modelo de corte corticoestriado en un modelo de oclusión de la arteria cerebral media es estudiar el efecto neuroprotector del postcondicionamiento ácido frente a la isquemia cerebral. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo el postacondicionamiento de la acidosis puede proteger la lesión cerebral isquémica y a desarrollar una nueva estrategia para el tratamiento del accidente cerebrovascular. La principal ventaja de esta técnica es poder utilizar modelos experimentales ampliamente disponibles para estudiar la neuroprotección de la acidosis después del condicionamiento.
El encargado de demostrar el procedimiento será Yarong Zheng, un estudiante graduado de mi laboratorio. Comience extrayendo el cerebro del cráneo de un ratón decapitado con una espátula delgada y dejándolo caer cuidadosamente en un vaso de precipitados que contenga ACSF regular helado equilibrado con un cinco por ciento de dióxido de carbono y un 95 por ciento de oxígeno. Aplique pegamento crioprecipitado a la placa de vibratono en dos tiras.
Coloque un trozo de agarosa al tres por ciento en la tira de pegamento más alejada de la cuchilla para sostener el cerebro. Luego, use fórceps para transferir el cerebro al papel de filtro. Corta el polo frontal y el cerebelo con una cuchilla.
Coloque el tejido cerebral verticalmente sobre la tira libre de pegamento con el cerebro apoyado contra la agarosa. Agregue ACSF helado al depósito de corte para sumergir el cerebro y agregue hielo al área del soporte de hielo. Mantenga el ACSF en el depósito con un cinco por ciento de dióxido de carbono y un 95 por ciento de oxígeno.
Después de configurar el vibratono para cortar secciones de 400 micras y colocar correctamente el cerebro en relación con la cuchilla de corte, presione el botón de inicio-parada para iniciar el corte automático. Utilice una pipeta Pasteur con una punta cortada para transferir cinco rebanadas de cerebro, una por una, y colóquelas en el soporte de pañuelos en ACSF regular helada con un cinco por ciento de dióxido de carbono y un 95 por ciento de oxígeno. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, coloque las rodajas de cerebro en un baño de agua a 37 grados centígrados durante diez minutos para recuperar la función sináptica.
Coloque el ACSF libre de glucosa y el ACSF ácido en el baño de agua a 37 grados centígrados y burbujee las soluciones con cinco por ciento de dióxido de carbono y 95% de nitrógeno y 20 por ciento de dióxido de carbono y 80% de oxígeno respectivamente durante 30 minutos. Transfiera con cuidado cuatro de las cinco rebanadas de cerebro a un ACSF precalentado a 37 grados centígrados, sin glucosa, e incube durante 15 minutos. Para estudiar la ventana de tiempo para el preacondicionamiento ácido, transfiera una rebanada directamente de ACSF libre de glucosa a ACSF ácida y transfiera las otras tres rebanadas a ACSF regular para su reperfusión.
Después de tres minutos, transfiera la rebanada en ACSF ácido a ACSF normal. Luego, después de cinco minutos en ACSF regular, transfiera una de las rebanadas de ACSF regular al soporte de pañuelos en ACSF ácido durante tres minutos. Transfiera otra rebanada de la misma manera 15 minutos después de la reperfusión.
El corte restante que se colocó en ACSF libre de glucosa pero no ACSF ácido se establece como el grupo de privación de oxígeno y glucosa. Transfiera las rodajas del ACSF a los pocillos de una placa de 24 pocillos que contenga solución de TTC. Estira la rebanada en la solución.
Y luego incubar a 37 grados centígrados en un baño de agua poco profunda durante 30 minutos. A continuación, transfiera las rodajas a tubos de centrífuga limpios y pesados de 1,5 mililitros cubiertos con papel de aluminio y mida el peso seco de las rodajas. Después del pesaje, extraiga Formazano agregando una solución uno a uno de etanol y dimetilsulfóxido a los tubos en una proporción de volumen a peso de 10 a uno.
Incubar lejos de la luz durante 24 horas. Al día siguiente, transfiera la solución de etanol dimetilsulfóxido de los tubos a una placa de 96 pocillos y mida la absorbancia a 490 nanómetros utilizando un lector de placas. Primero confirme la anestesia adecuada por la ausencia de un reflejo de pellizco del dedo del pie.
A continuación, coloque el ratón anestesiado con sonda LDF adherida a su cráneo en posición supina y fíjelo con hilos de algodón estériles. Desinfectar la piel afeitada del cuello con alcohol etílico al 75%. Luego, después de hacer una incisión cutánea perimediana en el cuello, diseccione los tejidos blandos con pinzas para exponer los vasos sanguíneos.
