Name: Modelos Experimentales para Estudiar la Neuroprotección del Acondicionamiento Acido Contra la Isquemia Cerebral (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Aprende los modelos experimentales de acondicionamiento ácido para estudiar la neuroprotección contra la isquemia cerebral usando corticostriatales in vitro y oclusión de arteria cerebral media in vivo.

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Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81573406, 81373393, 81273506, 81221003, 81473186 y 81402907), la Fundación Provincial de Ciencias Naturales de Zhejiang (LR15H310001) y el Programa de Zhejiang Equipo Líder del Equipo de Innovación de C &amp; T (2011R50014).

Todos los experimentos fueron aprobados por y conducidos de acuerdo con las directrices éticas del Comité de Experimentación Animal de la Universidad de Zhejiang y estaban en completo cumplimiento con los Institutos Nacionales de Guía de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Se hicieron esfuerzos para minimizar cualquier dolor o incomodidad, y se utilizó el número mínimo de animales. 1. OGD de cortes de Corticostriatal <ol><li> Preparación de la solución: <ol><li> Preparar 1.000 ml r-ACSF (124 mmol / L, NaCl, 5 mmol / L de KCl, 1,25 mmol / L KH 2 PO 4, 2 mmol / L MgSO 4, 26 mmol / L de NaHCO3, 2 mmol / L de CaCl2, 10 mmol / l de glucosa, pH final 7,4). Burbuja con 5% de CO 2 y 95% de O 2 durante todo el experimento. </li><li> Preparar 200 ml ACSF libre de glucosa (gf-ACSF) que el anterior pero con exclusión de la glucosa, burbujeado con 5% de CO2 y 95% de N2. Burbuja de los gases durante 30 min antes de aplicar a brAin para reducir el contenido de oxígeno en la solución. Continúe burbujeando hasta que finalice el procedimiento de OGD. </li><li> Preparar ACSF acídico (a-ACSF) equilibrando 200 ml de r-ACSF con 20% de CO 2 y 80% de O 2 . Burbujear los gases durante 30 minutos antes de aplicar a las rebanadas del cerebro para reducir el pH de la solución a pH 6,8 y continuar burbujeando hasta que el procedimiento APC esté terminado. </li><li> Colocar tres porta-tejidos en r-ACSF, gf-ACSF, a-ACSF, respectivamente. </li></ol></li><li> Preparación de la rebanada cerebral: Nota: Se utilizaron ratones C57B1 / 6J machos de 8 semanas de edad en este estudio. Los animales se alojaron bajo temperatura controlada (22 ± 2 ° C), con un período de 12 h luz-oscuridad ciclo y acceso a alimentos en pellets y agua. <ol><li> Sacrificar un ratón con una sobredosis de isoflurano en una cámara de inducción. Decapitar el ratón. Disecar el cerebro con pequeñas tijeras y fórceps. Quitar el cerebro con una espátula delgada y dejar caer con cuidado en un vaso de vidrio conR-ACSF fría en hielo equilibrada con 5% de CO 2 y 95% de O 2 . NOTA: Estos pasos deben hacerse lo más rápido pero meticulosamente posible. </li><li> Mantenga el cerebro en el r-ACSF frío durante 5 min. Ajuste la presión del gas para evitar movimientos del cerebro. </li><li> Coloque el pegamento de crioprecipitado en la placa de vibratomo en dos tiras. Ponga un pedazo de agarosa al 3% sobre la tira de pegamento lejos de la cuchilla para sostener el cerebro. </li><li> Invertir una placa de Petri de 10 cm sobre hielo y luego poner un papel de filtro en el plato. Humedezca el papel de filtro con gotas de r-ACSF helado. </li><li> Transferir el cerebro al papel de filtro con fórceps. Cortar el polo frontal y el cerebelo con cuchilla y fórceps. NOTA: Las secciones transversales deben ser lo más lisas posible y vertical a plano sagital. </li><li> Coloque el resto del tejido cerebral verticalmente sobre la otra tira de pegamento y mantener el cerebro apoyado contra la agarosa. Agregue r-ACSF helado al depósito de corte paraSumerja el cerebro y agregue hielo al área del soporte de hielo. Mantenga el r-ACSF en el depósito burbujeado con 5% de CO 2 y 95% de O 2 . </li><li> Levante el depósito y ajuste la posición de la afeitadora para colocar la afeitadora tan cerca del cerebro como sea posible y justo por encima del cerebro. </li><li> Elija el modo &quot;CONT&quot; para dividir las secciones cerebrales continuamente. Ajuste el grosor de corte a 400 μm, la frecuencia de vibración a 6 - 8 y la velocidad a 3 - 4. Pulse el botón &quot;start / stop&quot; para iniciar el corte automático. </li><li> Cortar la punta de una pipeta Pasteur de 3 ml para hacer una abertura que coincida con el tamaño de las rodajas de cerebro. NOTA: La abertura debe ser lo suficientemente grande para evitar daños adicionales a las rodajas del cerebro. </li><li> Dibuje cinco rebanadas de cerebro una a una con la pipeta de punta de Pasteur y colóquelas en el soporte de tejido en r-ACSF helada burbujeando con 5% de CO 2 y 95% de O 2 . No recoja la primera rebanada producida. Ajustar la presión del gas para avoiD movimientos de las rodajas de cerebro. NOTA: Las rodajas de cerebro no deben cubrirse entre sí. </li><li> Colocar las rodajas de cerebro con r-ACSF a temperatura ambiente durante 30 min y luego a 37 ° C en un baño de agua durante otros 10 min para recuperar las funciones sinápticas. </li></ol></li><li> OGD y APC: <ol><li> Colocar gf-ACSF y a-ACSF en un baño de agua a 37 ° C y burbujear los tampones con los gases correspondientes como se mencionó anteriormente en 1.1.2 y 1.1.3 durante 30 min. </li><li> Deje una porción en r-ACSF como un control. Transferir las otras cuatro rodajas de cerebro en el soporte de tejido con gf-ACSF