Name: Immunoblotting cuantitativa de líneas celulares como un estándar para validar la inmunofluorescencia para cuantificar proteínas biomarcadoras en muestras de tejido de rutina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Aprenda a validar inmunofluorescencia cuantitativa mediante inmunoblotting en líneas celulares para cuantificar proteínas biomarcadoras en muestras de tejido FFPE. Este método mejora el diagnóstico y tratamiento del cáncer.

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Este trabajo fue financiado parcialmente por el Fredrick Banting y Charles Best Canadá postgrado becas (A.M.).

Aprobación de las muestras de tejido humano primario se obtuvo de las Ciencias de la salud y afiliados a hospitales de enseñanza investigación ética Junta (HSREB) en la Universidad de la reina.
1. construcción de una línea celular tejido microarrays (TMA)
<ol><li>Cosecha y lavado de células. Nota: Este protocolo ha sido probado en varias líneas celulares inmortalizadas establecidas (por ejemplo, HeLa, Jurkat, RCH-ACV).<ol>
<li>Para las células adherentes, cosecha aproximadamente 1.3 x 107 células una vez que alcanzan aproximadamente el 80% de confluencia. Separar las células mediante un reactivo apropiado para esa línea celular. Nota: Ácido etilendiaminotetracético (EDTA) se prefiere generalmente encima tripsina para reducir el riesgo de degradar proteínas de la superficie. Si usando tripsina, neutralizar la tripsina con suero bovino fetal (FBS) inmediatamente después de la cosecha de las células.</li>
		<li>Para las células de suspensión, de la cosecha aproximadamente 8 x 107 células en fase logarítmica de crecimiento.</li>
		<li>Recoger las células cosechadas/separado por centrifugación durante 5 min a 225 g de x en un tubo cónico de 50 mL.</li>
		<li>Decantar el sobrenadante y Resuspenda el sedimento en 10 mL de 1 X de tampón fosfato salino (PBS). Centrifugar durante 5 min a 225 x g y decantar el sobrenadante. Nota: 1 X PBS está compuesto por NaCl 137 mM, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 en agua destilada; ajustar el pH a 7,4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fijar las células en formol y los pellets.<ol>
<li>Suspender el precipitado de células en el tubo cónico en 10 mL de formalina tamponada neutra 10% (NBF). Nota: NBF se puede preparar diluyendo 1 mL de solución stock de formaldehído al 37% en 9 mL de 1 X PBS. PRECAUCIÓN: Tenga cuidado al manejar el formol y formaldehído. Utilice una campana de humos para pasos con formalina y formaldehído.</li>
		<li>Incubar las células en un eje de balancín a 24 rpm a temperatura ambiente durante la noche (aproximadamente 17 h).</li>
		<li>Preparar una solución de agarosa de bajo punto de fusión en PBS 1% (0,01 g de agarosa por 1 mL PBS).<ol>
<li>Preparar suficiente para 500 μl de solución de agarosa por muestra de línea celular.</li>
			<li>Disolver la agarosa en un 80 ° C agua calor o baño de bloque, con la mezcla ocasional 2-5 minutos. Una vez disuelto, mantener la solución a 37 ° C calor o baño bloque de agua para prevenir el endurecimiento.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pellets de las células fijas de paso 1.2.2 por centrifugación durante 5 min a 225 x g. quitar el sobrenadante y resuspender las células en 500 μl de PBS 1 x.</li>
		<li>Transferir las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y de pellets por centrifugación durante 5 min a 290 x g. Aspire todo el sobrenadante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>La fundición de las células en agarosa.<ol>
<li>Añadir ~ 500 μl de solución de agarosa al 1% (del paso 1.2.3) a cada tubo que contiene las células. Con suavidad, pero rápidamente, pipetee mezcla arriba y abajo utilizando una micropipeta P-1000 para mezclar. Nota: Corte el extremo de la punta de la pipeta para agrandar la abertura y evitar la formación de burbujas. Mantener la solución de agarosa de trabajo en el baño de agua de 37 ° C para prevenir el endurecimiento.</li>
		<li>Deje que la solución de agarosa-cell harden (5-10 min) a temperatura ambiente. Añadir 1 mL de 10% NBF a cada microcentrífuga del tubo que contiene una muestra y mantener a temperatura ambiente hasta parafina inclusión (hasta 24 h).</li>
	</ol>
</li>
	<li>El enchufe de agarosa se preparan para inclusión en parafina.<ol>
<li>Aspire de NBF de la muestra.</li>
		<li>Quite el tapón de la celda usando una cuchilla de afeitar para cortar el tubo de microcentrífuga, coloque el tapón de un cassette de plástico tejido. Almacenar cassettes en 10% NBF a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Procesar las muestras durante la noche ya sea manualmente o utilizando un procesador automatizado de tejido y embed en parafina utilizando métodos estándar de histología. Nota: Ver Fischer et al. 19 para un protocolo de ejemplo.</li>
	<li>Con un especializado instrumento de "arrayer tejido", cosecha duplicados núcleos de 0.6 mm de la parafina bloquean de cada línea celular e insertarlas, en filas, en un bloque de parafina recipiente vacío para crear una línea de celular TMA. Nota: Puede usarse métodos estándar tales como los descritos en Fedor y De Marzo a20.</li>
	<li>Incorporar núcleos de muestras primarias que representa 2-3 tipos de tejido adicional (por ejemplo, la amígdala, colon, los testículos, etc.) como controles positivos o negativos en el TMA. Elegir los tejidos que son apropiados para la proteína de interés.</li>
	<li>Utilizar un micrótomo para preparar cortes histológicos dos, aproximadamente de 4 a 6 μm de espesor, de la línea celular TMA. La sección de montaje en un portaobjetos de histología, secarlo y Desparafinizar (como se describe en Fedor y De Marzo a20).</li>
</ol>2. muestra tinción por inmunofluorescencia
<ol><li>Optimizar la dilución del anticuerpo primario. Nota: Existen protocolos estándar para la optimización de la IHC o si para las secciones de tejido FFPE como en Kajimura et al. 21. una breve descripción del enfoque se describe aquí.<ol>
<li>Preparar diluciones de 4 y 5 de primaria del anticuerpo a la proteína de interés guiados por las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Identificar un tipo de tejido de control de una fuente animal o humano que expresa la proteína de interés en poblaciones de células morfológicamente reconocible. Preparar las secciones del tejido y montaje en un portaobjetos procedimiento de inmunohistoquímica estándar como en Fedor y De Marzo a20. Nota: El número de secciones requeridas es el número de diluciones del anticuerpo primario más uno extra.</li>
		<li>Usar un sistema automatizado o manual por immunohistology, prueba las diluciones del anticuerpo primario 2.1.1 cada paso de una diapositiva en el paso 2.1.2. Omitir la aplicación del anticuerpo primario de la diapositiva extra y utilizarlo como un control negativo.</li>
