Name: Péptido y proteína cuantificación usando automatizado inmuno-MALDI (iMALDI) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Aprende a cuantificar péptidos y proteínas en fluidos biológicos complejos mediante iMALDI automatizado. Esta técnica de inmuno-enriquecimiento permite diagnósticos precisos y sensibles para investigación en proteómica clínica.

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Agradecemos el apoyo financiero del genoma Canadá y Columbia Británica de genoma para operaciones (204PRO) y desarrollo de la tecnología (214PRO) a través de la red genoma de innovaciones (Ginebra). Agradecemos a la plataforma de descubrimiento de droga en el Instituto de investigación del centro de salud de la Universidad McGill para el uso del instrumento MALDI-TOF para la filmación. H.L. está agradecido por apoyo de una beca postdoctoral de la National Science and Engineering Research Consejo de Canadá (NSERC). C.H.B está agradecida por el apoyo del fondo de dotación de vanguardia (LEEF). C.H.B. está agradecido por apoyo de la Presidencia de McGill Segal en Oncología Molecular en la Universidad McGill (Montreal, Quebec, Canadá). M.X.C. y C.H.B. son agradecidos por apoyo de Warren Y. Soper Charitable Trust y la Fundación de familia de Segal de Alvin en el Hospital General judío (Montreal, Quebec, Canadá).