precalentada cuidadosamente e incubar durante 15 min. Transferir las rodajas de nuevo en el titular del tejido en r-ACSF para lograr la reperfusión. </li><li> Para estudiar la ventana de tiempo de APC, transfiera una porción directamente de gf-ACSF a-ACSF. Transferir los otros tres cortes a r-ACSF en un primer momento, y luego transferir dos de ellos al titular del tejido en un ACSF-5 y 15 minutos después de la reperfusión, respectivamente. </li><li> IncubatE los dos cortes en a-ACSF durante 3 min y luego transferirlos de nuevo a r-ACSF. Incubar las tres rebanadas en r-ACSF durante 1 h más. Establezca las rebanadas restantes en r-ACSF como el grupo OGD. </li><li> Para un estudio de respuesta a la dosis, transfiera los cuatro cortes al soporte de tejido en r-ACSF al principio después de OGD e incube durante 5 min. Luego deje una porción en r-ACSF como grupo OGD y transfiera los otros tres cortes a-ACSF. Incubar las rodajas en a-ACSF durante 1, 3 y 5 min, respectivamente, y luego transferirlos de nuevo a r-ACSF. Incubar las tres rebanadas en r-ACSF durante 1 h más. </li></ol></li><li> Determinación de la viabilidad de la rebanada: <ol><li> Preparar una solución salina normal 0,25% de clorhidrato de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC). Añadir 1,25 g de polvo de TTC a 500 ml de solución salina normal. NOTA: Después de que el polvo se disuelva por completo, transfiera la solución en una placa de 24 pocillos (500 μL por pocillo) cubierta en papel de aluminio y guárdela a 4 ° C. TTC y tejido teñido con TTC son sen luzSión. </li><li> Transfiera las rebanadas en una placa de 24 pocillos (una rebanada por pocillo) que contenga la solución de TTC y extienda la rebanada en la solución. Incubar las rebanadas en solución de TTC a 37 ° C en un baño de agua poco profunda durante 30 min. </li><li> Transfiera las rebanadas en tubos de centrífuga limpios de 1,5 ml cubiertos de papel de aluminio y mida el peso seco de las rebanadas. </li><li> Añadir etanol / dimetilsulfóxido (1: 1) en los tubos de centrífuga (v: w = 10: 1) para extraer el formazán. Incubar las rebanadas en etanol / sulfóxido de dimetilo a temperatura ambiente fuera de la luz durante 24 h. </li><li> Añadir todo el etanol / sulfóxido de dimetilo en los tubos en una placa de 96 pocillos y medir la absorbancia a 490 nm mediante un lector de placas. </li><li> Normalizar la absorbancia al peso seco de la rebanada y expresar la viabilidad como el porcentaje de la rebanada de control. </li></ol></li></ol> 2. MCAO <ol><li> Preparación: <ol><li> Desinfecte el banco de trabajo, la superficie del Doppler Laser FlowmetrY (LDF) y sus accesorios con alcohol etílico al 70%. </li><li> Preparar instrumentos autoclavados: dos tijeras, 10 cm; Dos fórceps, 10 cm; Una pinza oftálmica, 11 cm; Una micro tijeras oftálmicas, 9 cm; Una pinza de microvasos, 1,8 cm; Oneneedle unidad, r 12,5 cm; Varias suturas quirúrgicas (△ 1/2 4 × 10); cotonetes. </li><li> Prepare una jeringa (sin aguja) con solución salina para mantener un área de operación hidratada. </li><li> Preparar el gas de anestesia (100% O 2 + isoflurano). </li></ol></li><li> Detección del flujo sanguíneo cerebral: <ol><li> Configure el instrumento LDF. </li><li> Inyectar analgésicos intraperitonealmente en el ratón: metamizol 200 mg / kg, carprofeno 4 mg / kg y buprenorfina 0,1 mg / kg. </li><li> Coloque el ratón en una cámara de inducción con isoflurano al 4% en oxígeno para anestesiarlo hasta que se detenga el movimiento espontáneo del cuerpo y de las vibrissas. </li><li> Coloque el ratón en posición inclinada con la narizEl cono de la nariz y mantener el isoflurano al 1,5% para el procedimiento posterior. </li><li> Aplique ungüento para ojos dexpantenol en ambos ojos. </li><li> Desinfecte la cabeza con alcohol etílico al 70%. </li><li> Haga una incisión cutánea paramediana derecha entre los ojos y las orejas usando un bisturí para exponer el bregma. </li><li> Frote el cráneo con algodón estéril. </li><li> Aplique una a dos gotas de pegamento quirúrgico en la superficie del cráneo. </li><li> Coloque la punta de la sonda de fibra óptica 5 mm caudal al bregma y 6 mm lateral a la línea media. </li><li> Comience a grabar el flujo sanguíneo en el software del ordenador. Espere hasta que se produzca una línea de base estable del flujo sanguíneo y luego aplique un catalizador de 20 μl sobre el pegamento para fijar la sonda. NOTA: Una línea de base ideal debe ser más de 500 flujos. </li><li> Si la línea de base es inferior a 200 flujo, ajuste la posición finamente para obtener una línea de base adecuada. Mantenga la sonda unida al cráneo durante todo el experimento. </li><li> Desinfecte la cabeza con iodophor afDe la sonda de fibra óptica. </li></ol></li><li> MCAO: <ol><li> Colocar y fijar el ratón anestesiado (con sonda de LDF unida a su cráneo) en posición supina y mantener su temperatura corporal usando una lámpara de calor durante la cirugía. Desinfecte el cuello con alcohol etílico al 70%. </li><li> Haga una incisión en la piel del paramédico en el cuello usando un bisturí; Blunt diseccionar los tejidos blandos con fórceps para exponer los vasos. Añadir una gota de solución salina a los tejidos expuestos para mantenerlos hidratados. </li><li> Disecar la arteria carótida común del tejido circundante y el nervio vago usando fórceps oftálmicos. Tenga cuidado de no dañar el nervio vago. Desinfectar nuevamente la piel del cuello con iodóforo