		<li>Durante el proceso de tinción, tinción todas las diapositivas con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) como una contratinción nuclear y un anticuerpo secundario etiquetado fluorescente. Si se requiere de una mayor sensibilidad, utilizar un HRP (peroxidasa de rábano)-conjugado de anticuerpo secundario y sistema de amplificación de señal basado en tyramide (ver pila et al. 13). Nota: Cuando multiplexación anticuerpos primarios, se utiliza una etiqueta fluorescente diferente para cada proteína.</li>
		<li>Escanear las diapositivas immunostained con un instrumento apropiado capaz de generar un archivo de imagen digital utilizando longitudes de onda de excitación y detección apropiados a los fluoróforos que fueron utilizados.</li>
		<li>Utilizar software apropiado para ver las imágenes digitales y elegir empíricamente la dilución del anticuerpo primario que optimiza la intensidad de la señal con respecto a la fluorescencia del fondo. Nota: Si lo desea, esta optimización puede ocurrir usando un anticuerpo secundario conjugado con HRP, 3, 3'-diaminobenzidina (DAB) y microscopía brightfield.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar si la coloración en la línea celular TMA.<ol>
<li>Utilizar un sistema automatizado o manual por immunohistology manchar una diapositiva de la línea celular TMA con la dilución del anticuerpo primario optimizado (según lo determinado en el paso 2.1). Omitir la aplicación del anticuerpo primario de la segunda diapositiva y usarlo como un control negativo.</li>
		<li>Durante el proceso de tinción, tinción con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) como una contratinción nuclear y con un anticuerpo secundario y tyramide como en el paso 2.1.4 todas las diapositivas.</li>
		<li>Escanear las diapositivas immunostained con un instrumento apropiado capaz de generar un archivo de imagen digital utilizando longitudes de onda de excitación y detección apropiados a los fluoróforos que fueron utilizados.</li>
		<li>Utilice un paquete de software de análisis de imagen para identificar el compartimiento celular de interés (es decir, citoplasma y núcleo) y cuantificar la intensidad de fluorescencia media (IFM) para cada línea celular. Nota: Varios paquetes de software pueden ser utilizados para este propósito y muchos se discuten en pila et al. 13.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. cuantitativa Immunoblotting de líneas celulares
<ol><li>Preparación de lisados de las células.<ol>
<li>Cosecha de 2 millones de células de cada línea celular, como se describe en pasos de 1.1.1 a la 1.1.3.</li>
		<li>Girar las células por 5 min a 650 g de x en un tubo cónico de 50 mL. Decantar el sobrenadante.</li>
		<li>Lavar las células con 10 mL de PBS helado. Resuspender en 1 mL de PBS helado y la transferencia a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrífuga según paso 3.1.2, decantar y dejar las células en hielo.</li>
		<li>Añadir 200 μL de tampón de lisis frío radioinmunoprecipitación (RIPA) con inhibidores de la proteasa (10 μl de los inhibidores de la X 100 por mL de tampón de lisis RIPA) a las células, vortex e incubar en hielo por 15 min. Nota: La cantidad de tampón de lisis para lisis eficaz varía por línea celular y puede determinarse empíricamente. Almacenador intermediario RIPA se compone de 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, 1,0% NP-40, desoxicolato de sodio 0,5%, SDS 0.1% en agua destilada.</li>
		<li>Para asegurar carga relativamente incluso sobre los immunoblots, cuantificar las proteínas totales en una muestra de 20 μl de cada lisado usando un método apropiado como el ensayo de Bradford. Añadir aproximadamente 40 μl de tampón de lisis X Laemmli 6 para el resto (aproximadamente 180 μL) de cada lisado celular y hierve a 100 ° C en un baño de bloque o de calor durante 5 minutos. Nota: 6 X Laemmli buffer se compone de 300 mM Tris-HCl (pH 6.8), 4% (p/v) de SDS, glicerol al 60%, 0.6% (w/v), azul de bromofenol 50 mM Ditiotreitol (DTT) en agua destilada.</li>
		<li>Almacenar las muestras a-20 ° C hasta por dos semanas.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar un immunoblot de todas las líneas de células para determinar qué línea celular tiene la proteína más abundante del interés. Nota: Siga el procedimiento descrito en Mahmood, T. y Yang, PC. 22, con las siguientes modificaciones.<ol>
<li>Alícuota de la célula lisado (preparado en paso 3.1) que contienen 10-50 μg de proteína (dependiendo de la abundancia de la proteína de interés) en tubos de microcentrífuga. Añadir 2,5 μl de Tampón Laemmli X 6 y de tampón de lisis RIPA suficiente para hacer el volumen hasta 15 μl.</li>
		<li>Carga un 5% de apilado y una concentración adecuada de resolver (por ejemplo, 10% para las proteínas entre 15-100 kDa) gel de SDS-PAGE con una escalera de proteína y las muestras del paso 3.2.1. Carga 1 X Laemmli buffer en pocillos vacíos. Ejecute la fuente de alimentación en ajustes apropiados, por lo general 125 V, de 80 minutos o hasta que el tinte de azul de bromofenol alcanza la parte inferior de la placa.</li>
		<li>Realizar a una transferencia de proteína semiseco como se describe en Wiedemann et al. 23. Nota: para obtener resultados representativos, una membrana de nitrocelulosa (que no necesita ser empapado en metanol), y el tampón de transferencia de frío Bjerrum Nielsen Schafer (BSN) fueron utilizados. Buffer BSN está compuesta por 48 mM de Tris, glicina de 39 mM, 20% de metanol en agua destilada.</li>
		<li>Después de la transferencia, utilice una cuchilla de afeitar para cortar la membrana horizontal para separar la parte que contiene la proteína de interés de una proteína de control interno apropiado, como GAPDH.</li>
		<li>Proceder al bloqueo y anticuerpo incubaciones con el amortiguador de bloqueo recomendado por el fabricante de los anticuerpos primarios. Nota: Las diluciones del anticuerpo primario óptimo pueden variar dramáticamente dependiendo de la sensibilidad y la abundancia de la proteína. Para abajo los resultados representativos, el anticuerpo a la proteína de interés requiere una dilución de 1:1,000 mientras que el control de la GAPDH requiere una dilución de 1:40,000. La dilución de anticuerpos secundarias utilizada fue 1:3, 000.</li>
		<li>Después de incubaciones de anticuerpo y el lavado de la membrana, coloque las tiras de membrana en una funda de plástico transparente como una bolsa de sándwich.</li>
		<li>Preparar enchanced de la quimioluminescencia (ECL) mezcla siguiendo las instrucciones del fabricante. Utilice una pipeta P-1000 para cubrir la membrana con la mezcla de ECL, cerca de la vaina e Incube las tiras de membrana con la mezcla en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1-2 min.</li>
		<li>Coloque la envoltura de la membrana en una plataforma de proyección de imagen digital. Usar de la quimioluminescencia y detección colorimétrico marcador para capturar varias exposiciones de la membrana. Nota: Tiempos de exposición variará según la cantidad de proteína cargada, abundancia de la proteína diana, afinidad de anticuerpos etc. comienzan con una exposición automática (normalmente unos pocos segundos) y tiempos de exposición de prueba arriba y abajo en incrementos de unos pocos segundos.</li>
