Name: La observación y cuantificación de los telómeros y las secuencias repetitivas usando fluorescencia In Situ La hibridación (FISH) con sondas de PNA en Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Aprende a analizar telómeros en Caenorhabditis elegans mediante hibridación fluorescente in situ (FISH) con sondas de PNA. Este método permite visualizar y cuantificar secuencias repetitivas en menos de 24 horas.

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Las cepas de gusanos mutantes fueron amablemente proporcionadas por el Centro de Genética de Caenorhabdiitis. Esta investigación fue apoyada por una subvención del Proyecto de Investigación y Desarrollo de Tecnología Sanitaria de Corea a través del Instituto de Desarrollo de la Industria de la Salud de Corea (KHIDI), financiado por el Ministerio de Salud y Bienestar de la República de Corea (número de subvención: HI14C1277).

1. Las sondas de etiquetado con digoxigenina-dUTP por PCR <ol><li> Realizar etiquetado PCR con 10x mezcla de dNTP que contiene digoxigenina-dUTP como se describió anteriormente 13. </li><li> Se purifica el producto de PCR con la purificación spin-columna de acuerdo con las instrucciones del fabricante. <ol><li> Si la sonda es más corta que 200 pares de bases, eliminar libre digoxigenina-dUTP con cromatografía de columna de spin-de la mezcla de reacción en lugar de purificación spin-columna. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de portaobjetos revestidos de polilisina Nota: El procedimiento completo dura aproximadamente 2 horas. La mayor parte de los pasos se ejecutan desde la temperatura ambiente a excepción de la etapa de secado. <ol><li> Limpieza de las diapositivas <ol><li> Colocar los portaobjetos en un recipiente de plástico y enjuague brevemente los portaobjetos con agua destilada (DW). Eliminar el agua y llenar el recipiente con DW contiene un limpiador de vidrio 1%. </li><li> Agitar las diapositivas de 15 min a 50 rpm a temperatura ambiente (RT). Se lavan los portas con DW 3veces durante 5 min cada uno a temperatura ambiente. </li><li> Lavar los portaobjetos con etanol al 70% durante 15 minutos con agitación. Desechar el 70% de etanol y colocar los portaobjetos en un bloque seco de 65 ° C y secar al aire durante 15 minutos. </li></ol></li><li> polilisina recubrimiento de láminas de vidrio de múltiples pocillos Nota: La polilisina recubrimiento de vidrio deslizante es un paso importante, ya que proporciona la adherencia de la muestra a lo largo del procedimiento de tinción. Mal de diapositivas recubierto dará lugar a la pérdida de muestra. <ol><li> Diluir la solución de polilisina de stock a 0,01% (w / v) en agua destilada. Añadir 20 l de la diluido 0,01% (w / v) de polilisina a los pocillos de un portaobjetos de vidrio limpio. </li><li> Incubar el portaobjetos de vidrio durante 5 min a RT. </li><li> Colocar los portaobjetos en un bloque seco de 65 ° C y secar al aire durante 1 hora. </li><li> Almacenar las diapositivas polilisina en la casilla libre de polvo. </li></ol></li></ol> 3. Fijación de Worms en el portaobjetos de vidrio (Figura 1) <ol><li> Preparación de embriones para FISH Nota: gusanos de la cosecha antes de que todo tél alimentaria bacteriana es consumido por observación de los medios de cultivo bajo el microscopio. El hambre reduce la producción de huevos de gusanos adultos y aumenta la eclosión de los huevos. Métodos detallados se describen en 14,15. <ol><li> Crecer los gusanos en 50 mm placa de Petri de acuerdo con métodos estándar 14. </li><li> Después de todo la comida bacteriana se consume, cortar los medios de agar en el trimestre con una espátula. Esterilizar