Immunoblotting cuantitativa de líneas celulares como un estándar para validar la inmunofluorescencia para cuantificar proteínas biomarcadoras en muestras de tejido de rutina

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la patología del cáncer, mediante la cuantificación de las proteínas de biomarcadores a partir de material de biopsia procesado de forma rutinaria. Las principales ventajas de esta técnica en relación con la inmunohistoquímica convencional, son que es objetiva, tiene un amplio rango dinámico, y permite la cuantificación de proteínas en tipos celulares específicos. La presencia o ausencia de ciertas llamadas proteínas de biomarcadores, o más particularmente, la abundancia relativa de esas proteínas en muestras de biopsia de cáncer puede ser muy útil para hacer un diagnóstico patológico específico de tipos específicos de cánceres.

Pero también puede ser útil para predecir la respuesta a los tratamientos oncológicos, por eso esta técnica es relevante tanto para el diagnóstico como para el tratamiento de pacientes con cáncer. Este protocolo trata principalmente de cómo utilizar la cuantificación de proteínas en líneas celulares inmortalizadas para validar la naturaleza cuantitativa del ensayo basado en inmunofluorescencia. Pero es importante tener en cuenta que la inmunofluorescencia se puede incorporar fácilmente en un enfoque multiplexado y aplicarse a las muestras de biopsia primaria.

Asistirán y demostrarán este procedimiento Lee Boudreau, técnico, y Shakeel Virk, el director de operaciones. Ambos del Laboratorio de Patología Molecular de la Reina. Para empezar, centrifugar las células previamente cosechadas en un tubo cónico de 50 mililitros a 225 Gs durante cinco minutos.

Decantar el sobrenadante, y resuspender el pellet celular en 10 mililitros de PBS. Luego, centrifugar las células resuspendidas a 225 Gs durante cinco minutos. Suspenda el pellet celular con 10 mililitros de 10%NBF.

Luego incubar las células a temperatura ambiente en un balancín a 24 RPM durante la noche. Después de fijar las células, centrifugar las células a 225 Gs durante cinco minutos. Luego retire el sobrenadante y resusppend las células en 500 microlitros de PBS.

Transfiera las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y pelete las células a través de la centrifugación. Entonces, aspira el sobrenadante. Añadir aproximadamente 500 microlitros de 1% de solución de agarosa a cada tubo que contenga células.

A continuación, pipetee la mezcla hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Después de que la solución de la célula de agarosa se endurezca, agregue un mililitro de 10%NBF a los tubos. Más tarde, retire el NBF de las muestras.

Utilice una cuchilla de afeitar para quitar el tapón de la celda y coloque el tapón en un casete de tejido plástico. Procesar muestras durante la noche con un procesador de tejidos automatizado. A continuación, incruste las muestras en cera de parafina, utilizando métodos de histología estándar.

Usando un instrumento de matriz de tejidos, cosecha núcleos duplicados de 6 milímetros del bloque de parafina e insértalos en un bloque de parafina vacío. Después de esto, utilice un microtomo para preparar dos secciones histológicas de la línea celular recién creada, TMA. A continuación, monte las secciones en un tobogán de histología y desparafinanlas.

En primer lugar, cargue las dos diapositivas de la línea celular TMA en un sistema de tinción automatizado. Mancha un lado con la dilución óptima del anticuerpo primario, dejando el otro como un deslizamiento de control negativo. Para ambas diapositivas, aplique una contramancha nuclear y un anticuerpo secundario.

Después del proceso de tinción, añada los reactivos de amplificación de la señal de tiramida. Después de esto, escanee las diapositivas inmunotendéricas utilizando las longitudes de onda de excitación y detección apropiadas para los fluoróforos que se utilizaron. Utilice el software de análisis de imágenes para identificar el compartimento celular de interés, ya sea el núcleo o el citoplasma, y cuantificar la intensidad media de fluorescencia, o IMF, para cada línea.

Para determinar qué línea celular tiene la mayor abundancia de la proteína diana, aliquot lysate celular preciosamente preparado en tubos de microcentrífuga. A continuación, agregue 2,5 microlitros de búfer de encaje 6x, y suficiente búfer de lisis RIPA para llevar el volumen total a 15 microlitros. A continuación, cargue un gel de página SDS, con una escalera de proteínas y las muestras previamente preparadas.