		<li>Empíricamente, o utilizando el software de análisis de imagen, determinar qué línea de célula expresa la proteína diana.</li>
	</ol></li>
	<li>Encontrar el rango dinámico lineal de cada anticuerpo primario usando una dilución seriada.<ol>
<li>Realizar pasos 3.2.1-3.2.8 utilizando una serie de diluciones seriadas de la línea celular que expresa la mayor concentración de la proteína diana (identificada en el paso 3.2.9).</li>
		<li>Utilizar software de análisis de imagen como el ImageJ para realizar densitometría ósea en las imágenes de la exposición.<ol>
<li>Por ejemplo, utilizar ImageJ, utilice la herramienta Selección Rectangular para seleccionar el primer carril del gel para cuantificar. Ir a analizar | Geles | Seleccione el primer carril. Usa el ratón para mover el rectángulo resultante sobre el carril siguiente. Ir a analizar | Geles | Seleccione siguiente carril. Varias veces mover el rectángulo en el carril siguiente y seleccione el carril para el resto de los carriles.</li>
			<li>Ir a analizar | Geles | Trama de carriles. Utilice la herramienta de Línea recta para dibujar líneas a través de las bases de cada pico para eliminar ruido de fondo. Utilice la herramienta varita para seleccionar cada pico y recoge la densidad de cada pico, en adelante denominado intensidad de banda, desde la ventana de resultados .</li>
		</ol>
</li>
		<li>Uso de la densitometría de salida para crear un diagrama de dispersión de la banda intensidad versus la cantidad de proteína total cargado para cada anticuerpo primario. Usando una línea de mejor ajuste y una inspección visual, determinar la ubicación (rango de intensidad) de la gama dinámica lineal de cada anticuerpo.</li>
		<li>Elegir una concentración de la proteína que genera un valor en el extremo superior de la gama linear a la concentración hacia adelante con todas las líneas de la célula. Nota: Dado que esta concentración está por debajo del nivel de saturación en la línea celular con la mayor cantidad de esta proteína, no debe existir ningún peligro de sobre exponer las bandas para las otras líneas celulares.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar un immunoblot usando la concentración de proteína en paso 3.3.4 para todas las líneas celulares y repita los pasos 3.2.1-3.2.8.<ol>
<li>Realizar densitometría ósea en los escaneos digitales como en el paso 3.3.2. Elegir las imágenes de las exposiciones que producen señales dentro de las gamas lineares para cada anticuerpo identificado en el paso 3.3.3.</li>
		<li>Usando las señales de intensidad de la banda de la exposición ideal de 3.4.1, calcular el ratio de intensidad de banda de proteína de la blanco carga intensidad de la banda de control para cada línea celular. Estos valores de relación indican la abundancia relativa de la proteína diana de interés.</li>
		<li>Realizar una prueba de correlación de Pearson (se puede hacer utilizando un paquete de software estadístico) para correlacionar los valores obtenidos del análisis de la imagen del IF tinción (paso 2.2) a los obtenidos de immunoblotting (paso 3.4.2).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Khoury, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+Immunohistochemical+Assays+for+Integral+Biomarkers+in+the+NCI-MATCH+EAY131+Clinical+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).</li>
<li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+insights%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).</li>
<li>Seidal, T., Balaton, A. J., Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpretation+and+quantification+of+immunostains%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+surgical+pathology%22%5BJournal%5D)">Interpretation and quantification of immunostains.</a> The American journal of surgical pathology. 25 (9), 1204-1207 (2001).</li>
<li>Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+brown+cannot+do+for+you%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">What brown cannot do for you.</a> Nature Biotechnology. 24 (8), 914-916 (2006).</li>
<li>Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+spectrometry+imaging+of+emtricitabine+in+cervical+tissue+model+using+infrared+matrix-assisted+laser+desorption+electrospray+ionization%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+bioanalytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (8), 2073-2084 (2015).</li>
<li>Porta, T., Lesur, A., Varesio, E., Hopfgartner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+in+MALDI-MS+imaging%3A+what+can+we+learn+from+MALDI-selected+reaction+monitoring+and+what+can+we+expect+for+imaging%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification in MALDI-MS imaging: what can we learn from MALDI-selected reaction monitoring and what can we expect for imaging?</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (8), 2177-2187 (2015).</li>
<li>Rzagalinski, I., Volmer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+low+molecular+weight+compounds+by+MALDI+imaging+mass+spectrometry+%E2%80%93+A+tutorial+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantification of low molecular weight compounds by MALDI imaging mass spectrometry – A tutorial review.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1865 (7), 726-739 (2017).</li>
<li>Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Western+blots%3A+Pitfalls+of+densitometry%5BTitle%5D)+AND+%22ELECTROPHORESIS%22%5BJournal%5D)">Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry.</a> ELECTROPHORESIS. 30 (11), 1845-1855 (2009).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>Burgess, M. W., Keshishian, H., Mani, D. R., Gillette, M. A., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+and+efficient+quantification+of+low-abundance+proteins+at+very+high+multiplex+via+targeted+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+cellular+proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry.</a> Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (4), 1137-1149 (2014).</li>
<li>Carr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+peptide+measurements+in+biology+and+medicine%3A+best+practices+for+mass+spectrometry-based+assay+development+using+a+fit-for-purpose+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+cellular+proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach.</a> Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (3), 907-917 (2014).</li>
<li>Denburg, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Two+ELISA+Methods+and+Mass+Spectrometry+for+Measurement+of+Vitamin+D-Binding+Protein%3A+Implications+for+the+Assessment+of+Bioavailable+Vitamin+D+Concentrations+Across+Genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of Two ELISA Methods and Mass Spectrometry for Measurement of Vitamin D-Binding Protein: Implications for the Assessment of Bioavailable Vitamin D Concentrations Across Genotypes.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 31 (6), 1128-1136 (2016).</li>