la espátula antes de cortar para evitar la contaminación. </li><li> Poner todo el trozo de agar en la placa de 100 mm de medios de cultivo de nematodos (NGM). Girar la pieza de agar revés para los gusanos para llegar a la comida fresca bacteriana. </li><li> Después de 48 a 72 horas, recoger los gusanos con tampón M9. Añadir 3 - 5 ml de tampón de M9 en la placa de NGM. tampón M9 pipeta en la superficie de NGM para lavar los gusanos. </li><li> Recoger el líquido con gusanos y añadir a un tubo de 15 ml. Nota: Si hay restos de agar después de la cosecha, centrifugue los gusanos en una solución de sacarosa al 30%. Mientras que los desechos se sedimentan, gusanos flotan enla superficie. </li><li> Añadir M9 buffer para compensar el volumen a 15 ml. Se precipitan los gusanos por centrifugación a 300 xg durante 3 min y eliminar la mayor parte del tampón de M9. Repita este paso 2 veces más. Nota: Si los gusanos todavía están flotando después de la centrifugación, establecer el nivel de freno de la centrífuga para valorar = 1. </li><li> tampón M9 aspirado. Añadir solución de blanqueo a los gusanos. Per 0,5 ml de gusanos, añadir 6,5 ml de DW, 2 ml de hipoclorito, 1 ml de 5 M KOH. </li><li> Incubar los gusanos con balanceo a temperatura ambiente durante 3 min a 50 rpm. gusanos vórtice durante 15 segundos para cizalla mecánicamente los gusanos y exponen los huevos. </li><li> Observe el tubo bajo un microscopio de disección durante el blanqueo. Asegúrese de que los gusanos se cortan por la mitad y los óvulos son liberados. Cuando la mayor parte del cuerpo de un adulto se disuelve, añadir M9 buffer para compensar el volumen a 15 ml. </li><li> Centrifugar a 300 g durante 3 min. Aspirar la mayor parte de la M9 y M9 añadir tampón fresca para compensar el volumen a 15 ml. Repita el paso de lavado 3 veces. Nota:Evitar el uso de una cantidad excesiva de gusanos, en que obstaculizan el proceso de blanqueo. Mantenga el tiempo de reacción total de menos de 8 minutos hasta que el lavado. Más de blanqueado por los huevos producen fuertes autofluorescencia. </li><li> Añadir PBS con polisorbato-20 (PBST) hasta 200 ly 200 l de paraformaldehído al 4% (PFA) para hacer que el 2% PFA. Precaución: Desde PFA es cancerígeno, llevar ropa protectora, guantes y protección para los ojos antes de usar PFA. </li><li> Añadir 40 l de los huevos en 2% PFA en el pozo de la corredera revestido de polilisina. </li><li> Colocar los portaobjetos en una cámara húmeda y se incuba durante 15 min a TA. Cierre la cámara húmeda justo después de las diapositivas se colocan en el interior. Nota: Los huevos se depositan en la parte inferior de la corredera mientras que se fija. </li></ol></li><li> Preparación gónadas disecados para FISH <ol><li> gusanos adultos cosecha cultivadas en 50 mm placa de NGM con la pipeta 1 ml de tampón M9. gusanos antes de la cosecha alimentaria bacteriana se agota. </li><li> Lavar los gusanos de cualquier bacteria ingenioh tampón M9, 2 veces. Nota: las bacterias residuales pueden interferir con las gónadas disecados se pegue a portaobjetos recubiertos con polilisina. </li><li> Se precipitan los gusanos por centrifugación a 300 x g. Retire M9 y transferir los gusanos a la placa de NGM vacío por micropipeta. </li><li> Añadir 30 l de tampón M9 que contiene levamisol 2 mM en un pozo de polilisina tratado de diapositivas. </li><li> Añadir 500 l de tampón M9 a un tubo de 1 ml. Utilice este tampón para transferir los gusanos mediante una pipeta boca. </li><li> Llene la punta de la pipeta boca con tampón M9 mediante la colocación de un capilar en el tubo de 1 ml que contiene el tampón M9. </li><li> Bajo el microscopio de