La observación y cuantificación de los telómeros y las secuencias repetitivas usando fluorescencia In Situ La hibridación (FISH) con sondas de PNA en Caenorhabditis elegans

El objetivo general de esta técnica de hibridación fluorescente in situ es analizar de forma concisa el número y la longitud de los telómeros en C. Elegans. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la regénesis tumoral, el alargamiento alternativo de los telómeros y la senescencia celular. La principal ventaja de esta técnica es que los procedimientos son concisos y los telómeros se pueden visualizar y cuantificar en menos de 24 horas.

Recoja los gusanos adultos grávidos con un poco de medio líquido sin residuos en un tubo de 15 mililitros. Ahora lave los gusanos tres veces de la siguiente manera. Agregue tampón M9 para un volumen total de 15 mililitros.

A continuación, gire el tubo a 300 g durante tres minutos y deseche la solución por encima de la bolita de gusanos. A continuación, repita el proceso. Si después de la centrifugación los gusanos están flotando, aligere el freno de la centrífuga.

Después del tercer lavado, deja los gusanos con 5 mililitros de M9. Luego agregue 6,5 mililitros de agua destilada, dos mililitros de hiperclorito y un mililitro de hidróxido de potasio de cinco molares. Deje que los gusanos se incuben en esta solución blanqueadora durante tres minutos con 50 RPM de agitación. A continuación, vórtice a los gusanos para abrirlos y liberar sus huevos.

Bajo un microscopio de disección, busca los huevos liberados. Si aún no se liberan, continúe la incubación hasta ocho minutos. Si las lombrices están en su mayoría disueltas y los huevos están libres, llene el tubo hasta 15 mililitros con M9 y lave los huevos tres veces tal como se lavaron las lombrices antes.

A los huevos lavados, con la mayor parte del M9 eliminado, llene el volumen a 500 microlitros con PBST y luego agregue 500 microlitros de PFA al 4%. Ahora cargue 40 alícuotas de microlitros de huevos en 2%PFA a los pocillos de portaobjetos recubiertos de polilisina. A continuación, transfiera los portaobjetos a una cámara humidificada y déjelos incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Para este protocolo, tenga un bloque de aluminio sobre hielo seco almacenado a 80 grados centígrados. Además, tenga metanol y acetona almacenados a 20 grados centígrados. Una vez completado el paso de fijación, retire la mayor parte de la solución de PFA de los portaobjetos, dejando unos cinco microlitros.

A continuación, coloque los segundos portaobjetos recubiertos de polilisina sobre cada portaobjetos de muestra para que las dos superficies recubiertas se peguen entre sí, atrapando los tejidos en el pocillo. Si hay un exceso de fijador, límpialo con un pañuelo de papel. Ahora congele los portaobjetos colocándolos en el bloque de aluminio frío durante al menos 15 minutos.

Mientras tanto, prepare baños de metanol y acetona con hielo para los toboganes. Una vez que los portaobjetos estén congelados, gire uno para congelar y romper la muestra. Deseche el portaobjetos superior y sumerja el portaobjetos inferior en metanol helado durante cinco minutos.

Haga esto para todas las muestras. El craqueo por congelación permite la penetración de las sondas y el anticuerpo a través de la cáscara de huevo dura. Si los huevos se rompen por congelación con éxito, se pueden ver los huevos en ambas diapositivas.

Después de al menos cinco minutos en metanol, mueva los portaobjetos a acetona fría durante cinco minutos. En otros cinco minutos, remoje las muestras en PBST tres veces durante cinco minutos por baño. Después de los lavados del PBST, los portaobjetos pueden almacenarse en etanol al 100% a cuatro grados centígrados durante varios días.

Para continuar, agregue 20 microlitros de solución de RNasa a los pocillos de muestra e incube en una cámara humidificada a 37 grados centígrados durante una hora. A continuación, lave los portaobjetos en 2x SSCT dos veces durante 15 minutos por lavado. Después de los dos lavados, agregue 20 microlitros de solución de hibridación a las muestras e incube a 37 grados centígrados durante una hora en una cámara humidificada.

Mientras tanto, prepare la sonda para una sonda de ADN de doble cadena. Desnaturalízalo a 95 grados centígrados durante cinco minutos y luego enfríalo brevemente en hielo. Después de una hora, aspire la solución de hibridación y agregue la solución de sonda.

A partir de este paso, proteja la muestra de la luz. Después de agregar la sonda, cubra las muestras con cubreobjetos de vidrio. Luego haga una cámara humidificada en un bloque de calor de 80 grados centígrados.

Cuando el bloque de calor se haya estabilizado a 80 grados centígrados, coloque los portaobjetos de muestra en la cámara calentada y deje que se desnaturalicen durante tres minutos. A continuación, incubar todos los portaobjetos procesados en una cámara humidificada a 37 grados centígrados durante la noche. Después de la incubación nocturna, lave las muestras en PBST a temperatura ambiente durante cinco minutos.

En la preparación, caliente la solución de hibridación a 37 grados centígrados una hora antes del lavado. Luego cargue los portaobjetos en un frasco de solución de lavado de hibridación e incube a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Para eliminar la solución de hibridación, lave las muestras con PBST a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Haz esto tres veces. Después de aspirar el último lavado de PBST, agregue 20 microlitros de solución de bloqueo a cada muestra e incube en cámaras humidificadas a temperatura ambiente durante una hora en la oscuridad. A continuación, aspire la solución de bloqueo y reemplácela con una solución de anticuerpos anti-digoxigenina conjugada FITC de uno a 200.

Cubra los portaobjetos e incubelos a temperatura ambiente durante tres horas en la oscuridad. Después de la tinción de anticuerpos, lave las muestras dos veces con PBST durante 15 minutos por lavado en la oscuridad. A continuación, aspire el PBST y reemplácelo con 10 microlitros de solución de montaje que contenga DAPI.

Aplique un cubreobjetos y absorba el exceso de solución. Finalmente, selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas y proceda a observar las muestras bajo un microscopio fluorescente. Utilizando la sonda PNA, se observaron los telómeros de animales que sobrevivieron a una mutación suficiente para los telómeros.

En las gónadas, el número de telómeros por núcleo es cuantificable. La señal de los telómeros se colocalizó con una señal de TALT1, lo que apoya la idea de que TALT1 es responsable de la supervivencia sin telómeros. La intensidad de la señal de los telómeros se comparó mediante software.

La señal fue más fuerte en los supervivientes de ALT que en las cepas parentales utilizadas para generar los mutantes deficientes en telómeros. No olvide que trabajar con paraformaldehído y formamida puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes, al realizar este procedimiento.