<li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+immunohistochemistry%2C+imaging%2C+and+quantitation%3A+A+review%2C+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification%2C+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li>
<li>Peck, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+tumor+protein+marker+quantification+by+two+independent+automated+immunofluorescence+image+analysis+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+pathology%3A+an+official+journal+of+the+United+States+and+Canadian+Academy+of+Pathology%2C+Inc%22%5BJournal%5D)">Validation of tumor protein marker quantification by two independent automated immunofluorescence image analysis platforms.</a> Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 29 (10), 1143-1154 (2016).</li>
<li>Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proof+of+the+quantitative+potential+of+immunofluorescence+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry.</a> Laboratory Investigation. 97 (3), 329-334 (2017).</li>
<li>AlJohani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundant+expression+of+BMI1+in+follicular+lymphoma+is+associated+with+reduced+overall+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+and+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Abundant expression of BMI1 in follicular lymphoma is associated with reduced overall survival.</a> Leukemia and Lymphoma. 59 (9), 2211-2219 (2018).</li>
<li>Wood, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundant+expression+of+interleukin-21+receptor+in+follicular+lymphoma+cells+is+associated+with+more+aggressive+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+and+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Abundant expression of interleukin-21 receptor in follicular lymphoma cells is associated with more aggressive disease.</a> Leukemia and Lymphoma. 54 (6), 1212-1220 (2013).</li>
<li>Weberpals, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+application+of+the+Automated+QUantitative+Analysis+%28AQUA%29+technique+to+quantify+PTEN+protein+expression+in+ovarian+cancer%3A+A+correlative+study+of+NCIC+CTG+OV.16%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">First application of the Automated QUantitative Analysis (AQUA) technique to quantify PTEN protein expression in ovarian cancer: A correlative study of NCIC CTG OV.16.</a> Gynecologic Oncology. 140 (3), 486-493 (2016).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+embedding+tissue+samples+for+sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Paraffin embedding tissue samples for sectioning.</a> CSH protocols. , (2008).</li>
<li>Fedor, H. L., Marzo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Practical+Methods+for+Tissue+Microarray+Construction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">De Practical Methods for Tissue Microarray Construction.</a> Methods in Molecular Medicine. , 89-101 (2005).</li>
<li>Kajimura, J., Ito, R., Manley, N. R., Hale, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Single-+and+Dual-Color+Immunofluorescence+Protocols+for+Formalin-Fixed%2C+Paraffin-Embedded+Archival+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization of Single- and Dual-Color Immunofluorescence Protocols for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (2), 112-124 (2016).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22North+American+journal+of+medical+sciences%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+semi-dry+electrophoretic+transfer+of+a+wide+range+of+differently+sized+proteins+for+immunoblotting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting.</a> Nature Protocol Exchange. , (2013).</li>
<li>Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirty+years+of+BCL-2%3A+translating+cell+death+discoveries+into+novel+cancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Thirty years of BCL-2: translating cell death discoveries into novel cancer therapies.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (2), 99-109 (2016).</li>
<li>Bosch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioclinical+prognostic+model+using+MYC+and+BCL2+predicts+outcome+in+relapsed%2Frefractory+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">A bioclinical prognostic model using MYC and BCL2 predicts outcome in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma.</a> Haematologica. 103 (2), 288-296 (2018).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL2+mRNA+or+protein+abundance+is+superior+to+gene+rearrangement+status+in+predicting+clinical+outcomes+in+patients+with+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hematological+Oncology%22%5BJournal%5D)">BCL2 mRNA or protein abundance is superior to gene rearrangement status in predicting clinical outcomes in patients with diffuse large B-cell lymphoma.</a> Hematological Oncology. 35, 288-289 (2017).</li>
<li>Choi, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+expression+of+Bcl-2+predicts+poor+outcome+in+diffuse+large+B-cell+lymphoma+patients+with+low+international+prognostic+index+receiving+R-CHOP+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">High expression of Bcl-2 predicts poor outcome in diffuse large B-cell lymphoma patients with low international prognostic index receiving R-CHOP chemotherapy.</a> International Journal of Hematology. 103 (2), 210-218 (2016).</li>
<li>The Human Protein Atlas BCL2. , 
 <a target="_blank" href="https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna">https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna</a> (2018).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).</li>
<li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Guide+to+Modern+Quantitative+Fluorescent+Western+Blotting+with+Troubleshooting+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52099(2014).</li>
<li>Zellner, M., Babeluk, R., Diestinger, M., Pirchegger, P., Skeledzic, S., Oehler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+Western+blotting+for+quantitation+of+protein+biomarkers+in+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22ELECTROPHORESIS%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples.</a> ELECTROPHORESIS. 29 (17), 3621-3627 (2008).</li>
<li>Parra, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Platforms+of+Multiplexed+Immunofluorescence+for+Study+of+Paraffin+Tumor+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Treatment+%26+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues.</a> Journal of Cancer Treatment & Diagnostics. 2 (1), 43-53 (2018).</li>
<li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC Cell Biology. 9 (1), 13(2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hemos descrito un método que hace uso de immunoblotting cuantitativa (IB) para demostrar la utilidad de la inmunofluorescencia (IF) para determinar la abundancia relativa de una proteína diana en muestras de tejido FFPE. Métodos de cuantificación de proteínas actuales están limitados por su naturaleza categorial, como cromógeno IHC2,3, o por la necesidad de homogeneizar las muestras, prevención de la investigación sobre las poblaciones de la célula y estructura d...