las cantidades de los reactivos que se describen a continuación se basan en la medición de muestras de plasma paciente 20. El protocolo presentado a continuación sigue las directrices de la Universidad de Victoria &#39; Comité de ética de investigación de s.
 1. generación de la Ang I en Plasma humano <ol><li>descongelar las muestras de plasma (&#8805; 200 μL) en una sala de temperatura agua baño durante 5 minutos y luego coloque las muestras en hielo hasta completamente descongelada.</li>
	<li>Transfiera 200 μL de cada muestra de plasma manualmente para separar pocillos de una placa de la pozo profundo de 1.1 mL (placa de la muestra) y centrifugar la placa en una centrifugadora durante 10 minutos a 2 ° C y 1278 x g.</li>
	<li>Use un automatizado sistema para manejo de líquidos para diluir en serie 500 fmol/μl Ang I NAT solución patrón para preparar seis soluciones de calibrador con la albúmina de la clara de huevo de pollo (0.1, 0.2, 0.6, 1.9, 5.7, 17.2 fmol/μL).</li>
	<li>Pipeta de 200 μL de cada calibrador para un bien y 125 μl de generación tampón de placa de la muestra. 
	Nota: El CEWA en fosfato buffer de solución salina tamponada (PBS) tiene que ser recién preparado en el día del experimento.</li>
	<li>Utilizando un líquido automatizado sistema de manejo, en un nuevo plato mezclar 125 μl de plasma sobrenadante o 125 μl de CEWA en PBS con 25 μl de Ang I buffer de generación, que contiene 1 M Tris, ácido etilendiaminotetracético de 0,2 mM (EDTA) y 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF). 
	Nota: Preparar la Ang I buffer generación mezclando un tampón acuoso de 1 M Tris/0.2 mM EDTA (ajustado a pH 5.5 con ácido acético) y una solución PMSF (100 mM en metanol). Ambas soluciones pueden almacenarse 1 mes en soluciones de mezcla los dos de 4 ° C. en el día del experimento.</li>
	<li>Transferir automáticamente las soluciones en una placa de 96 pocillos, 3 repeticiones por solución, 34 μl por pocillo. Incubar la placa a 37 ° C por 3 h.</li>
</ol> 2. Inmuno-enriquecimiento de Ang I granos recubiertos de anticuerpos usando <ol><li>conjugación del anticuerpo en granos magnéticos de la proteína G Nota: Conjugación del anticuerpo con los granos se realiza manualmente durante la 3 h de Ang I período de generación en el día del experimento. Para otros analitos, los granos conjugados podrían ser capaces de almacenar en buffer de PBS que contiene 0,015% CHAPS (PBSC) a 4 ° C durante tres meses o más, dependiendo de las propiedades y estabilidad del anticuerpo.
	<ol><li>Transferencia 110 μl de mezcla de grano (suficiente para 20 muestras de medición y haciendo una curva estándar de 6 puntos) en un tubo de 1,5 mL. Lavar los granos siete veces con 1 mL de acetonitrilo/PBSC de 25% y tres veces con 1 mL de PBSC. Utilizar un soporte magnético para que sedimenten los granos entre cada paso de lavado. Eliminar el tampón de lavado después de la última Washington 
		Nota: Lavarse 7 veces con 25% acetonitrilo/PBSC es fundamental para eliminar los aditivos incompatibles con la MS en la mezcla de grano, como Tween-20. Si no hay estos aditivos en los granos seleccionados, este paso de lavado amplia podría no ser necesario.</li>
		<li>Suspender los granos en 110 μl de PBSC y añadir 110 μl de anti-Ang anticuerpo (concentración de anticuerpos final: 100 μg/mL). Mezclar los granos de la solución mediante pipeteo y entonces les incube a temperatura ambiente durante 1 h, rotación en rpm 8.</li>
		<li>Lave los granos 3 veces con 1 mL de PBSC y resuspender en 1100 μl de PBSC. 
		Nota: Si cualquier solución de grano ha fluido en la tapa del tubo durante la incubación, girar por la solución utilizando una centrífuga de sobremesa a 2680 x g.</li>
		<li>Transferir la solución grano manualmente a una placa de 96 pocillos (placa estándar del grano). Utilizar el líquido automatizado manejo sistema de alícuota los granos a la misma placa de 96 pocillos, 120 μl por pozo.</li></ol></li> <li>inmuno-enriquecimiento en las cuentas <ol><li>después de la 3 h Ang período de generación, colocar la placa de incubación en hielo durante 10 min terminar la generación de Ang I.</li>
		<li>Automáticamente diluya la solución stock del péptido SIS (10 pmol/μL) 100-fold con PBS buffer y automáticamente más alícuota la dilución estándar péptido de isoptope estable a una placa PCR de 96 pocillos. Transferir 1,5 μl de una solución de péptido de normas (SIS) de isótopos estables (contiene 100 fmol) en cada pocillo de la placa de incubación y se mezcla con las muestras de plasma o el CEWA buffers PBS.</li>
		<li>Automáticamente transferir el contenido de la placa de incubación para la solución de grano, 10 mL por pocillo, mezclar el.</li>
		<li>Incubar la placa a 4 ° C durante 1 hora mientras gira a rpm 8.</li>
		<li>Lave los granos tres veces automáticamente con una solución de bicarbonato de amonio (AmBic) de 5 mM, 100 μl por pozo por lavado. Después del último lavado, suspender las cuentas en 7 μl de 5 mM AmBic solución en cada pocillo. Use un imán para tirar los granos al fondo después de la última Washington</li>
	</ol></li></ol> 3. Transferencia de granos en un plato de destino MALDI y agregar solución de matriz <ol><li>Transfer 7 μl de la mezcla de grano automáticamente en un plato de destino MALDI con un tamaño de punto de 2.600 μm. Deje secan los granos de. 
	Nota: Un pequeño ventilador alimentado por USB se puede utilizar para acelerar el proceso de secado del grano.</li>
	<li>Añadir 2 μl de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (HCCA)-solución de matriz (que contiene 3 mg/mL HCCA, citrato de amonio de 1,8 mg/mL, 70% de acetonitrilo y 0.1% de ácido trifluoroacético) de la matriz bien sobre cada muestra en la placa de la blanco .</li>
</ol> 4. Adquisición por un MALDI-TOF-MS y análisis de los datos de la señal <ol><li>analizar la muestra de puntos con un instrumento de MALDI-TOF usando el modo de reflector positivo. Realizar la calibración interna, suavizado de datos y sustracción instantánea automáticamente con el software específico del proveedor. 
	Nota: El modo (positiva/negativa, lineal/reflector) seleccionado para la medición de MALDI-TOF depende el destino péptidos o proteínas.</li>
	<li>Calcular el cociente de respuesta relativa (cociente de la intensidad de Nat/SIS) y se compara con la curva estándar para determinar de la Ang I concentración en cada muestra. Calcular PRA utilizando la ecuación (1), donde Δt Ang I generación representa el tiempo utilizado para la generación de Ang I. 
	PRA = [Ang I] / Δt Ang I generación (1)</li></ol>