disección, coloque la punta de la pipeta de boca justo delante de la cabeza del gusano adulto y arrastre boca pipeta de manera que la cabeza de gusanos entra en la pipeta de boca. Una vez que el jefe de gusanos entra en la punta, todo el cuerpo del gusano se introduce en la punta. </li><li> La transferencia de los gusanos a la diapositiva revestido de polilisina con una pipeta boca. </li><li> El uso de una maquinilla de afeitar, cortar def la cabeza o en la punta de la cola de los gusanos de la diapositiva. Cuando se corta el gusano, las gónadas se saltará. Las gónadas se adhieren a las diapositivas. <ol><li> Preparar al menos 30 gusanos en un pozo. Más pozos pueden ser utilizados por otros 30 gusanos. </li></ol></li><li> Ponga el portaobjetos en la cámara húmeda y aspirar fuera el buffer M9 con pipeta de boca. </li><li> Fijar la muestra mediante la adición de 20 l de 2% PFA a TA durante 15 min en la cámara húmeda. </li></ol></li></ol> 4. Fijación y permeabilización <ol><li> Coloque un bloque de aluminio en hielo seco y almacenarla en un congelador (-80 ° C). metanol y acetona en la tienda -20 ° C. </li><li> Después de PFA etapa de fijación 3.1.15 o 3.2.11, eliminar el uso de fijador micropipeta dejando ~ 5 l de la fijador. </li><li> Dicho de otro portaobjetos recubiertos con polilisina en la diapositiva muestra. Retire el fijador con toalla de papel si la solución es excesiva. No mover las diapositivas una vez que están adheridos entre sí. </li><li> Congelar las diapositivasen el bloque de aluminio durante al menos 15 min. Nota: Las muestras se pueden almacenar durante al menos 2 - 3 días. </li><li> Mientras que las diapositivas se están congelados, poner los frascos que contienen metanol y acetona fría en hielo. </li><li> Tome las diapositivas y los tuercen para congelar-romper la muestra. Desechar la corredera superior. Inmediatamente empapar la diapositiva en el helado de metanol durante 5 min. </li><li> La transferencia de los toboganes de hielo-acetona fría durante 5 minutos. </li><li> Lavar los portaobjetos 3 veces con PBST durante 5 minutos para eliminar el fijador residual. Continuar con la siguiente etapa o almacenar los portaobjetos en etanol al 100% a 4 ° C. Nota: Las muestras se pueden almacenar durante al menos 2 - 3 días. </li></ol> 5. La hibridación de células fijadas <ol><li> Añadir 20 l de solución de RNasa (PBST que contenía 10 mg / ml de RNasa A). Incubar el portaobjetos en la cámara húmeda a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Lavar el portaobjetos dos veces en solución salina 2x y citrato de sodio con polisorbato-20 (2x SSCT) durante 15 min cada uno. </li><li> Añadir 20l de solución de hibridación y se puso la cámara húmeda en la incubadora a 37ºC. Después de 1 hora, se retira la solución de hibridación mediante pipeteo. </li><li> Antes de retirar la solución de hibridación, preparar la sonda. Si la sonda es de doble hebra de ADN, desnaturalizar las sondas por calentamiento a 95 ° C durante 5 minutos en un bloque seco. Después de calentar, enfriar la sonda en hielo brevemente. </li><li> Añadir 10 l de solución de hibridación que contiene las sondas a la muestra. Por sonda de PNA, la concentración de uso en una proporción de 1: 2000 y para la sonda DIG-etiquetados, concentración de uso en una proporción de 1: 200. Cubrir la muestra con cubierta de vidrio. </li><li> Coloque una toalla de papel empapada con agua en el bloque de calor (80 ° C). Ponga una tapa de la caja de plástico del bloque de calor para conservar la humedad y la temperatura. </li><li> Después de que la temperatura del bloque de calor se ha estabilizado (a 80 ° C), colocar la placa de