después de exponer la arteria carótida común. </li><li> Coloque una pinza de microvasos en el extremo distal de la arteria carótida común y luego ate un nudo muerto con suturas de seda 6-0 en el extremo proximal. Coloque la abrazadera lo más proximal posible para operaciones posteriores. Asegúrese de que la longitud deEl recipiente entre la abrazadera y el nudo muerto es lo más largo posible para las operaciones posteriores. </li><li> Hacer una sutura temporal proximal a la abrazadera atando un nudo suelto. Asegúrese de que hay suficiente espacio entre dos nudos para la inserción de monofilamento. </li><li> Hacer una pequeña incisión longitudinal entre los dos nudos con micro tijeras oftálmicas. Asegúrese de que la incisión esté tan cerca del nudo muerto como sea posible para operaciones posteriores. Tenga cuidado de no cortar el recipiente. </li><li> Insertar un monofilamento de 12 mm de punta en el borde de la incisión para entrar en el lumen de la arteria y avanzar unos pocos mm. Apriete el nudo suelto alrededor de la punta del monofilamento y luego retire la abrazadera. </li><li> Avance el filamento dentro de la arteria carótida interna (10 mm para ocluir la arteria cerebral media) con fórceps oftálmicos hasta que el software LDF muestre una disminución pronunciada (&gt; 80% de reducción del flujo sanguíneo basal) en el flujo sanguíneo. Registre el tiempo de inicio de la oclusión. NOTA: La configuración del instrumento LDFDescrito en la sección 2.2. </li><li> Ocultar la arteria cerebral media durante 1 h. Cortar la sonda LDF y poner los ratones en una incubadora de 30 ° C durante la duración de la oclusión. </li></ol></li><li> Reperfusión y APC: <ol><li> Reanestesiar los animales con isoflurano como se describe arriba 55 min después del tiempo de inicio de la oclusión. Colocar y fijar los ratones en posición supina. Abra la incisión del cuello y vuelva a exponer la arteria carótida común. </li><li> Retire suavemente el filamento con pinzas oftálmicas después del período de oclusión para lograr la reperfusión y convertir la sutura temporal en una permanente mediante el apriete del nudo. </li><li> Para el tratamiento de la acidosis, cambiar el gas inhalado por el cono de la nariz a los gases de mezcla que contienen 20% de CO 2 , 20% de O 2 y 60% de N 2 durante 5 min a 5, 50 o 100 min después de la reperfusión. Cierre la incisión con una sutura quirúrgica interrumpida. </li><li> Coloque los ratones en una jaula térmica de 30 ° C hasta que los ratones recuperen la concienciaY luego devolver los ratones a limpiar, jaulas individuales. Proporcionar ratones con una placa de Petri de agua y alimentos humedecidos. Vigilar a los ratones de cerca después de la cirugía por el dolor excesivo y la muerte. </li></ol></li><li> Medición del volumen del infarto cerebral: <ol><li> Medir el volumen de infarto cerebral mediante el uso de tinción TTC 24 h después de la reperfusión. </li><li> Preparar una solución de TTC al 0,25% como se mencionó en el paso 1.4.1 antes del tiempo de sacrificio designado. Transferir la solución en una placa de 24 pocillos (1 ml por pocillo) cubierta en papel de aluminio y almacenarla a 4 ° C. NOTA: El TTC y el tejido teñido con TTC son sensibles a la luz. </li><li> A las 24 h después de la reperfusión, sacrificar al animal con una sobredosis de isoflurano en una cámara de inducción. Decapitar los ratones. Disecar los cerebros con pequeñas tijeras y fórceps. Examinar los puntos de sangre en el cerebro para excluir a los ratones que se sometieron a hemorragia subaracnoidea en el Círculo de Willis. </li><li> Coloque el cerebro sobre una diapositiva de cristal limpia en un -20 °<html> C paquete de hielo. Coloque el cerebro y la diapositiva de cristal en un refrigerador de -20 ° C durante 5 minutos para hacer que el cerebro más fácil de rebanar. </li><li> Saque el cerebro y el portaobjetos de vidrio de -20 ° C y vuelva a colocarlos en el paquete de hielo de -20 ° C. Disecar el polo frontal y el cerebelo con cuchilla y fórceps. </li><li> Cortar las secciones del cerebro horizontalmente a un espesor de 1 mm con una hoja para producir 5 rebanadas. Transferir las rodajas en la placa de 24 pocillos que contiene solución TTC (1 rebanada por pocillo) con fórceps y estirar las rebanadas en la solución. Incubar las rebanadas en solución de TTC a 37 ° C en un baño de agua poco profunda durante 30 min. </li><li> Aspirar la solución TTC. Añadir formaldehído al 10% (1 ml por pocillo) e incubar a temperatura ambiente durante 30 min. Coloque las rebanadas en el orden en que fueron cortadas sobre una hoja de celofán y escanear los segmentos en la cámara de imágenes fotográficas. </li><li> Analizar el tamaño del infarto como un porcentaje de la porción entera del cerebro usando el software de análisis ImageJLass = &quot;xref&quot;&gt; 8 basado en la identificación visual; Véase la figura 2 (izquierda). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí presentamos dos modelos experimentales para estudiar la neuroprotección de APC contra la isquemia cerebral. En las rebanadas cerebrales, la APC se logra incubando ratones con rebanadas corticostriatales en tampón ácido burbujeado con 20% de CO 2 después del inicio de la reperfusión, mientras que en el modelo MCAO, la APC se consigue inhalando 20% de CO 2 a ratones después de la reperfusión. Ambos modelos reflejan la neuroprotección de APC contra la isquemia cerebral. La protección fue comparab...

