La cuantificación de proteínas mediante el enriquecimiento de inmunoafinidad péptido acoplado a espectrometría de masas

El objetivo general del siguiente procedimiento es aislar y cuantificar péptidos en una mezcla compleja que actúen como sustitutos de su respectiva proteína. En primer lugar, las proteínas grandes de la mezcla se digieren para formar péptidos mediante una enzima como la tripsina. A continuación, los analitos peptídicos dirigidos y un estándar interno marcado con isótopos estables con picos se enriquecen utilizando anticuerpos antipéptidos y se inmovilizan en partículas magnéticas codificadas para la proteína G tras el aislamiento.

Los péptidos objetivo se aluden a partir de las partículas magnéticas y se analizan mediante espectrometría de masas para su cuantificación en relación con el patrón interno. Las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes, como los inmunoensayos tradicionales, es que es más rápida y rentable en la construcción de un gran número de ensayos. Tiene una alta tasa de éxito y se multiplexa fácilmente, lo que demuestra que el procedimiento se diseñará.

Un técnico en el laboratorio Haw un Eloqua de plasma de 10 microlitros sobre hielo húmedo. Transfiera la muestra a una placa de pocillo profundo de 1000 microlitros y cúbrala con una película parábola para desnaturalizar las proteínas a 20 microlitros de urea fresca de nueve molares y 30 milimolares DTT a cada muestra e incube durante 30 minutos A 37 grados centígrados, agregue tres microlitros de acetamida fresca de 500 milimolares I oto a cada muestra e incube durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Ahora diluya la urea a 0,6 molar con 100 milimolares tris pH ocho, y agregue 10 microlitros de un microgramo por microlitro viajes y solución madre para una proporción de una enzima a 50 por sustrato.

Después de incubar la reacción a 37 grados centígrados durante la noche a tres microlitros de ácido fórmico puro hasta una concentración final del 1%, continúe agregando el patrón de isótopo estable o patrones múltiples. Si se realiza un ensayo multiplex, lavar bien la placa del cartucho Oasis con 500 microlitros de ácido fórmico al 0,1% en nitrilo ACE al 80%, desechando el flujo a través de él. A continuación, equilibre la placa del cartucho añadiendo 500 microlitros de ácido fórmico al 0,1% en agua y deseche el flujo.

Cargue las muestras de digestión en la placa del cartucho y ajuste el vacío para que el flujo sea muy lento. Lavar tres veces con 500 microlitros de ácido fórmico al 0,1% en agua y desechar el flujo a través de eluir los péptidos dos veces con 500 microlitros de ácido fórmico al 0,1% en el ensayo de aceto al 80%, luego liofilizar o acelerar el eluido hasta la sequedad y reconstituir los péptidos secos en 50 microlitros de PBS más 0,03% Las chaparreras transfieran las muestras a una placa estándar Kingfisher de 96 pocillos, agregar un microgramo de anticuerpo y 1,5 microlitros de proteína G Perlas magnéticas codificadas por objetivo. Agite las cuentas antes de la adición.

Para asegurarse de que las cuentas estén bien suspendidas. Cubra la placa con papel de aluminio e incube durante la noche con una centrífuga suave. La placa a 400 RPM durante 10 segundos para eliminar cualquier líquido de la superficie del papel de aluminio.

Retire la cubierta de aluminio. La manipulación de muestras se realiza en una plataforma de martín pescador automatizada en la plataforma de martín pescador. Lave las perlas dos veces con 200 microlitros de PBS más 0.03% chaps y una vez con 200 microlitros de una dilución de uno a 10 de PBS más 0.03%Las chapas ahora eluden los péptidos con 25 microlitros de 5% de ácido acético más 0.03% chaps.

Coloque la placa de elución en un imán y transfiera el eluido a una placa de 96 pocillos, teniendo cuidado de no transferir las perlas sobrantes. Cubra la placa con la alfombrilla del techo, entregue esta placa que contiene el eluido al espectrómetro de masas triple y cuádruple para su análisis. El método MRM se construye obteniendo un espectro de masas en tándem del péptido de interés que elige y optimiza los mejores iones de fragmentos de transición.

Normalmente, una configuración para el análisis MRM utiliza una trampa C 18 y columnas analíticas con dos fases móviles. Cargue 10 microlitros de la muestra y eluya mediante un gradiente lineal. Integre las áreas de los picos para los péptidos ligeros y pesados, y calcule la relación de los picos de los péptidos no marcados y marcados en cada muestra.

Los péptidos ligeros y pesados eluyen al mismo tiempo y se pueden monitorear múltiples transiciones para cada péptido Para confirmar la identidad, el área máxima del péptido endógeno se mide en relación con el área del estándar interno para proporcionar una medida cuantitativa del péptido objetivo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo implementar esta técnica en su laboratorio. Se puede utilizar para cuantificar cualquier proteína de interés, lo que lo hace adecuado para una amplia gama de aplicaciones en la investigación biológica.