la muestra en la toalla de papel climatizada y cubrir las muestras con la tapa de la caja de plástico. Desnaturalizar la muestra durante 3 min. </li><li> CªUbaté los portaobjetos en una cámara húmeda durante la noche a 37 ° C. </li></ol> 6. Se lava y de inmunofluorescencia <ol><li> Calentar la solución de lavado de hibridación (2x SSC, formamida al 50%) a 37 ° C. </li><li> Lavar la muestra en el PBST dos veces a temperatura ambiente durante 5 min. Retire la cubierta de vidrio. </li><li> Lavar la muestra con solución de lavado de hibridación a 37 ° C durante 30 minutos. </li><li> Lavar el portaobjetos de la muestra en PBST 3 veces a temperatura ambiente. Nota: Realizar todos los pasos subsiguientes en cámara húmeda a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 20 l de solución de bloqueo y se incuba durante 1 hora a RT en la cámara húmeda. </li><li> Retire la solución de bloqueo y añadir solución de anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con FITC (1: 200) durante 3 horas a RT o durante la noche a 4 ° C. </li></ol> 7. Montaje y Observación <ol><li> Lavar la diapositiva muestra con PBST 2 veces durante 15 minutos cada uno. </li><li> Añadir 10 l de solución de montaje con DAPI. Ponga la cubierta de vidrio y presione suavemente. Retire cualquier exceso de solucióncon una toalla de papel. </li><li> Para evitar la evaporación de la solución de montaje, sellar los bordes de la cubierta de vidrio con esmalte de uñas. </li><li> Observar al microscopio confocal. Excluir los embriones con alto fondo. Centrarse en un campo con 4 - 20 núcleos. </li><li> Toma de imágenes de acuerdo con las instrucciones del fabricante con la lente del objetivo de 100X. Nota: Excite muestra con 405 nm láser para DAPI, con 555 nm láser para Cy3, con 488 nm láser para FITC. </li></ol> 8. Cuantificación de los telómeros de la señal Nota: La cuantificación se realiza como se ha descrito previamente 16. Todas las imágenes que se van a comparar deben tomarse con mismo ajuste incluyendo el tiempo de exposición y la fuente de luz. <ol><li> Exportar la imagen en formato TIF. </li><li> Descargar e instalar el software de análisis de imágenes. </li><li> Ejecutar el software de análisis de imagen y haga clic en el botón de acuerdo. </li><li> Haga clic en el botón de apertura. Abrir las imágenes con los pescados de los telómeros haciendo doble clic en el archivo de imagen. </li><li> Hacer clic[Editar] - [seleccionar región de procesamiento], seleccione región de interés por clic izquierdo y arrastrando. Excluir toda la tinción no específica. </li><li> Haga clic en [medida] - [Espacio en densidades ópticas], seleccione el canal con señal de los telómeros y escriba el nombre del archivo para guardar los resultados en el archivo .txt. Nota: La columna de los resultados se encuentran en el siguiente orden: La fluorescencia de la mancha, la intensidad de fondo de la mancha y el área de la mancha. </li><li> Copiar los valores y restar la intensidad de fondo de la mancha de la fluorescencia de la mancha. Los valores ahora pueden ser analizados estadísticamente. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La principal ventaja de nuestro protocolo es la sencillez del procedimiento sin daño perceptible a la morfología de la estructura celular. Varias medidas han sido optimizados para C. FISH elegans en este protocolo. Los pasos críticos para el éxito FISH incluyen el etiquetado de las sondas, la fijación de los embriones y la penetración. método de marcaje con digoxigenina-dUTP proporciona un método fácil de usar etiquetado por PCR o de la mella. Para etiquetar secuencia diana de largo, se prefiere la mel...