El derrame cerebral es una de las principales causas de mortalidad e incapacidad en todo el mundo. Grandes esfuerzos se han hecho para encontrar tratamientos eficaces para el accidente cerebrovascular en las últimas décadas, sin embargo, el logro es bastante insatisfactorio. El postcondicionamiento es un proceso manipulado por tensiones subtóxicas después de un episodio isquémico. El postcondicionamiento, incluyendo la isquemia, la hipoxia, la baja glucosa y el postcondicionamiento isquémico remoto, desencadenan mecanismos adaptativos endógenos y han demostrado ser terapias prometedoras contra la isquemia cerebral 1 , 2 , 3 , 4 . Sin embargo, el postcondicionamiento isquémico puede introducir lesiones adicionales. El postcondicionamiento isquémico remoto de las extremidades suele necesitar varios ciclos de 5 a 20 min de oclusión y reperfusión en las extremidades posteriores ipsilaterales o bilaterales 5 , 6 , 7 . ThPor lo tanto, estas manipulaciones posteriores al acondicionamiento son peligrosas o poco prácticas en la práctica clínica. Para superar estos inconvenientes, hemos desarrollado APC como una terapia para la isquemia cerebral focal en ratones [ 8] . Inducido simplemente por la inhalación de 20% de CO 2 , APC reduce significativamente la lesión cerebral isquémica de una manera más factible y más segura. Recientemente hemos demostrado que APC extiende la ventana de reperfusión, destacando la importancia de APC para la terapia de accidente cerebrovascular [ 9] . Aquí presentamos dos modelos experimentales para estudiar la neuroprotección de APC contra la isquemia cerebral. El primero es el modelo de privación de oxígeno-glucosa (OGD) en rodajas corticostriatales de ratones. La rápida preparación y transferencia de los cortes cerebrales en un entorno artificial, usualmente el líquido cefalorraquídeo artificial (ASCF), puede mantener la viabilidad celular y los circuitos neuronales, lo que hace posible el estudio de la función cerebral in vitro 10 &lt;Sup&gt;, 11 . OGD en ASCF imita la isquemia cerebral e induce lesión isquémica [ 12 , 13 , 14] . Después de OGD, las rebanadas de cerebro se refrescan en ASCF regular (r-ASCF) para proporcionar reperfusión y luego se tratan con APC usando ácido ASCF burbujeado con 20% de CO 2 . La porción corticostriatal mantiene la caracterización histológica intacta en comparación con las células cultivadas primarias. Para estudiar la función cerebral in vivo , se emplea el modelo de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) del ratón. La arteria cerebral media se bloquea insertando un monofilamento amortiguado por la llama a través de la arteria carótida común. Como uno de los modelos de accidente cerebrovascular más ampliamente utilizados, el modelo MCAO muestra relevancia clínica y la aplicación de un monofilamento facilita la reperfusión. Simplemente mediante la inhalación de gases mezclados normoxic que contienen 20% de CO 2 después del inicio del reperfusioN, la APC mostró efectos protectores significativos contra la isquemia cerebral indicada por volúmenes reducidos de infarto cerebral.