<ol><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).</li>
<li>Nicol, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+Immunoaffinity-Mass+Spectrometry-based+Approach+for+the+Quantification+of+Protein+Biomarkers+from+Serum+Samples+of+Lung+Cancer+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+%26+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Use of an Immunoaffinity-Mass Spectrometry-based Approach for the Quantification of Protein Biomarkers from Serum Samples of Lung Cancer Patients.</a> Mol. & Cell. Proteomics. 7 (10), 1974-1982 (2008).</li>
<li>Webster, J., Oxley, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWebster%2C+J+%22Chemical+Genomics+and+Proteomics%3A+Reviews+and+Protocols%22">Chemical Genomics and Proteomics: Reviews and Protocols</a>. Zanders, E. D. , Humana Press. 227-240 (2012).</li>
<li>Yergey, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+sequencing+of+peptides+using+MALDI%2FTOF-TOF%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">De novo sequencing of peptides using MALDI/TOF-TOF.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13 (7), 784-791 (2002).</li>
<li>Anderson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six+decades+searching+for+meaning+in+the+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Six decades searching for meaning in the proteome.</a> J. Proteomics. 107, 24-30 (2014).</li>
<li>Landegren, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+for+Sensitive+Plasma+Proteome+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Opportunities for Sensitive Plasma Proteome Analysis.</a> Anal. Chem. 84 (4), 1824-1830 (2012).</li>
<li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+Enrichment+and+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Protein+Methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+%26+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity Enrichment and Mass Spectrometry Analysis of Protein Methylation.</a> Mol. & Cell. Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li>
<li>Florentinus-Mefailoski, A., Soosaipillai, A., Dufresne, J., Diamandis, E. P., Marshall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-linked+immuno-mass+spectrometric+assay+with+the+substrate+adenosine+monophosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">An enzyme-linked immuno-mass spectrometric assay with the substrate adenosine monophosphate.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (4), 1119-1130 (2015).</li>
<li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocapture+strategies+in+translational+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunocapture strategies in translational proteomics.</a> Expert Rev Proteomics. 13 (1), 83-98 (2016).</li>
<li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Affinity+Capture+and+On-Tip+Digestion+to+Accurately+Quantitate+in+Vivo+Deamidation+of+Therapeutic+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Automated Affinity Capture and On-Tip Digestion to Accurately Quantitate in Vivo Deamidation of Therapeutic Antibodies.</a> Anal. Chem. , (2016).</li>
<li>Razavi, M., Leigh Anderson, N., Pope, M. E., Yip, R., Pearson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+precision+quantification+of+human+plasma+proteins+using+the+automated+SISCAPA+Immuno-MS+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High precision quantification of human plasma proteins using the automated SISCAPA Immuno-MS workflow.</a> N. Biotechnol. 33 (5 Part A), 494-502 (2016).</li>
<li>Razavi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+SISCAPA+Quantitation+of+Peptides+from+Human+Plasma+Digests+by+Ultrafast%2C+Liquid+Chromatography-Free+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">High-Throughput SISCAPA Quantitation of Peptides from Human Plasma Digests by Ultrafast, Liquid Chromatography-Free Mass Spectrometry.</a> J. Proteome Res. 11 (12), 5642-5649 (2012).</li>
<li>Anderson, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SISCAPA+Peptide+Enrichment+on+Magnetic+Beads+Using+an+In-line+Bead+Trap+Device%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+%26+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">SISCAPA Peptide Enrichment on Magnetic Beads Using an In-line Bead Trap Device.</a> Mol. & Cell. Proteomics. 8 (5), 995-1005 (2009).</li>
<li>Parker, C. E., Pearson, T. W., Anderson, N. L., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometry-based+clinical+proteomics+-+a+review+and+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometry-based clinical proteomics - a review and prospective.</a> The Analyst. 135 (8), 1830-1838 (2010).</li>
<li>Reid, J. D., Holmes, D. T., Mason, D. R., Shah, B., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+Development+of+an+Immuno+MALDI+%28iMALDI%29+Mass+Spectrometry+Assay+for+the+Diagnosis+of+Hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Towards the Development of an Immuno MALDI (iMALDI) Mass Spectrometry Assay for the Diagnosis of Hypertension.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21 (10), 1680-1686 (2010).</li>
<li>Mason, D. R., Reid, J. D., Camenzind, A. G., Holmes, D. T., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplexed+iMALDI+for+the+detection+of+angiotensin+I+and+angiotensin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Duplexed iMALDI for the detection of angiotensin I and angiotensin II.</a> Methods. 56 (2), 213-222 (2012).</li>
<li>Camenzind, A. G., vander Gugten, J. G., Popp, R., Holmes, D. T., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+an+immuno-MALDI+%28iMALDI%29+assay+for+angiotensin+I+and+the+diagnosis+of+secondary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of an immuno-MALDI (iMALDI) assay for angiotensin I and the diagnosis of secondary hypertension.</a> Clin. Proteomics. 10 (1), 20(2013).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+immuno+tandem+mass+spectrometry+%28iMALDI%29+assay+for+EGFR+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">Development of an immuno tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for EGFR diagnosis.</a> Proteomics Clin Appl. 1, (2007).</li>
<li>Jiang, J., Parker, C. E., Fuller, J. R., Kawula, T. H., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Immunoaffinity+Tandem+Mass+Spectrometry+%28iMALDI%29+assay+for+Detection+of+Francisella+tularensis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+chimica+acta%22%5BJournal%5D)">An Immunoaffinity Tandem Mass Spectrometry (iMALDI) assay for Detection of Francisella tularensis.</a> Analytica chimica acta. 605 (1), 70-79 (2007).</li>
<li>Popp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+assay+for+the+clinical+measurement+of+plasma+renin+activity+by+immuno-MALDI+%28iMALDI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">An automated assay for the clinical measurement of plasma renin activity by immuno-MALDI (iMALDI).</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1854 (6), 547-558 (2015).</li>
<li>Schoenherr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+of+monoclonal+antibodies+for+SISCAPA+assays+using+a+magnetic+bead+processor+and+liquid+chromatography-selected+reaction+monitoring-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated screening of monoclonal antibodies for SISCAPA assays using a magnetic bead processor and liquid chromatography-selected reaction monitoring-mass spectrometry.</a> J Immunol Methods. 353 (1-2), 49-61 (2010).</li>
<li>Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. US patent. , US 7846748 B2 (2010).</li>
<li>Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. Canadian patent CA. , CA 2507864 C (2011).</li>
<li>Weiß, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+and+measure-mass+spectrometry-based+immunoassays+in+biomarker+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 927-932 (2014).</li>
<li>Nelson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+fragments%3A+Hope+and+hype%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Antibody fragments: Hope and hype.</a> mAbs. 2 (1), 77-83 (2010).</li>
<li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+an+aptamer+for+use+as+an+affinity+reagent+with+MS%3A+PCSK9+as+an+example+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">An evaluation of an aptamer for use as an affinity reagent with MS: PCSK9 as an example protein.</a> Bioanalysis. 8 (15), 1557-1564 (2016).</li>
</ol>