Añade una gota de solución salina a los tejidos expuestos para mantenerlos hidratados. A continuación, utilice pinzas oftálmicas para diseccionar la arteria carótida común del tejido circundante y el nervio vago. Tenga cuidado de no dañar el nervio vago.
Coloque una pinza de microvasos en el extremo distal de la arteria carótida común. Y haz un nudo muerto con suturas de seda 6-0 en el extremo proximal. A continuación, haz un nudo suelto proximal a la pinza como sutura temporal.
A continuación, utilice unas tijeras microoftálmicas para hacer una pequeña incisión longitudinal entre los dos nudos lo más cerca posible del nudo muerto. Ahora inserte un monofilamento romo de 12 milímetros con punta a través de la incisión en la luz de la arteria y avancelo unos milímetros. Apriete el nudo suelto alrededor de la punta del monofilamento y luego retire la abrazadera.
A continuación, utilice pinzas oftálmicas para hacer avanzar el filamento hacia la arteria carótida interna hasta que el software LDF muestre una disminución brusca del flujo sanguíneo. Registre la hora de inicio de la oclusión. A continuación, corte la sonda LDF y coloque el ratón en una incubadora a 30 grados centígrados durante una hora de oclusión.
55 minutos después del inicio de la oclusión, vuelva a anestesiar al animal con isoflurano y coloque al animal como antes. A continuación, abra la incisión en el cuello y vuelva a exponer la arteria carótida común. Después del período de oclusión, use pinzas oftálmicas para extraer suavemente el filamento para lograr la reperfusión.
A continuación, convierta la sutura temporal en permanente apretando el nudo. Para el tratamiento de la acidosis, cambie el gas inhalado por el cono de la nariz a 20% de dióxido de carbono, 20% de oxígeno y 60% de nitrógeno durante cinco minutos. Después de cerrar la incisión con una sutura quirúrgica interrumpida, coloque al ratón en una jaula calentada a 30 grados centígrados hasta que el ratón recupere la conciencia.
Este histograma muestra los resultados del ensayo TTC realizado en cortes corticales después de la privación de oxígeno, glucosa y postacondicionamiento ácido, como se muestra en este video. Tres minutos de tratamiento con acidosis fueron neuroprotectores si el tratamiento se inició inmediatamente o cinco minutos después de la privación de oxígeno y glucosa, pero no si los cortes se reperfundieron durante 15 minutos. Los ratones fueron sometidos a 60 minutos de oclusión de la arteria cerebral media y tratados inhalando dióxido de carbono al 20% durante cinco minutos a los cinco, 50 o 100 minutos después de la reperfusión.
El volumen del infarto se cuantificó mediante dos, tres, cinco tinciones con clorhidrato de trifeniltetrazolio 24 horas después de la reperfusión, como lo indican las líneas punteadas negras. Este histograma muestra el porcentaje de volumen de infarto para cada afección. La neuroprotección del postcondicionamiento ácido fue robusta incluso cuando el tiempo de inicio se retrasó a 50 minutos después de la reperfusión.
Sin embargo, el tratamiento con acidosis iniciado a los 100 minutos no bloqueó la lesión isquémica. Después de ver el video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar la neuroprotección del postcondicionamiento de la acidosis en el modelo OGD de cortes de cerebro y en el modelo MSO de ratones. Al intentar los procedimientos, es importante recordar que la extensión y la duración de la acidosis es muy importante para reproducir los efectos protectores.
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Resumen
Este estudio investiga los efectos neuroprotectores de la postcondicionamiento ácido (APC) frente a la isquemia cerebral utilizando dos modelos. El primer modelo consiste en transferir cortes corticoestriados a un tampón ácido tras la privación de oxígeno y glucosa in vitro, mientras que el segundo modelo emplea la inhalación de 20 % CO2 tras la oclusión de la arteria cerebral media in vivo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Terapia para el accidente cerebrovascular
- Neuroprotección
Antecedentes
- La postcondicionamiento ácido es un enfoque novedoso para proteger contra la lesión cerebral isquémica.
- Comprender los mecanismos del tratamiento con acidosis puede conducir a nuevas estrategias terapéuticas.
- El estudio utiliza modelos experimentales ampliamente disponibles para la investigación.
- Se abordan preguntas clave sobre los efectos neuroprotectores de la acidosis.
Objetivo del estudio
- Explorar cómo la postcondicionamiento ácido protege contra la isquemia cerebral.
- Desarrollar nuevas estrategias para la terapia del accidente cerebrovascular.
- Utilizar modelos experimentales para estudiar la neuroprotección.
Métodos Utilizados
- Modelo in vitro utilizando cortes corticoestriados.
- Modelo in vivo que implica la oclusión de la arteria cerebral media.