<table><tbody><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Vibratomo</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de 2,3,5-trifeniltetrazolio</td><td>Sigma</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Aladdin Industrial Corporation</td><td>E111993</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Sigma</td><td></td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Láser Doppler Flowmetry Moor</td><td> Instruments Ltd</td><td>Modelo Moor VMS-LDF2</td><td></td></tr><tr><td>Éter dietílico anhidro</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Corporation</td><td>80059618</td><td></td></tr><tr><td>hidrato de tricloroacetaldehíclido</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Corporation</td><td>30037517</td><td></td></tr><tr><td>10% de formalina</td><td>Aladdin Industrial Corporation</td><td>F111936</td><td></td></tr><tr><td>placas de 24 pocillos</td><td>Jet Biofil</td><td>TCP-010-024</td><td></td></tr></tbody></table>

modelos experimentales para estudiar la neuroprotección del acondicionamiento acido contra la isquemia cerebral

Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia

El accidente cerebrovascular es una de las principales causas de mortalidad e incapacidad en todo el mundo, con enfoques terapéuticos limitados. Como estrategia endógena para la neuroprotección, los tratamientos post-acondicionamiento han demostrado ser terapias prometedoras contra la isquemia cerebral. Sin embargo, procedimientos complicados y posibles problemas de seguridad limitan su aplicación clínica. Para superar estos inconvenientes, hemos desarrollado postcondicionamiento ácido (APC) como terapia para la isquemia cerebral focal experimental. APC se refiere al tratamiento de acidosis leve inhalando CO 2 durante la reperfusión después de la isquemia. Aquí presentamos dos modelos para ejecutar APC in vitro e in vivo , respectivamente. El tratamiento de privación de oxígeno-glucosa (OGD) de ratones y la oclusión corticostriatal y oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) de ratones se emplearon para imitar la isquemia cerebral. APC se puede lograr simplemente transfiriendo las rebanadas de cerebro a un tampón ácido burbujeado con 20% de CO 2 , or por los ratones inhalan 20% de CO2. La APC mostró efectos protectores significativos contra la isquemia cerebral, como se refleja en la viabilidad de los tejidos y en el volumen del infarto cerebral.

En el modelo de corte corticostriatal descrito anteriormente, la viabilidad de la corteza corticostriatal se cuantificó por ensayo de TTC a 1 h después de la reperfusión. La conversión de TTC se calculó normalizando la absorción a 490 nm a la porción de control. De acuerdo con la conversión de TTC, APC protegido contra OGD inducida por lesión de reperfusión en un tiempo de inicio y la duración dependiente de manera. En detalle, tanto 1 y 3 min de tratamiento de la acidosis mejoró signifi...