C.H.B posee la patente sobre la tecnología iMALDI.

En comparación con la cuantificación de proteína convencional basada en MS, iMALDI utiliza anticuerpos para enriquecer los analitos y purificarlos de muestras complejas, por lo tanto, lo que permite cuantificar proteínas o péptidos en bajas concentraciones. Un paso crítico en el protocolo de iMALDI es inmuno-enriquecimiento de los péptidos de destino. Para ello, se deben seleccionar anticuerpos con alta especificidad y afinidad. En SISCAPA, se ha divulgado que las afinidades de anticuerpo en el 10-9 M o mejor ...

Espectrometría de masas se ha convertido en una herramienta indispensable en proteómica cuantitativa. Espectrometría de masas puede determinar las masas de blanco proteínas o péptidos, por lo tanto las señales del analito obtenido pueden ser altamente específicas en comparación con los inmunoensayos. Dos métodos de ionización por electrospray y MALDI, comúnmente se utilizan para la detección de proteínas y péptidos1,2,3,4. Un desafío importante en la cuantificación de la proteína basada en MS radica en la detección de proteínas de baja abundancia en muestras complejas en las concentraciones de ng/mL o pg/mL en presencia de proteínas de alta abundancia, y muchos candidatos biomarcadores de proteínas encontradas plasma humano son dentro de esta gama5. Este problema es causado en gran parte por el inherentemente amplio rango dinámico y la complejidad del proteoma humano6.
Para superar estos desafíos de detección, se han desarrollado métodos inmuno-MS para enriquecer el objetivo proteínas o péptidos de las soluciones de la muestra sobre una superficie sólida, seguido por elución de los analitos y MS medida7,8 , 9 , 10. a través del enriquecimiento de inmuno, se purifican los analitos de muestras complejas y por lo tanto se reducen al mínimo los efectos del ion-supresión de otras moléculas. Entre diferentes soportes sólidos, bolas magnéticas son actualmente más utilizados ya que tienen las ventajas de la capacidad de unión de anticuerpos alto y facilidad de manejo. Granos magnéticos con diferentes functionalizations y tamaños se han desarrollado y comercializado para los experimentos de inmunoprecipitación. Hasta la fecha, inmuno-enriquecimiento en granos ha sido interconectado con ionización por electrospray (ESI) y MALDI-MS para la medición de proteínas y péptidos. En normas de isótopos estables y captura por la tecnología de los anticuerpos anti péptido (SISCAPA), son digeridas proteínas en las muestras, seguido por la incubación con los granos recubiertos de anticuerpos inmuno-enriquecimiento. En SISCAPA "clásico", los péptidos de proteotypic capturados son eluidos de los granos y mide por líquido cromatografía-ESI-MS (LC-MS), o por infusión directa ESI-múltiple reacción monitoreo-MS (MRM-ESI-MS)11,12. Inmuno-enriquecimiento mejoró la sensibilidad del ensayo MRM en 3-4 órdenes de magnitud, alcanzando los bajos ng/mL rango13.
En comparación con electrospray-MS, MALDI-MS es más rápido y no involucra la limpieza y volver a equilibrar columnas LC por lo que no existen problemas contaminación cruzada y la contaminación, lo que es más adecuado para estudios de alto rendimiento14. Inmuno-MALDI tecnología ha sido desarrollada en nuestro laboratorio para combinar inmuno-enriquecimiento con MALDI-MS para la cuantificación sensible y específica de péptidos y proteínas (basadas en la cuantificación de péptidos proteotypic)15,16 ,17. Después de inmuno-enriquecimiento, los granos se depositan en una placa de destino de MALDI, la solución de la matriz se agrega a los granos y la placa está lista para el análisis por MALDI-TOF-MS después del secado. Elución de los péptidos de los granos no se realiza como un paso separado, pero afinidad-limite los analitos se eluyen por la solución de matriz MALDI cuando se añade a los puntos de grano, lo que simplifica la preparación de la muestra y minimizar la pérdida de muestra. La tecnología iMALDI se ha aplicado en una variedad de aplicaciones18,19y recientemente ha sido automatizada y utilizado para medir la angiotensina I (Ang I) para la determinación de la actividad (PRA) de renina de plasma20. Este Protocolo será demostrar el procedimiento utilizado para realizar un análisis automatizado iMALDI. Tomando el ensayo PRA como ejemplo, CV interdía de menos del 10% se han logrado gracias a la automatización, con la capacidad de medición de las 744 muestras por día20.
El ensayo PRA iMALDI demostrado en este manuscrito no requiere digestión de proteínas, como la molécula objetivo (Ang I) es un péptido con un peso molecular de 1295.7 Da. En otros ensayos donde hay digestión de proteína y un péptido es utilizado como el sustituto de la proteína intacta, el péptido seleccionado para iMALDI debe ser único y específico a la proteína diana, con una masa más de 800 Da para que ello puede distinguirse fácilmente de la c hemical ruido de la solución de matriz MALDI. Anticuerpos anti péptidos son necesarios para el inmuno-enriquecimiento de los péptidos. El protocolo de un ensayo de iMALDI medición PRA consta de cuatro pasos: 1) generación de Ang I en plasma humano; 2) inmuno-enriquecimiento de Ang I utilizando granos recubiertos de anticuerpos; 3) transferencia de granos a una placa de destino de MALDI y agregar solución de matriz; y 4) adquisición de la señal por un MALDI-TOF-MS y los datos de análisis20.