Los telómeros protege extremos cromosómicos de fusión aberrante y la degradación. los telómeros de los mamíferos está compuesto por G-ricos repite hexameric, TTAGGG, y complejos shelterin. La secuencia de los telómeros de repetición del nematodo es similar a los de los mamíferos (TTAGGC). La mayoría de los eucariotas utilizan telomerasa añadir repeticiones teloméricas a sus extremos cromosómicos. Sin embargo, 10 - 15% de las células cancerosas utilizan telomerasa mecanismo independiente, conocido como alternativa alargamiento de los telómeros (ALT) 3. Anteriormente, se informó de que las repeticiones de los telómeros y sus secuencias asociadas, nombradas como TALT, se amplificaron en los telómeros de las líneas mutantes de telomerasa que sobrevivieron a la esterilidad crítico 2. Longitud de los telómeros se midió por PCR cuantitativa o por transferencia de Southern, que proporciona duración media de los telómeros totales 4,5,6,7. Leer recuento de repetición del telómero en toda la secuenciación del genoma de datos es también un indicador del contenido de los telómeros en total 8. Aunque el pecadoGLE Análisis de la longitud del telómero (ESTELA) podría proporcionar la longitud de los telómeros una sola, no puede proporcionar la información espacial de los telómeros 9. Mientras POT-1 :: proteína indicadora mCherry proporciona la información espacial de los telómeros in vivo, no se representan las longitudes de los telómeros de doble cadena, como POT-1 es una proteína de una sola hebra de unión 10 de los telómeros. Mientras que los métodos antes mencionados proporcionan la información promediada de secuencias repetitivas, hibridación in situ fluorescente (FISH) permite observar la cantidad y el patrón espacial de las secuencias individuales de interés en una escala cromosómica. En lugar de la purificación del ADN, los tejidos o las células se fijan para preservar la información espacial nativa en FISH. Por lo tanto, el pescado es una herramienta cuantitativa y cualitativa para la observación de secuencias repetidas individuales, tales como repeticiones de los telómeros. Este protocolo proporciona un método eficiente para la detección simultánea de ambos telomeros y otras repeticiones por motivos de mejora de los métodos descritos anteriormente 11,12. C. elegans larvas o adultos organismo multicelular con células altamente diferenciadas. La heterogeneidad de las células impide en el análisis cuantitativo de un gran número de puntos de los telómeros. Para maximizar el número de células analizadas, los embriones se aíslan y se extendió sobre los portaobjetos recubiertos con polilisina para los peces. Además, este protocolo también se puede combinar con inmunofluorescencia. Como prueba de que funciona el protocolo, se muestra que es posible observar y cuantificar dos secuencias repetitivas diferentes. sonda de ADN contra TALT1 se generó con PCR simple incorporación de digoxigenina-dUTP. A continuación, esta sonda TALT1 y la sonda PNA telómero marcado con fluorescencia se hibridaron simultáneamente. Posteriormente, digoxigenina se detectó mediante métodos de inmunofluorescencia canónicas. Presentamos aquí las imágenes representativas cuando las TALT1 colocalized con el telómero en TRT-1 </em&gt; sobrevivientes.