El postcondicionamiento ácido protege contra la isquemia cerebral. Aquí presentamos dos modelos para ejecutar APC. Se consiguen respectivamente transfiriendo rebanadas corticostriatales a un tampón ácido después de la privación de oxígeno-glucosa in vitro e inhalando 20% de CO 2 después de la oclusión de la arteria cerebral media in vivo .

Modelos Experimentales para Estudiar la Neuroprotección del Acondicionamiento Acido Contra la Isquemia Cerebral

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for ...

El objetivo general del tratamiento de la acidosis en un modelo de corteza estriatal en un modelo de oclusión de la arteria cerebral media es estudiar el efecto neuroprotector de la postcondicionamiento ácido frente a la isquemia cerebral. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo el postcondicionamiento por acidosis podría proteger contra la lesión cerebral isquémica y a desarrollar nuevas estrategias para la terapia del accidente cerebrovascular. La principal ventaja de esta técnica es la posibilidad de utilizar modelos experimentales ampliamente disponibles para estudiar la neuroprotección mediante el postcondicionamiento ácido.La persona que demostrará el procedimiento será Yarong Zheng, una estudiante de posgrado de mi laboratorio. Comience por extraer el cerebro del cráneo de un ratón decapitado usando una espátula delgada y colóquelo cuidadosamente en un vaso de precipitados que contenga ACSF normal frío con hielo, equilibrado con cinco por ciento de dióxido de carbono y 95 % de oxígeno. Aplique cola de crioprecipitado sobre la placa del vibrátomo en dos tiras.Coloque un trozo de agarosa al tres por ciento sobre la tira de pegamento más alejada del filo para soportar el cerebro. Luego, use pinzas para transferir el cerebro al papel de filtro. Corte el polo frontal y el cerebelo con una hoja.Coloque el tejido cerebral verticalmente sobre la tira libre de pegamento con el cerebro apoyado contra el agarosa. Añada ACSF frío con hielo al depósito de corte para sumergir el cerebro y agregue hielo al área del portahielos. Mantenga el ACSF en el depósito burbujeado con cinco por ciento de dióxido de carbono y 95 % de oxígeno.Después de configurar el vibrátomo para cortar secciones de 400 micrones y posicionar correctamente el cerebro con respecto a la cuchilla de corte, presione el botón de inicio-detención para comenzar el corte automático. Utilice una pipeta Pasteur con la punta cortada para transferir cinco secciones cerebrales una por una y colóquelas en el portamuestras sumergido en ACSF normal frío con hielo, burbujeado con cinco por ciento de dióxido de carbono y 95 % de oxígeno. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, coloque las secciones cerebrales en un baño de agua a 37 grados Celsius durante diez minutos para recuperar la función sináptica.Coloque ACSF sin glucosa y ACSF ácido en el baño de agua a 37 grados Celsius y burbujee las soluciones con cinco por ciento de dióxido de carbono y 95 % de nitrógeno, y 20 % de dióxido de carbono y 80 % de oxígeno, respectivamente, durante 30 minutos. Transfiera cuidadosamente cuatro de los cinco cortes cerebrales a ACSF sin glucosa precalentado a 37 grados Celsius e incube durante 15 minutos. Para estudiar la ventana temporal del acondicionamiento ácido, transfiera un corte directamente de ACSF sin glucosa a ACSF ácido y transfiera los otros tres cortes a ACSF normal para la reperfusión.Después de tres minutos, transfiera la sección de tejido del ACSF ácido al ACSF normal. Luego, después de cinco minutos en ACSF normal, transfiera una de las secciones del ACSF normal al portamuestras de tejido en ACSF ácido durante tres minutos. Transfiera otra sección de la misma manera 15 minutos después de la reperfusión.La rebanada restante que se colocó en ACSF sin glucosa pero no en ACSF ácido se establece como el grupo de privación de oxígeno y glucosa. Transfiera las rebanadas desde el ACSF a los pocillos de una placa de 24 pocillos que contenga solución de TTC. Extienda la rebanada en la solución.A continuación, incubar a 37 grados Celsius en un baño de agua poco profundo durante 30 minutos. Luego, transferir las secciones a tubos cónicos limpios y pesados de 1,5 mililitros cubiertos con papel de aluminio y medir el peso seco de las secciones. Después de pesar, extraer la formazán añadiendo a los tubos una solución uno a uno de etanol y dimetilsulfóxido en una proporción volumen a peso de 10 a 1.Incubar al abrigo de la luz durante 24 horas. Al día siguiente, transferir la solución de etanol y dimetilsulfóxido de los tubos a una