<table><tbody><tr><td>Control sano de plasma humano</td><td>Biorrecuperación</td><td>HMPLEDTA2</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de amonio dibásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09833</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS (>=98%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9426</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina de clara de huevo de gallina (>98%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70990</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro de fenilmetanosulfonilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85172</td><td>Grado LC-MS</td></tr><tr><td>acetonitrilo</td><td>Fluka</td><td>34967</td><td>Agua de grado LC-MS</td></tr><tr><td></td><td>Fluka</td><td>39253</td> Ácido acético de <td>grado LC-MS</td></tr><tr><td></td><td>Fluka</td><td>320099</td><td>Grado LC-MS</td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano</td><td>Roche Diagnostics</td><td>3118169001</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Proteínas G perlas magnéticas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td>2.8 &mu; m, 30 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-Ang I anticuerpo policlonal de cabra</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7419</td><td></td></tr><tr><td>Nat y SIS Ang I</td><td>sintetizados en el Centro</td><td></td><td></td>de Proteómica BC de la Universidad de Victoria-Genoma BC</tr><tr><td>Sistema automatizado de manipulación de líquidos</td><td>Agilent</td><td>16050-102</td><td>Estación de trabajo robótica Agilent Bravo</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>Imán Invitrogen DynaMag-2</td></tr><tr><td>Rotador de tubo</td><td>Theromo Scientific</td><td>400110Q</td><td>Labquake Imán rotador de tubo</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12027</td><td>DynaMag-96 imán con faldón lateral</td></tr><tr><td>Imán</td><td>VP Scientific</td><td>771RM-1</td><td>utilizado para tirar de las cuentas hasta el fondo del pozo</td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>Bruker</td><td></td><td>Bruker Instrumento Microflex LRF</td></tr></tbody></table>

péptido y proteína cuantificación usando automatizado inmuno-maldi (imaldi)