Existe la necesidad de cuantificar proteínas en muestras de biopsia de tejido de (FFPE) de formalina-fijos, parafina-encajado en muchos campos clínicos. Por ejemplo, cuantificación de proteínas biomarcadoras en especímenes de la biopsia de rutina se utiliza para aclarar el pronóstico y tratamiento para pacientes de cáncer1de informar. Sin embargo, los métodos actuales son generalmente subjetivos y carecen de validación.
Inmunohistoquímica (IHC) es utilizado rutinariamente en laboratorios de patología y generalmente depende de un anticuerpo primario contra la proteína diana y un anticuerpo secundario conjugado con una etiqueta enzimática como la peroxidasa de rábano picante2. IHC convencional es sensible, puede hacer uso de minutos de muestras y preserva la integridad morfológica de muestras de tejido, lo que permite la evaluación de la expresión de la proteína dentro de su contexto histológica relevante. Sin embargo, porque la señal cromogénica generada por IHC es sustractiva, se adolece de un relativamente estrecho rango dinámico y ofrece un potencial limitado de multiplexación2,3,4. Espectrometría de masas del desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-MSI) la proyección de imagen preserva integridad morfológica. Sin embargo, este desarrollo de la tecnología está asociado con una modesta resolución morfológica y requiere calibración significativo y normalización, de afectar su viabilidad para el uso clínico rutinario5,6,7. Técnicas alternativas para cuantificar proteínas en muestras de tejido son immunoblotting8, espectrometría de masas en9,10,11y enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) de ensayo12, cada de que comienza con un homogeneizado lisado del tejido de la muestra. Las muestras de tejido primario son heterogéneas que contienen una multitud de tipos celulares. Por lo tanto, técnicas que implican la homogeneización de las muestras no permiten la cuantificación de una proteína en una población celular particular de interés, como las células cancerosas.
Como IHC, si es aplicable a las pequeñas muestras de FFPE y permite la retención de la integridad histológica13. Sin embargo, gracias a la naturaleza aditiva de las señales de fluorescencia, si es favorable a la aplicación de múltiples anticuerpos primarios y etiquetas fluorescentes. Por lo tanto, una proteína de interés se puede cuantificarse relativamente dentro de compartimentos celulares (por ejemplo, núcleo y citoplasma) definidas por medio de otros anticuerpos o de células específicas. Señales de fluorescencia también tienen la ventaja de un mayor rango dinámico13,14. La superioridad, la reproducibilidad y la multiplexación potencial de si se aplica a muestras FFPE ha sido demostrada13,14,15.
Adjunto describimos el uso de immunoblotting cuantitativo utilizando las líneas celulares establecidas como patrón oro para determinar la naturaleza cuantitativa de si junto con análisis de imagen asistida por ordenador para determinar la abundancia relativa de una proteína de interés en secciones histológicas de muestras de tejido FFPE. Hemos aplicado este método con éxito en un enfoque múltiple para cuantificar proteínas biomarcadoras en muestras de biopsia clínica16,17,18.