<table><tbody><tr><td>Sonda PNA</td><td>PANAGENE</td> pedido <td>personalizado</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenina-Fluoresceína, Fab fragmentos</td><td>Roche</td><td>11207741910</td><td>uso 1:200 diluido en PBST</td></tr><tr><td>Digoxigenina-dUTP</td><td>Roche</td><td>11573152910</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-6148</td><td>preparar paraformaldehído al 4% calentándolo en DW con unas gotas de NaOH. agregue 0.1 volumen de 10x PBS.</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr>Solución <td></td><td></td> de<td>hibridación</td><td>3x SSC, 50% formamida, 10% (p/v) de sulfato de dextrano, 50 &#956; g/ml de heparina, 100 &#956; g/ml de ARNt de levadura, 100 &#956; g/ml esperma de salmón sonicado ADN</td></tr><tr><td>Hibridación solución</td><td></td><td></td> de lavado <td>2x SSC, 50%</td></tr><tr><td>formamida Formamida</td><td>BIONEER</td><td>C-9012</td><td></td></tr><tr><td>tóxico Metanol</td><td>Carlo Erba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Carlo Erba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H3393</td><td>hacer 10 mg/ml para solución madre</td></tr><tr><td>Sulfato</td> <td>de dextranoSIGMA-ALDRICH</td><td>67578</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td></td><td></td><td>para 1 L DW : 80 g NaCl, 2,0 g KCl, 27 g Na2HPO4&#8226; 7H2O, 2,4 g KH2PO</td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>1x PBS, 0,1% tween-20</td></tr><tr><td>Polisorbato 20</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-2287</td><td>El nombre comercial es Tween-20</td></tr><tr><td>Solución de poli-L-lisina (0,1% p/v)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-8920</td><td>preparar una solución fresca al 0,01% p/v antes de usar</td></tr><tr><td>M9</td><td></td><td></td><td>3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M de MgSO4, H2O a 1 L</td></tr><tr><td>de solución</td><td></td><td></td> blanqueadora <td>Hipoclorito de sodio al 20%, 0,5 M TAMPÓN</td></tr> de <tr><td>anticuerpos</td><td></td><td></td> KOH <td>1x PBST, 1 mM EDTA, 0,1% BSA, 0,05% Azida sódica (tóxica)</td></tr><tr><td>Solución</td><td></td><td></td> bloqueante <td>Tampón de anticuerpos con 5% albúmina sérica bovina (BSA)</td></tr><tr><td>illustra Microspin G-50</td><td>GE healthcare</td><td>27-53310-01</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td></td><td></td><td>Para hacer 1 L, 175,3 g de NaCl, 88,2 g de citrato de sodio, H2O a 1 L, ajustar el pH a 7.0</td></tr><tr><td>2x SSCT</td><td></td><td></td><td>2x SSC, 0.1% tween-20</td></tr><tr><td>10x mezcla de digoxigenina-dUTP</td><td></td><td></td><td>1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP</td></tr><tr><td>Columnas de purificación de PCR</td><td>Cosmo genetech</td><td>CMR0112</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador de cristales / ULTRA CLEAN</td><td>Dukssan pure chemicals</td><td>8AV721</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio multipocillo</td><td>MP biomedicals</td><td></td><td></td>96041205</tr><tr><td>Medios</td><td></td><td></td> de crecimiento de nematodos <td>Para hacer 1 L, 3 g de NaCl, 17 g de agar, 2,5 g de peptona, H2O a 974 ml. Autoclave y enfriar el matraz. Añadir 1 ml de 1 M de CaCl2, 1 ml de 4 mg/ml de colesterol en etanol, 1 ml de 1 M de MgSO4, 25 ml de 1 M KPO4.</td></tr>Como lente de objetivo se utilizó <tr><td>Levamisol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>196142</td><td></td></tr><tr><td>Razor</td><td>Feather</td><td>blade No. 11</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Enzynomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microsope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>EC Plan-Neofluar 100X.</td></tr><tr><td>Cámara húmeda</td><td></td><td></td><td>Caja de plástico llena de toalla de papel empapada en</td></tr><tr><td>DW Image Analysis Software&nbsp;</td><td>Dr. Peter Landsdorp</td><td>TFL-telo</td><td><a href="http://www.flintbox.com/public/project/502">http://www.flintbox.com/public/project/502</a></td></tr></tbody></table>

la observación y cuantificación de los telómeros y las secuencias repetitivas usando fluorescencia<em&gt; in situ</em&gt; la hibridación (fish) con sondas de pna en<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