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

Espectrometría de masas (MS) es una de las tecnologías más utilizadas para la cuantificación de proteínas en muestras complejas, con la especificidad del ensayo excelente como resultado de la detección directa de la relación masa / carga de cada molécula de la blanco. Sin embargo, proteómica basada en la MS, como la mayoría otras técnicas analíticas, tiene un sesgo hacia la medición de analitos de alta abundancia, por lo que es un reto a alcanzar límites de detección bajos ng/ml o pg/mL en muestras complejas y esto es el intervalo de concentraciones para muchos proteínas enfermedad relevante en biofluidos como plasma humano. Para ayudar en la detección de analitos de baja abundancia, inmuno-enriquecimiento ha sido integrado en el ensayo para concentrar y purificar la sustancia a analisar antes de medición MS, mejorando significativamente la sensibilidad del ensayo. En este trabajo, la tecnología de inmuno - mediante desorción/ionización del Laser (iMALDI) es presentada para la cuantificación de proteínas y péptidos en biofluidos, basada en inmuno-enriquecimiento en granos, seguida por MALDI-MS medida sin previa elución. Los anticuerpos anti péptidos son funcionalizados en bolas magnéticas y se incubaron con muestras. Después del lavado, los granos son transferidos directamente en un plato blanco MALDI y las señales son medidas por un MALDI-tiempo de instrumento de vuelo (MALDI-TOF) después de la solución de la matriz se ha aplicado a los granos. Se simplifica el procedimiento de preparación de la muestra en comparación con otros ensayos inmuno-MS, y la medición de MALDI es rápida. La preparación de toda la muestra se automatiza con un líquido, manejo del sistema, con mayor rendimiento y mejor reproducibilidad. En este artículo, el ensayo de iMALDI se utiliza para determinar la angiotensina péptido I (Ang I) concentración en el plasma, que se utiliza clínicamente como lectura de la actividad de renina plasmática para la detección del aldosteronism primario (PA).

Un procedimiento automatizado iMALDI para medir Ang se muestra en la figura 1. Péptidos de destino (péptidos endógenos o péptidos de las proteínas digeridas) están enriquecidos en bolas magnéticas anti péptidos, y luego los granos se transfieren a una placa de la blanco para la medición de MALDI. Todo el procedimiento se simplifica en comparación con otras tecnologías inmuno-MS que requieren pasos de elución de péptido adicional. Automatización del ensayo iMA...

Se presenta un protocolo para la cuantificación de proteínas en fluidos biológicos complejos utilizando tecnología automatizada inmuno-MALDI (iMALDI).

Péptido y proteína cuantificación usando automatizado inmuno-MALDI (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a ...