<table><tbody><tr><td>697</td><td>DSMZ</td><td>ACC 42</td><td>Línea celular</td></tr><tr><td>JeKo-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td>Línea celular</td></tr><tr><td>Jurkat</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>Línea celular</td></tr><tr><td>RCH-ACV</td><td>DSMZ</td><td>ACC 548</td><td>Línea celular</td></tr><tr><td>Granta-519</td><td>DSMZ</td><td>ACC 342</td><td>Línea celular</td></tr><tr><td>REH</td><td>DSMZ</td><td>ACC 22</td><td>Línea celular</td></tr><tr><td>Raji</td><td>ATCC</td><td>CCL-86</td><td>Línea celular</td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>Línea celular</td></tr><tr><td>Solución de tripsina/EDTA</td><td>Invitrogen R001100</td><td></td><td>Para el desprendimiento de células adhesivas</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Wisent Inc.</td><td>81150</td><td>Para neutralizar la tripsina</td></tr><tr><td>Protocolo de formalina tamponada neutra</td><td></td><td>245-684</td><td>Para la fijación de gránulos</td></tr><tr><td>celulares UltraPure agarosa de bajo punto de fusión</td><td>Invitrogen</td><td>15517-022</td><td>Para la fundición de gránulos</td></tr><tr><td>de células Anticuerpo monoclonal anti-humano Bcl-2 de ratón, clon 124</td><td>Dako (Agilent)</td><td>cat#: M088729-2, RRID: 2064429</td><td>Para detectar Bcl-2 por inmunofluorescencia e inmunoblot (lot#:&nbsp; 00095786</td></tr><tr><td>Ventana Discovery XT</td><td></td> <td>Roche-Para</td> <td>la automatización de la tinción por inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Sistema EnVision+- Polímero marcado con HRP (anti-ratón)</td><td>Dako (Agilent)</td><td>K4000</td><td>Para la amplificación de señales de inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Sistema EnVision+- Polímero marcado con HRP (anti-conejo)</td><td>Dako (Agilent)</td><td>K4002</td><td>Para la amplificación de señales de inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Cianina 5 reactivo de tiramida</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL745001KT</td><td>Para la amplificación de señales de inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Aperio ImageScope</td><td>Leica Biosystems-Para</td><td></td> <td>ver portaobjetos escaneados</td></tr><tr><td>Software de análisis de imágenes HALO</td><td>Indica Labs-Para</td><td></td> <td>la cuantificación de inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Inhibidores de la proteasa (cóctel de inhibidores de la proteasa Halt, 100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1862209</td><td>Para añadir a Tampón RIPA</td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>BioShop</td><td>EDT001</td><td>Para tampón RIPA</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>BDH Limited</td><td>56009</td><td>Para tampón RIPA</td></tr><tr><td>Desoxicolato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>Para tampón RIPA</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>FisherBiotech</td><td>BP229</td><td>Para tampón Laemlli</td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>BioShop</td><td>BRO777</td><td>Para tampón Laemlli</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0611</td><td>Para tampón Laemlli</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>BioShop</td><td>ALB001</td><td>Para lavados con inmunotransferencia</td></tr><tr><td>Escalera de proteínas (Precision Plus Protein Dual Color Standards)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td>Para ejecutar gel de proteínas</td></tr><tr><td>Papel de filtro (Papel de secado extra grueso)</td><td>Bio-Rad</td><td>1703969</td><td>Para secar de transferencia</td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulosa</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0115</td><td>Para transferencia</td></tr><tr><td>de transferencia Trans-blot SD célula de transferencia semiseca</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td>Para transferencia semiseca</td></tr><tr><td>Leche desnatada en polvo (Leche en polvo descremada)</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>9999S</td><td>Para tampón de bloqueo</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BioShop</td><td>TWN510</td><td>Para tampón de lavado</td></tr><tr><td>GAPDH conejo anticuerpo monoclonal</td><td>Epitomics</td><td>2251-1</td><td>Anticuerpo primario de la proteína de control (lote#: YE101901C)</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-ratón de cabra IgG (conjugado con HRP)</td><td>abcam</td><td>cat#: ab6789, RRID: AB_955439</td><td>Anticuerpo secundario para inmunoblot</td></tr><tr><td>Anticuerpo de cabra anti-conejo IgG (HRP conjugado)</td><td>abcam</td><td>cat#: ab6721, RRID: AB_955447</td><td>Anticuerpo secundario para inmunoblot (lote#: GR3192725-5)</td></tr><tr><td>Clarity Western Sustratos ECL</td><td>Bio-Rad</td><td>1705060</td><td>Para la detección de señales de inmunotransferencia</td></tr><tr><td>Amersham Imager 600</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29083461</td><td>Para la detección de señales de inmunotransferencia</td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>Freeware, NIH-Para</td><td></td> <td>análisis de densitometría</td></tr></tbody></table>