- Aplicación de tampón ácido e inhalación de CO2.
- Uso de cola de crioprecipitado en el montaje experimental.
Resultados principales
- Demostó los efectos neuroprotectores de la APC en ambos modelos.
- Proporcionó información sobre los mecanismos del tratamiento de la acidosis.
- Mostró la viabilidad de utilizar modelos experimentales comunes.
- Destacó las aplicaciones potenciales en la terapia del accidente cerebrovascular.
Conclusiones
- La postcondicionamiento ácido ofrece un enfoque prometedor para mitigar la lesión cerebral isquémica.
- Se justifica más investigación para comprender completamente sus mecanismos.
- Esta técnica podría conducir a avances en las estrategias de tratamiento del accidente cerebrovascular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La postcondicionamiento ácido (APC) ofrece un enfoque basado en mecanismos para evaluar estrategias neuroprotectoras en modelos de isquemia cerebral. Al aprovechar sistemas in vitro e in vivo ampliamente disponibles, el APC permite la validación temprana de dianas y la exploración de vías para fármacos contra el accidente cerebrovascular. Esto respalda la confianza predictiva en la identificación de compuestos prometedores mediante la vinculación de la protección mediada por acidosis con la reducción del infarto y los resultados de viabilidad tisular.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis terapéuticas sobre la neuroprotección mediada por acidosis en lesiones isquémicas.
- Valor operativo: Utiliza modelos de corteza-estriado y MCAO para validar la interacción con el objetivo y la reducción biológica de riesgos.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al vincular el momento de la APC con la reducción del volumen de infarto y la viabilidad del tejido.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para la selección de compuestos mediante paradigmas de deprivación de oxígeno y glucosa (OGD) y reperfusión.
- Valor operativo: Permite ensayos estandarizados y reproducibles utilizando tinción con TTC y cuantificación del peso seco.
- Escalabilidad: Permite la reutilización de la plataforma en modelos murinos in vivo e in vitro de cortes tisulares para obtener lecturas consistentes.
Investigación Translacional y Preclínica
- Valor científico: Demuestra la relevancia de la enfermedad mediante modelos de isquemia focal inducida por MCAO y OGD corticoestriatal.
- Valor operativo: Garantiza la continuidad traslacional desde mecanismos basados en cortes hasta resultados de infarto en animales completos.
- Reducción de riesgos: Aporta información para decisiones de avance o interrupción del estudio al mostrar que la eficacia de la APC depende del tiempo, con pérdida de protección tras un retraso de 100 minutos en la reapertura.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
APC se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos prometedores y la evaluación de la eficacia preclínica, proporcionando un método reproducible para evaluar candidatos neuroprotectores.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la acidosis como modulador post-isquémico de la evolución del infarto.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos basados en puntos finales (absorbancia de TTC, volumen del infarto) para la comparación de compuestos.
- Análisis: Permite la comparación estadística de la neuroprotección en diferentes ventanas temporales (reperfusión inmediata, a los 5 min, a los 15 min, a los 50 min, a los 100 min).
- Investigación Traducional: Conecta la protección en cortes in vitro con la reducción del infarto in vivo, apoyando el avance alineado con biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para evaluar diversos agentes neuroprotectores bajo condiciones isquémicas estandarizadas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona una reducción del riesgo mecanicista al aislar la acidosis como una variable protectora en la lesión por isquemia-reperfusión.
- Valor operativo: Utiliza modelos accesibles (cortes de ratón, MCAO) y reactivos estándar (ACSF, TTC, CO2) para garantizar la reproducibilidad.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al identificar intervenciones ineficaces desde una etapa temprana (por ejemplo, la APC a los 100 min no muestra protección).
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos basada en perfiles neuroprotectores sensibles al tiempo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cirugía murina, corte de tejido cerebral y protocolos de isquemia-reperfusión.
- Depende del control preciso de gases (20% CO2, equilibrio O2/N2) y soluciones reguladas por temperatura (baños de agua a 37°C).
- Necesita la estandarización del momento de la reperfusión y de la duración de la acidosis en los modelos in vitro e in vivo.
- Debe tener en cuenta la variabilidad en la tinción con TTC y en la cuantificación del infarto al comparar condiciones.
- Se limita a modelos de isquemia aguda; no se abordan en el material original las condiciones crónicas ni las enfermedades concomitantes.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacia
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Cortical Slice Preparation
2:43
Oxygen-glucose Deprivation and Acidic Postconditioning
4:03
Determination of Slice Viability
5:04
Middle Cerebral Artery Occlusion
7:22
Reperfusion and Acidic Postconditioning
8:16
Results: Acidic Preconditioning Protects Against Reperfusion Injury
9:32
Conclusion