El objetivo general de este ensayo inmuno-MALDI automatizado es cuantificar péptidos y proteínas intactas en fluidos biológicos complejos de manera precisa y sensible. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la proteómica cuantitativa, como cuantificar niveles de proteínas para diagnóstico o para monitorear la respuesta de un paciente al tratamiento. La ventaja principal de este método es que puede cuantificar niveles de proteínas de forma muy sensible y precisa a partir de muestras complejas.Esta técnica permite el diagnóstico de enfermedades en una etapa temprana porque el paso de inmunoenriquecimiento del ensayo permite la cuantificación de biomarcadores proteicos y peptídicos poco abundantes. Aunque este método puede proporcionar información sobre la actividad de la renina plasmática, también puede aplicarse a otros estudios relacionados con enfermedades, como la cuantificación de proteínas asociadas al cáncer para el pronóstico, diagnóstico y manejo del tratamiento. Para comenzar este procedimiento, descongele las muestras de plasma humano en un baño de agua a temperatura ambiente durante cinco minutos.Luego, coloque las muestras en hielo hasta que se descongelen completamente. A continuación, transfiera manualmente 200 microlitros de cada muestra de plasma a pozos separados de una placa de pozo profundo de 1,1 mililitro. Centrifugue la placa durante 10 minutos a dos grados Celsius y 3.000 rpm.Luego, utilice el Bravo para diluir en serie una solución estándar de NAT de Ang-1 de 500 femtomoles por microlitro y preparar seis soluciones calibradoras con albúmina de clara de huevo de pollo. Tras la centrifugación, transfiera con una pipeta 200 microlitros de cada calibrador a un pocillo y 125 microlitros de tampón de generación a la placa de muestras. Mediante un sistema automatizado de manipulación de líquidos, mezcle 125 microlitros de sobrenadante de plasma o 125 microlitros de la solución de albúmina de clara de huevo de pollo con 25 microlitros de tampón de generación de angiotensina I en una nueva placa de pocillos profundos de 1,1 mililitros.Ahora, transfiera automáticamente las soluciones a una placa de 96 pocillos con tres réplicas por solución y 34 microlitros de solución por pocillo. Luego, incube la placa a 37 grados Celsius durante tres horas. Para la conjugación del anticuerpo con las perlas de proteína G, primero transfiera 78 microlitros de la suspensión de perlas previamente preparada a un tubo de 1,5 mililitros.Lave las perlas siete veces con un mililitro de acetonitrilo al 25 % en PBSC y tres veces con un mililitro de PBSC, utilizando un soporte magnético para sedimentar las perlas entre cada lavado. Después de lavar las perlas, resuspenda en 110 microlitros de PBSC y agregue 110 microlitros de anticuerpo anti-angiotensina I. Mezcle las perlas y la solución mediante pipeteo.A continuación, incube las perlas a temperatura ambiente durante una hora mientras gira a ocho rpm. Después de esto, lave las perlas tres veces con un mililitro de PBSC. Luego, re suspenda las perlas en 1,100 microlitros de PBSC.Ahora, transfiera manualmente la solución de perlas a una placa de 96 pocillos. Luego, utilice el Bravo para aliquotar las perlas en la misma placa de 96 pocillos. Después del período de tres horas de generación de angiotensina I, coloque la placa de incubación sobre hielo durante 10 minutos para detener la generación de angiotensina I. Diluya automáticamente la solución stock del péptido estándar con isótopos estables 100 veces con tampón PBS.Además, distribuya automáticamente la dilución del péptido estándar con isótopo estable en una placa PCR de 96 pocillos. Transfiera 10 microlitros de la solución de péptido diluida a cada pocillo de la placa de incubación. Mezcle la solución de péptido diluida con las muestras de plasma o con la solución de albúmina de huevo de gallina.Agregue automáticamente las soluciones de muestra o patrón a las soluciones de perlas en la placa de incubación y mezcle. Después de incubar durante una hora, lave automáticamente las perlas tres veces con solución de bicarbonato de amonio cinco milimolar. Utilice un imán para separar las perlas en el fondo después de cada lavado.Después del último lavado, agregue 10 microlitros de la solución de bicarbonato de amonio a cada pocillo para resuspender las perlas. Transfiera automáticamente siete microlitros de la suspensión de perlas a una placa objetivo para MALDI con un tamaño de punto de 2.600 micrómetros. Una vez que las perlas se hayan secado, agregue automáticamente dos microlitros de la solución de matriz HCCA previamente preparada desde el pocillo de matriz a cada punto de muestra en la placa objetivo.A continuación, analice los puntos de muestra con un instrumento MALDI-TOF utilizando el modo reflector positivo. Realice la calibración interna, suavizado de datos y sustracción del fondo con el software específico del fabricante. El procedimiento automatizado de iMALDI para la medición de angiotensina I permite el análisis de alto rendimiento de un gran número de muestras con un coeficiente de variación intradía inferior al 10 %. Aquí se muestran espectros representativos obtenidos mediante la medición de angiotensina I en muestras de plasma humano.Se muestra aquí la correlación de los valores de PRA de 188 muestras de pacientes obtenidos con el ensayo iMALDI automatizado con los valores de PRA obtenidos mediante un procedimiento clínico de LC-MS/MS. Los dos métodos presentan un coeficiente de correlación de 0,98, y la diferencia entre las pendientes podría deberse al uso de estándares internos diferentes o de anticuerpos distintos. Aquí se muestra el rango lineal del ensayo y la precisión del ensayo.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente cinco horas. Al intentar este procedimiento, recuerde ajustar adecuadamente la punta y la velocidad de manipulación del líquido. Después de este procedimiento, se pueden utilizar métodos adicionales para confirmar el hiperaldosteronismo primario en pacientes, incluyendo la sobrecarga oral de sal o las pruebas de infusión salina.La técnica automatizada iMALDI permite la detección cuantitativa específica y precisa de alto rendimiento de muestras biológicas, incluyendo muestras de pacientes, para proteínas o péptidos relacionados con enfermedades. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un ensayo iMALDI automatizado para la cuantificación de proteínas y péptidos basada en espectrometría de masas. No olvide que trabajar con muestras biológicas, como el plasma humano, es extremadamente peligroso, y siempre deben tomarse las precauciones de seguridad necesarias durante la realización del procedimiento.

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Research

Investigación

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Chemistry

Química

Normas de isótopos estables y de captura de anticuerpos anti-péptido (SISCAPA) enriquecimiento de las parejas de afinidad de los péptidos con una dilución de isótopos estables de espectrometría de masas (MRM-MS) para proporcionar una medición cuantitativa de los péptidos como sustitutos de sus respectivas proteínas. A continuación se describe el protocolo de uso de partículas magnéticas en un formato parcialmente automatizado.

La cuantificación de proteínas mediante el enriquecimiento de inmunoafinidad péptido acoplado a espectrometría de masas

Hemos desarrollado una tecnología basada en película delgada de sílice mesoporoso para la recuperación selectiva de proteínas de bajo peso molecular y péptidos de suero humano. Las propiedades físico-químicas de nuestros chips mesoporosos fueron finamente sintonizada para proporcionar un control importante en el enriquecimiento de péptido y por lo tanto el perfil de la proteoma de suero para el diagnóstico.