placa de 96 pocillos y medir la absorbancia a 490 nanómetros utilizando un lector de placas. Primero, confirmar la anestesia adecuada mediante la ausencia del reflejo al pellizco del dedo del pie.Luego, coloque el ratón anestesiado con la sonda de LDF fijada al cráneo en posición supina y sujételo utilizando hilos de algodón estériles. Desinfecte la piel afeitada del cuello con alcohol etílico al 75 %. A continuación, realice una incisión cutánea perimediana en el cuello y, mediante disección roma con pinzas, separe los tejidos blandos para exponer los vasos sanguíneos.Agregue una gota de solución salina a los tejidos expuestos para mantenerlos hidratados. A continuación, use fórceps oftálmicos para diseccionar la arteria carótida común del tejido circundante y del nervio vago. Tenga cuidado de no dañar el nervio vago.Coloque una pinza microvascular en el extremo distal de la arteria carótida común. Y ate un nudo muerto con suturas de seda 6-0 en el extremo proximal. Luego ate un nudo suelto proximal a la pinza como sutura temporal.A continuación, utilice tijeras microoftálmicas para realizar una pequeña incisión longitudinal entre los dos nudos, lo más cerca posible del nudo muerto. Ahora inserte un monofilamento de 12 milímetros con la punta embotada a través de la incisión dentro de la luz arterial y avance unos milímetros. Ajuste el nudo suelto alrededor de la punta del monofilamento y luego retire el clamp.Luego, utilice fórceps oftálmicos para avanzar el filamento hacia la arteria carótida interna hasta que el software de LDF muestre una disminución brusca del flujo sanguíneo. Registre la hora de inicio de la oclusión. A continuación, desconecte la sonda de LDF y coloque al ratón en un incubador a 30 grados Celsius durante la duración de una hora de la oclusión.55 minutos después del inicio de la oclusión, reanestesie al animal con isoflurano y coloque al animal como antes. A continuación, abra la incisión en el cuello y vuelva a exponer la arteria carótida común. Después del período de oclusión, use fórceps oftálmicos para extraer suavemente el filamento y lograr la reperfusión.Luego convierta la sutura temporal en permanente apretando el nudo. Para el tratamiento de la acidosis, cambie el gas inhalado por el cono nasal a 20% de dióxido de carbono, 20% de oxígeno y 60% de nitrógeno durante cinco minutos. Después de cerrar la incisión con una sutura quirúrgica interrumpida, coloque al ratón en una jaula calentada a 30 grados Celsius hasta que recupere la conciencia.Este histograma muestra los resultados del ensayo TTC realizado en cortes corticales tras la privación de oxígeno y glucosa y la postcondición ácida, tal como se demuestra en este video. Tres minutos de tratamiento con acidosis fueron neuroprotectores si el tratamiento se inició inmediatamente o cinco minutos después de la privación de oxígeno y glucosa, pero no si los cortes se reperfundieron durante 15 minutos. Los ratones fueron sometidos a 60 minutos de oclusión de la arteria cerebral media y tratados mediante inhalación de 20% de dióxido de carbono durante cinco minutos a los cinco, 50 o 100 minutos posteriores a la reperfusión.El volumen del infarto se cuantificó mediante tinción con clorhidrato de triptanotetrazolio realizada a las 2, 3 y 5 horas tras la reperfusión, según indican las líneas negras punteadas. Este histograma muestra el porcentaje de volumen de infarto para cada condición. La neuroprotección proporcionada por la postcondicionamiento ácido fue robusta incluso cuando el inicio se retrasó hasta 50 minutos después de la reperfusión.Sin embargo, el tratamiento de la acidosis iniciado a los 100 minutos no bloqueó la lesión isquémica. Después de ver el video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar la neuroprotección mediante la postcondición acidótica en el modelo de cortes cerebrales sometidos a privación de oxígeno y glucosa (OGD) y en el modelo de MSO de ratones. Al intentar realizar los procedimientos, es importante recordar que la extensión y la duración de la acidosis son muy importantes para reproducir los efectos protectores.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Tratamos de definir la señalización neuronal inmune responsable de frío preacondicionamiento como medio para identificar nuevas dianas para el desarrollo de terapias para proteger el cerebro antes del inicio de la lesión. Se presentan estrategias para el trabajo de tal manera que requieren los sistemas biológicos, además de las manipulaciones experimentales capacidades técnicas que son altamente reproducible y sensible.

