Péptido y proteína cuantificación usando automatizado inmuno-MALDI (iMALDI)

El objetivo general de este ensayo automatizado de inmuno-MALDI es cuantificar péptidos y proteínas intactas en fluidos biológicos complejos de manera precisa y sensible. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la proteómica cuantitativa, como cuantificar los niveles de proteínas para el diagnóstico o para monitorizar la respuesta de un paciente al tratamiento. La ventaja clave de este método es que puede cuantificar los niveles de proteínas de manera muy sensible y precisa a partir de muestras complejas.

Esta técnica permite el diagnóstico de enfermedades en una etapa temprana, ya que la etapa de inmunoenriquecimiento del ensayo permite la cuantificación de biomarcadores de proteínas y péptidos de baja abundancia. Aunque este método puede proporcionar información sobre la actividad de la renina plasmática, también se puede aplicar a otros estudios relacionados con la enfermedad, como la cuantificación de proteínas relacionadas con el cáncer para el pronóstico, el diagnóstico y el tratamiento del tratamiento. Para comenzar este procedimiento, descongele muestras de plasma humano en un baño de agua a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Luego, coloque las muestras en hielo hasta que se descongelen por completo. A continuación, transfiera manualmente 200 microlitros de cada muestra de plasma a pocillos separados de una placa de pocillo de 1,1 mililitros de profundidad. Centrifugar la placa durante 10 minutos a dos grados centígrados y 3.000 rpm.

A continuación, utilice el Bravo para diluir en serie una solución estándar Ang-1 NAT de 500 femtomoles por microlitro para preparar seis soluciones calibradoras con albúmina de clara de huevo de gallina. Después de la centrifugación, pipetee 200 microlitros de cada calibrador en un pocillo y 125 microlitros de tampón de generación en la placa de muestra. Utilizando un sistema automatizado de manejo de líquidos, mezcle 125 microlitros de sobrenadante de plasma o 125 microlitros de la solución de albúmina de clara de huevo de gallina con 25 microlitros de tampón de generación de angiotensina I en una nueva placa de pocillo profundo de 1,1 mililitros.

Ahora, transfiera automáticamente las soluciones a una placa de 96 pocillos con tres réplicas por solución y 34 microlitros de solución por pocillo. Luego, incuba la placa a 37 grados centígrados durante tres horas. Para la conjugación del anticuerpo con perlas de proteína G, primero transfiera 78 microlitros de suspensión de perlas previamente preparada a un tubo de 1,5 mililitros.

Lave las perlas siete veces con un mililitro de acetonitrilo al 25% en PBSC y tres veces con un mililitro de PBSC, utilizando un soporte magnético para pellets las perlas entre cada lavado. Después de lavar las perlas, vuelva a suspenderlas en 110 microlitros de PBSC y agregue 110 microlitros de anticuerpo anti-angiotensina I. Mezcle las perlas y la solución pipeteando.

Luego, incube las perlas a temperatura ambiente durante una hora mientras gira a ocho rpm. Después de esto, lave las cuentas tres veces con un mililitro de PBSC. A continuación, vuelva a suspender las perlas en 1.100 microlitros de PBSC.

Ahora, transfiera manualmente la solución de perlas a una placa de 96 pocillos. Luego, haga que la alícuota Bravo coloque las cuentas en la misma placa de 96 pocillos. Después del período de generación de angiotensina I de tres horas, coloque la placa de incubación en hielo durante 10 minutos para finalizar la generación de angiotensina I. Diluya automáticamente una solución madre de péptidos de espiritótopos estables 100 veces con tampón PBS.

Además, alícuota automáticamente la dilución del péptido estándar de isótopo estable en una placa de PCR de 96 pocillos. Transfiera 10 microlitros de la solución peptídica diluida a cada pocillo de la placa de incubación. Mezcle la solución peptídica diluida con las muestras de plasma o la solución de albúmina de clara de huevo de gallina.

Agregue automáticamente la muestra o las soluciones estándar a las soluciones de perlas a la placa de incubación y mezcle. Después de incubar una hora, lave automáticamente las perlas tres veces con una solución de bicarbonato de amonio de cinco milimolares. Use un imán para tirar de las cuentas hacia el fondo después de cada lavado.

Después del último lavado, agregue 10 microlitros de la solución de bicarbonato de amonio a cada pocillo para volver a suspender las perlas. Transfiera automáticamente siete microlitros de la suspensión de cordones a una placa objetivo MALDI con un tamaño de punto de 2.600 micrómetros. Una vez que las perlas se hayan secado, agregue automáticamente dos microlitros de solución de matriz HCCA previamente preparada del pocillo de matriz en cada punto de muestra en la placa objetivo.

A continuación, analice los puntos de muestra con un instrumento MALDI-TOF utilizando el modo reflector positivo. Realice la calibración interna, el suavizado de datos y la sustracción de línea de base con el software específico del proveedor. El procedimiento automatizado iMALDI para medir la angiotensina I permite el análisis de alto rendimiento de un gran número de muestras con un coeficiente de variación intradía inferior al 10%Aquí se muestran los espectros representativos obtenidos mediante la medición de la angiotensina I en muestras de plasma humano.

Aquí se muestra la correlación de los valores de PRA de 188 muestras de pacientes obtenidos con el ensayo automatizado iMALDI con los valores de PRA obtenidos mediante un procedimiento clínico LC-MS/MS. Los dos métodos tienen un coeficiente de correlación de 0,98, y la diferencia entre las pendientes puede deberse al uso de diferentes patrones internos o diferentes anticuerpos. Aquí se muestra el rango lineal del ensayo y la precisión del ensayo.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente cinco horas. Al intentar este procedimiento, recuerde ajustar correctamente la cabeza de la punta y la velocidad de manejo del líquido. Después de este procedimiento, se pueden utilizar métodos adicionales para confirmar el aldosteronismo primario en los pacientes, incluidas las pruebas de carga de sal oral o de infusión de solución salina.

La técnica automatizada iMALDI permite el cribado cuantitativo específico y preciso de muestras biológicas, incluidas muestras de pacientes, para detectar proteínas o péptidos relacionados con enfermedades. Después de ver este vídeo, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un ensayo iMALDI automatizado para la cuantificación de proteínas y péptidos basada en espectrometría de masas. No olvide que trabajar con muestras biológicas, como el plasma humano, es extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar las precauciones de seguridad necesarias al realizar el procedimiento.