immunoblotting cuantitativa de líneas celulares como un estándar para validar la inmunofluorescencia para cuantificar proteínas biomarcadoras en muestras de tejido de rutina

Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

Cuantificación de proteínas de interés en muestras de tejido formalina-fijo, parafina-encajado (FFPE) es importante en clínica y aplicaciones de la investigación. Un método óptimo de cuantificación es preciso, tiene un rango dinámico lineal amplio y mantiene la integridad estructural de la muestra para permitir la identificación de tipos de células individuales. Los métodos actuales como la inmunohistoquímica (IHQ), espectrometría de masas y immunoblotting cada uno no cumplan con estas disposiciones debido a su naturaleza categorial o necesitan homogeneizar la muestra. Como método alternativo, proponemos el uso de inmunofluorescencia (IF) y análisis de imagen para determinar la abundancia relativa de una proteína de interés en los tejidos FFPE. Aquí se demuestra que este método se optimiza fácilmente, produce un amplio rango dinámico y es linealmente cuantificable en comparación con el estándar de oro de immunoblotting cuantitativa. Además, este método permite el mantenimiento de la integridad estructural de la muestra y permite la distinción de varios tipos de células, que puede ser crucial en aplicaciones de diagnóstico. En general, esto es un método robusto para la cuantificación relativa de proteínas en muestras FFPE y puede adaptarse fácilmente para adaptarse a clínica o investigación necesidades.

Este protocolo se utiliza para confirmar la capacidad de IF para determinar la cantidad relativa de la proteína anti-apoptótica Bcl-2 en líneas celulares hechos en bloques de tejido FFPE. Bcl-2 cuantificación selectivamente en las células cancerosas puede dilucidar mecanismos oncogénicos y puede ser útil en el diagnóstico patológico y en informar de las decisiones de manejo clínico24. Más específicamente, Bcl-2 desempeña un papel en el correcto desarrollo del linfo...

Describimos el uso de immunoblotting cuantitativa para validar la histología inmunofluorescencia juntada con análisis de la imagen como medio de cuantificación de la proteína de interés en muestras de tejido formalina-fijo, parafina-encajado (FFPE). Nuestros resultados demuestran la utilidad de la histología de la inmunofluorescencia para determinar la cantidad relativa de proteínas biomarcadoras en muestras de biopsia de rutina.

Immunoblotting cuantitativa de líneas celulares como un estándar para validar la inmunofluorescencia para cuantificar proteínas biomarcadoras en muestras de tejido de rutina