Estrategias para el Estudio de la neuroprotección de frío preacondicionamiento

La arteria cerebral media (MCA) ligadura es una técnica para estudiar la isquemia cerebral focal en modelos animales. En este método, la arteria cerebral media se expone mediante craneotomía y se liga con cauterización. Este método da volumen del infarto altamente reproducible y el aumento de post-operatorio las tasas de supervivencia en comparación con otros métodos disponibles.

La aplicación de la Permanente Ligadura arteria cerebral media en el ratón

Hay evidencia acumulada, que el precondicionamiento isquémico (PC) - un reto isquémico no perjudicial para el cerebro - confiere una protección transitoria a una posterior lesión isquémica perjudicial. Hemos establecido oclusión de la arteria carótida común bilateral (BCCAO) como un estímulo para inducir la tolerancia de preacondicionamiento isquémico temprano (IT) de la isquemia cerebral focal transitoria (inducida por la oclusión de la arteria cerebral media, OACM) en ratones C57BL6 / J.

Bilateral Común oclusión de la arteria carótida como un estímulo de preacondicionamiento adecuado para inducir la tolerancia isquémica precoz de isquemia cerebral focal

Fuente: Zheng, Y., et al. Modelos experimentales para estudiar la neuroprotección del postcondicionamiento ácido contra la isquemia cerebral. J. Vis. Exp. (2017)Este video demuestra la aplicación del postacondicionamiento ácido (APC) para evaluar sus efectos neuroprotectores contra la lesión isquémica en un modelo de ratón de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO). Describe los pasos involucrados en la reperfusión en el modelo MCAO y la aplicación de APC durante la reperfusión para...

 Evaluación de los efectos neuroprotectores del postacondicionamiento ácido en un modelo de ratón de isquemia cerebral

Fuente: Brandli, A. Preacondicionamiento isquémico de extremidades remotas: una técnica neuroprotectora en roedores. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra un protocolo de preacondicionamiento isquémico no invasivo de extremidades en ratas para inducir neuroprotección sistémica. El procedimiento implica la oclusión arterial controlada y la reperfusión, lo que desencadena vías de estrés celular que liberan factores protectores. Estos factores aumentan la resistencia a las lesiones isquémicas y...

Preacondicionamiento isquémico no invasivo de extremidades en un modelo de rata para neuroprotección

Hemos desarrollado un modelo de cortes de cerebro que se puede utilizar para examinar los mecanismos moleculares implicados en la lesión cerebral excitotoxicidad mediada. Esta técnica genera tejido cerebral madura viable y reduce el número de animales necesarios para la experimentación, mientras que mantiene los circuitos neuronales, las interacciones celulares y compartimentos postsinápticos parcialmente intacta.

Excitotóxica Estimulación del cerebro Microslices como<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Carrera

Este protocolo describe el precondicionamiento hipóxico repetitivo, o exposiciones breves a la hipoxia sistémica que reducen los volúmenes de infarto y la interrupción de la barrera hematoencefálica después de una oclusión transitoria de la arteria cerebral media en ratones. También detalla la cuantificación dual del volumen del infarto y la alteración de la barrera hematoencefálica después de un accidente cerebrovascular para evaluar la eficacia de la protección neurovascular.

Cuantificación de Protección neurovascular Siguiendo repetitivo hipóxico Precondicionamiento y transitoria cerebral media oclusión de la arteria en ratones

Aquí presentamos un protocolo para inducir la depresión post-accidente cerebrovascular en ratas, ocluendo la arteria cerebral media a través de la arteria carótida interna. Usamos la prueba de natación forzada de Porsolt y la prueba de preferencia de sacarosa para confirmar y evaluar Estados de ánimo depresivos inducidos.

Una técnica de oclusión de la arteria cerebral media para inducir la depresión post-accidente cerebrovascular en ratas

El propósito de este estudio es establecer y validar un modelo animal para la investigación en las etapas de recuperación y secuenciación de la isquemia cerebral mediante la prueba de infarto cerebral y la función sensorimotor después de la oclusión/reperfusión de la arteria cerebral media (MCAO/R) después de 1-90 días en ratas.

Un modelo preclínico para evaluar la recuperación cerebral después de un accidente cerebrovascular agudo en ratas

Este protocolo describe el proceso para inducir un modelo de coma isquémico cerebral utilizando un método de oclusión modificado de cuatro vasos.

Modelo de coma isquémico cerebral inducido por oclusión modificada de cuatro vasos

Aprende los modelos experimentales de acondicionamiento ácido para estudiar la neuroprotección contra la isquemia cerebral usando corticostriatales in vitro y oclusión de arteria cerebral media in vivo.

Modelos Experimentales para Estudiar la Neuroprotección del Acondicionamiento Acido Contra la Isquemia Cerebral

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