De bajo peso molecular de proteínas en el enriquecimiento de las películas delgadas de silicio mesoporosos para el descubrimiento de biomarcadores

Etiquetado de isótopos estables de péptidos por dimethylation reductora (etiquetado REDI) es una estrategia rápida, de bajo costo para la proteómica precisas de masa basados ​​en espectrometría cuantitativos. Aquí se demuestra un método robusto para la preparación y el análisis de mezclas de proteínas utilizando el enfoque Redi que se puede aplicar a casi cualquier tipo de muestra.

Proteómica cuantitativos utilizando reductiva dimethylation de isótopos estables de etiquetado

Este protocolo describe cómo realizar ensayos de cuantificación absoluta de proteínas objetivo dentro de muestras biológicas complejas utilizando la monitorización de reacciones seleccionadas. Se utilizó para cuantificar con precisión las proteínas de la vía de señalización de la quimiotaxis de los macrófagos de ratón. Se describe en detalle la selección de péptidos objetivo, el desarrollo de ensayos y los ensayos cualitativos y cuantitativos.

Reacción seleccionada Monitoreo espectrometría de masas para Absolute Proteína cuantificación

Aquí, describimos un análisis cromatográfico juntado con la separación de movilidad de iones precursores de péptidos seguida por la alta resolución (~ 30.000) MS-detección de fragmentos de péptidos para la cuantificación de normas péptido con púas en un anticuerpo monoclonal Digest.

Un ensayo de HS-MRM para la cuantificación de las proteínas de la célula huésped en productos biofarmacéuticos de proteínas por cromatografía líquida QTOF masa espectrometría por movilidad iónica

Describimos el uso de immunoblotting cuantitativa para validar la histología inmunofluorescencia juntada con análisis de la imagen como medio de cuantificación de la proteína de interés en muestras de tejido formalina-fijo, parafina-encajado (FFPE). Nuestros resultados demuestran la utilidad de la histología de la inmunofluorescencia para determinar la cantidad relativa de proteínas biomarcadoras en muestras de biopsia de rutina.

Immunoblotting cuantitativa de líneas celulares como un estándar para validar la inmunofluorescencia para cuantificar proteínas biomarcadoras en muestras de tejido de rutina

Presentamos un método para la purificación, detección e identificación de péptidos digliquenados que se originan a partir de proteínas ubiquitinadas a partir de muestras biológicas complejas. El método presentado es reproducible, robusto y supera a los métodos publicados con respecto al nivel de profundidad del análisis ubiquitinome.

Detección de sitios de ubiquitinación de proteínas por enriquecimiento de péptidos y espectrometría de masas

Este flujo de trabajo describe el rendimiento del enriquecimiento eficiente en tiempo y costo de múltiples modificaciones post-traduccionales de proteínas (PTF) simultáneamente para el análisis proteómico global cuantitativo. El protocolo utiliza el enriquecimiento de PTM a nivel de péptido con múltiples anticuerpos conjugados, seguido de un análisis de espectrometría de masas de adquisición independiente de datos para obtener información biológica sobre la conversación cruzada PTM.

Enriquecimiento de afinidad simultánea de dos modificaciones post-traduccionales para la cuantificación y la localización del sitio

El etiquetado isotópico de precursor combinado y el etiquetado isobárico (cPILOT) es una estrategia mejorada de multiplexación de muestras que es capaz de aumentar el número de muestras que se pueden analizar simultáneamente con las etiquetas isobáricas disponibles. La incorporación de una plataforma robótica ha aumentado considerablemente el rendimiento experimental, la reproducibilidad y la precisión cuantitativa.

Multiplexación automática de muestras mediante el etiquetado isotópico de precursor combinado y el etiquetado isobárico (cPILOT)

Aquí, presentamos un protocolo para la purificación de complejos peptídicos MHC clase I y clase II a partir de líneas celulares de ratón y humanos que proporcionan datos inmunopeptidómicos de alta calidad. El protocolo se centra en la preparación de muestras utilizando anticuerpos disponibles comercialmente.

Inmunopeptidomics: Aislamiento de péptidos asociados a MHC de clase I y II de ratón y humano para el análisis de espectrometría de masas

Aquí, describimos un flujo de trabajo de proteómica para la caracterización del proteoma de la superficie celular de varios tipos de células. Este flujo de trabajo incluye el enriquecimiento de proteínas en la superficie celular, la posterior preparación de muestras, el análisis mediante una plataforma LC-MS/MS y el procesamiento de datos con software especializado.

Flujo de trabajo "Cell Surface Capture" para la cuantificación sin etiquetas del proteoma de la superficie celular

Aprende a cuantificar péptidos y proteínas en fluidos biológicos complejos mediante iMALDI automatizado. Esta técnica de inmuno-enriquecimiento permite diagnósticos precisos y sensibles para investigación en proteómica clínica.

Péptido y proteína cuantificación usando automatizado inmuno-MALDI (iMALDI)

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