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la patología del cáncer, mediante la cuantificación de las proteínas de biomarcadores a partir de material de biopsia procesado de forma rutinaria. Las principales ventajas de esta técnica en relación con la inmunohistoquímica convencional, son que es objetiva, tiene un amplio rango dinámico, y permite la cuantificación de proteínas en tipos celulares específicos. La presencia o ausencia de ciertas llamadas proteínas de biomarcadores, o más particularmente, la abundancia relativa de esas proteínas en muestras de biopsia de cáncer puede ser muy útil para hacer un diagnóstico patológico específico de tipos específicos de cánceres.Pero también puede ser útil para predecir la respuesta a los tratamientos oncológicos, por eso esta técnica es relevante tanto para el diagnóstico como para el tratamiento de pacientes con cáncer. Este protocolo trata principalmente de cómo utilizar la cuantificación de proteínas en líneas celulares inmortalizadas para validar la naturaleza cuantitativa del ensayo basado en inmunofluorescencia. Pero es importante tener en cuenta que la inmunofluorescencia se puede incorporar fácilmente en un enfoque multiplexado y aplicarse a las muestras de biopsia primaria.Asistirán y demostrarán este procedimiento Lee Boudreau, técnico, y Shakeel Virk, el director de operaciones. Ambos del Laboratorio de Patología Molecular de la Reina. Para empezar, centrifugar las células previamente cosechadas en un tubo cónico de 50 mililitros a 225 Gs durante cinco minutos.Decantar el sobrenadante, y resuspender el pellet celular en 10 mililitros de PBS. Luego, centrifugar las células resuspendidas a 225 Gs durante cinco minutos. Suspenda el pellet celular con 10 mililitros de 10%NBF.Luego incubar las células a temperatura ambiente en un balancín a 24 RPM durante la noche. Después de fijar las células, centrifugar las células a 225 Gs durante cinco minutos. Luego retire el sobrenadante y resusppend las células en 500 microlitros de PBS.Transfiera las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y pelete las células a través de la centrifugación. Entonces, aspira el sobrenadante. Añadir aproximadamente 500 microlitros de 1% de solución de agarosa a cada tubo que contenga células.A continuación, pipetee la mezcla hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Después de que la solución de la célula de agarosa se endurezca, agregue un mililitro de 10%NBF a los tubos. Más tarde, retire el NBF de las muestras.Utilice una cuchilla de afeitar para quitar el tapón de la celda y coloque el tapón en un casete de tejido plástico. Procesar muestras durante la noche con un procesador de tejidos automatizado. A continuación, incruste las muestras en cera de parafina, utilizando métodos de histología estándar.Usando un instrumento de matriz de tejidos, cosecha núcleos duplicados de 6 milímetros del bloque de parafina e insértalos en un bloque de parafina vacío. Después de esto, utilice un microtomo para preparar dos secciones histológicas de la línea celular recién creada, TMA. A continuación, monte las secciones en un tobogán de histología y desparafinanlas.En primer lugar, cargue las dos diapositivas de la línea celular TMA en un sistema de tinción automatizado. Mancha un lado con la dilución óptima del anticuerpo primario, dejando el otro como un deslizamiento de control negativo. Para ambas diapositivas, aplique una contramancha nuclear y un anticuerpo secundario.Después del proceso de tinción, añada los reactivos de amplificación de la señal de tiramida. Después de esto, escanee las diapositivas inmunotendéricas utilizando las longitudes de onda de excitación y detección apropiadas para los fluoróforos que se utilizaron. Utilice el software de análisis de imágenes para identificar el compartimento celular de interés, ya sea el núcleo o el citoplasma, y cuantificar la intensidad media de fluorescencia, o IMF, para cada línea.Para determinar qué línea celular tiene la mayor abundancia de la proteína diana, aliquot lysate celular preciosamente preparado en tubos de microcentrífuga. A continuación, agregue 2,5 microlitros de búfer de encaje 6x, y suficiente búfer de lisis RIPA para llevar el volumen total a 15 microlitros. A continuación, cargue un gel de página SDS, con una escalera de proteínas y las muestras previamente preparadas.Después de esto, cargue el búfer de laemly en los pozos vacíos. Ejecute el gel hasta que el tinte azul llegue a la parte inferior de la placa. Después de realizar una transferencia de proteína semi-seca, utilice una cuchilla de afeitar para cortar la membrana horizontalmente para separar la proteína de interés de la proteína de control.Realizar bloqueos e incubaciones de anticuerpos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, coloque las tiras de membrana en una bolsa de plástico transparente. Utilice una pipeta P1000 para cubrir las membranas con la mezcla de ECL.A continuación, sellar la bolsa, e incubar las membranas a temperatura ambiente en la oscuridad durante uno a dos minutos. A continuación, coloque la bolsa de plástico que contiene las membranas en una plataforma de imágenes digitales. Utilice la quimiuminoscencia y la detección de marcadores colorimétricos para capturar varias exposiciones de la membrana.Usando el software de análisis de imágenes, o la observación visual, determine qué línea celular expresa la proteína más objetivo. Después de inmunoblotting una dilución en serie de esta línea celular, abra las imágenes de exposición utilizando el software de análisis de imágenes. Utilice la herramienta Selecciones rectangulares para seleccionar el primer carril del gel.A continuación, vaya a analizar, geles y seleccione el primer carril. Repita este proceso moviendo la herramienta de selecciones rectangulares al siguiente carril y vaya a analizar, geles y seleccionar el siguiente carril. A continuación, vaya a analizar, geles y trazar carriles.Utilice la herramienta de línea recta para dibujar líneas a través de las bases de cada pico, para eliminar el ruido de fondo. A continuación, utilice la herramienta de varita para seleccionar cada pico y obtener la intensidad de banda de cada pico desde la ventana de resultados. Cree una gráfica de dispersión de intensidad de banda frente a la cantidad de proteína total cargada para cada anticuerpo primario utilizando la salida de densitometría.A continuación, utilice una línea de mejor ajuste y observación visual para determinar la ubicación del rango dinámico lineal de cada anticuerpo. Seleccione una concentración de proteínas que produzca una intensidad de banda dentro del rango lineal, y realice un inmunoblot de todos los cilados de línea celular con esa concentración de proteína, como se demostró anteriormente. A continuación, realice la densitometría en los escaneos digitales, seleccionando exposiciones que producen señales dentro de los rangos lineales previamente identificados para cada anticuerpo.Después de esto, calcule la relación entre la intensidad de la banda de proteína objetivo y la intensidad de la banda de control de carga para cada línea celular. Por último, utilice software estadístico para realizar una prueba de correlación de Pearson entre los valores obtenidos del análisis de imágenes de la tinción IF y los obtenidos de inmunoblotting. Este protocolo se utilizó para confirmar la capacidad de IF para determinar la cantidad relativa de la proteína anti-apoptótica Bcl-2.Se probaron diferentes diluciones del anticuerpo primario en el tejido amígdalo humano con un tindor inmunohistórica. Para este experimento, se determinó que una dilución de uno a 50 era la dilución óptima que produjo una señal fuerte con poco ruido de fondo. Esta dilución se utilizó para manchar la línea celular TMA por inmunofluorescencia, y se utilizó el análisis de imagen para cuantificar la señal citoplasmático Cy5 atribuido a Bcl-2.Basado en el inmunoblot para todas las líneas celulares probadas, Granta-519 tenía la mayor abundancia de Bcl-2. Un inmunoblot de la dilución en serie del lesate Granta-519 se utilizó entonces para encontrar el rango dinámico lineal de Bcl-2, y controlar la proteína GAPDH. El rango dinámico para Bcl-2 en este ensayo osciló entre una intensidad de banda de casi 0 y 7500 unidades.El rango dinámico para GAPDH osciló entre 3000 y 6500 unidades. El inmunoblot se repitió con exposiciones dentro de ese rango lineal. Y la relación de Bcl-2 a GAPDH se calculó para cada línea celular.Una prueba de correlación de Pearson demostró que las proporciones de intensidad de inmunoblotting estaban fuertemente y positivamente correlacionadas con las lecturas de intensidad de IF cuantitativo. Al intentar este procedimiento, es importante recordar exponer la membrana final para múltiples puntos de tiempo, Con el fin de encontrar la exposición óptima donde todas las bandas están dentro de sus respectivos rangos lineales. Después de validar la naturaleza cuantitativa del protocolo IF, se puede modificar para multiplex IF, en muestras de tejido procesadas rutinariamente con el fin de responder a preguntas clínicas tales como donde se expresa una proteína diana.

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Biología

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Immunoblotting cuantitativa de líneas celulares como un estándar para validar la inmunofluorescencia para cuantificar proteínas biomarcadoras en muestras de tejido de rutina (Video) | JoVE Journal

Immunoblotting cuantitativa de líneas celulares como un estándar para validar la inmunofluorescencia para cuantificar proteínas biomarcadoras en muestras de tejido de rutina

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