Después de esto, cargue el búfer de laemly en los pozos vacíos. Ejecute el gel hasta que el tinte azul llegue a la parte inferior de la placa. Después de realizar una transferencia de proteína semi-seca, utilice una cuchilla de afeitar para cortar la membrana horizontalmente para separar la proteína de interés de la proteína de control.

Realizar bloqueos e incubaciones de anticuerpos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, coloque las tiras de membrana en una bolsa de plástico transparente. Utilice una pipeta P1000 para cubrir las membranas con la mezcla de ECL.

A continuación, sellar la bolsa, e incubar las membranas a temperatura ambiente en la oscuridad durante uno a dos minutos. A continuación, coloque la bolsa de plástico que contiene las membranas en una plataforma de imágenes digitales. Utilice la quimiuminoscencia y la detección de marcadores colorimétricos para capturar varias exposiciones de la membrana.

Usando el software de análisis de imágenes, o la observación visual, determine qué línea celular expresa la proteína más objetivo. Después de inmunoblotting una dilución en serie de esta línea celular, abra las imágenes de exposición utilizando el software de análisis de imágenes. Utilice la herramienta Selecciones rectangulares para seleccionar el primer carril del gel.

A continuación, vaya a analizar, geles y seleccione el primer carril. Repita este proceso moviendo la herramienta de selecciones rectangulares al siguiente carril y vaya a analizar, geles y seleccionar el siguiente carril. A continuación, vaya a analizar, geles y trazar carriles.

Utilice la herramienta de línea recta para dibujar líneas a través de las bases de cada pico, para eliminar el ruido de fondo. A continuación, utilice la herramienta de varita para seleccionar cada pico y obtener la intensidad de banda de cada pico desde la ventana de resultados. Cree una gráfica de dispersión de intensidad de banda frente a la cantidad de proteína total cargada para cada anticuerpo primario utilizando la salida de densitometría.

A continuación, utilice una línea de mejor ajuste y observación visual para determinar la ubicación del rango dinámico lineal de cada anticuerpo. Seleccione una concentración de proteínas que produzca una intensidad de banda dentro del rango lineal, y realice un inmunoblot de todos los cilados de línea celular con esa concentración de proteína, como se demostró anteriormente. A continuación, realice la densitometría en los escaneos digitales, seleccionando exposiciones que producen señales dentro de los rangos lineales previamente identificados para cada anticuerpo.

Después de esto, calcule la relación entre la intensidad de la banda de proteína objetivo y la intensidad de la banda de control de carga para cada línea celular. Por último, utilice software estadístico para realizar una prueba de correlación de Pearson entre los valores obtenidos del análisis de imágenes de la tinción IF y los obtenidos de inmunoblotting. Este protocolo se utilizó para confirmar la capacidad de IF para determinar la cantidad relativa de la proteína anti-apoptótica Bcl-2.

Se probaron diferentes diluciones del anticuerpo primario en el tejido amígdalo humano con un tindor inmunohistórica. Para este experimento, se determinó que una dilución de uno a 50 era la dilución óptima que produjo una señal fuerte con poco ruido de fondo. Esta dilución se utilizó para manchar la línea celular TMA por inmunofluorescencia, y se utilizó el análisis de imagen para cuantificar la señal citoplasmático Cy5 atribuido a Bcl-2.

Basado en el inmunoblot para todas las líneas celulares probadas, Granta-519 tenía la mayor abundancia de Bcl-2. Un inmunoblot de la dilución en serie del lesate Granta-519 se utilizó entonces para encontrar el rango dinámico lineal de Bcl-2, y controlar la proteína GAPDH. El rango dinámico para Bcl-2 en este ensayo osciló entre una intensidad de banda de casi 0 y 7500 unidades.

El rango dinámico para GAPDH osciló entre 3000 y 6500 unidades. El inmunoblot se repitió con exposiciones dentro de ese rango lineal. Y la relación de Bcl-2 a GAPDH se calculó para cada línea celular.

Una prueba de correlación de Pearson demostró que las proporciones de intensidad de inmunoblotting estaban fuertemente y positivamente correlacionadas con las lecturas de intensidad de IF cuantitativo. Al intentar este procedimiento, es importante recordar exponer la membrana final para múltiples puntos de tiempo, Con el fin de encontrar la exposición óptima donde todas las bandas están dentro de sus respectivos rangos lineales. Después de validar la naturaleza cuantitativa del protocolo IF, se puede modificar para multiplex IF, en muestras de tejido procesadas rutinariamente con el fin de responder a preguntas clínicas tales como donde se expresa una proteína diana.