El telómero es una estructura de ribonucleoproteína que protege los extremos cromosómicos de la fusión y degradación aberrantes. La longitud de los telómeros se mantiene mediante la telomerasa o una vía alternativa, conocida como alargamiento alternativo de los telómeros (ALT)1. Recientemente, C. elegans ha surgido como un organismo modelo multicelular para el estudio de los telómeros y ALT2. La visualización de secuencias repetitivas en el genoma es fundamental para comprender la biología de los telómeros. Si bien la longitud de los telómeros se puede medir mediante un ensayo de fragmentos de restricción de telómeros o una PCR cuantitativa, estos métodos solo proporcionan la longitud promedio de los telómeros. Por el contrario, la hibridación fluorescente in situ (FISH) puede proporcionar la información de los telómeros individuales en las células. Aquí, proporcionamos protocolos y resultados representativos del método para determinar la longitud de los telómeros de C. elegans mediante hibridación fluorescente in situ. Este método proporciona un procedimiento in situ simple, pero poderoso, que no causa daños notables a la morfología. Mediante el uso de ácido nucleico peptídico marcado con fluorescencia (PNA) y una sonda marcada con digoxigenina-dUTP, pudimos visualizar dos secuencias repetitivas diferentes: repeticiones de telómeros y molde de ALT (TALT) en embriones y gónadas de C. elegans.

Se informó anteriormente que la sobreviviente ALT puede surgir de la telomerasa mutante deficiente, TRT-1 (ok410), en baja frecuencia mediante la replicación internamente localizada &#39;Plantilla de ALT&#39; (TALT) secuencias para el mantenimiento de los telómeros 2. El uso de sonda de APN, hemos sido capaces de visualizar los telómeros en las gónadas disecados (Figura 2A). La señal débil de los telómeros se detectó tanto en TRT-1 (ok410) y ...

Reportamos un procedimiento conciso de hibridación fluorescente in situ (FISH) en la gónada y embriones de Caenorhabditis elegans para observar y cuantificar secuencias repetitivas. Observamos y cuantificamos con éxito dos secuencias repetitivas diferentes, las repeticiones de telómeros y la plantilla de alargamiento alternativo de telómeros (TALT).

La observación y cuantificación de los telómeros y las secuencias repetitivas usando fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación (FISH) con sondas de PNA en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

El objetivo general de esta técnica de hibridación fluorescente in situ es analizar de forma concisa el número y la longitud de los telómeros en C. elegans. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la reorganización tumoral, el alargamiento alternativo de los telómeros y la senescencia celular. La principal ventaja de esta técnica es que los procedimientos son concisos y los telómeros pueden visualizarse y cuantificarse en menos de 24 horas.Recolecte los gusanos adultos grávidos con un poco de medio líquido sin restos en un tubo de 15 mililitros. Lave ahora los gusanos tres veces siguiendo el siguiente procedimiento. Añada tampón M9 hasta alcanzar un volumen total de 15 mililitros.Luego, centrifugue el tubo a 300 G durante tres minutos y deseche la solución que queda por encima del sedimento de gusanos. A continuación, repita el proceso. Si después de la centrifugación los gusanos flotan, reduzca la fuerza de frenado de la centrífuga.Después del tercer lavado, deje los gusanos con 5 mililitros de M9. A continuación, agregue 6,5 mililitros de agua destilada, dos mililitros de hipoclorito y un mililitro de hidróxido de potasio cinco molar. Incube los gusanos en esta solución blanqueadora durante tres minutos con agitación de 50 RPM. Luego, vortexee los gusanos para romperlos y liberar sus huevos.Bajo un microscopio de disección, busque los huevos liberados. Si aún no se han liberado, continúe la incubación hasta por ocho minutos. Si los gusanos están mayormente disueltos y los huevos están libres, complete el tubo hasta 15 mililitros con M9 y lave los huevos tres veces, tal como se lavaron los gusanos anteriormente.A los huevos lavados, con la mayor parte del M9 eliminado, complete el volumen hasta 500 microlitros con PBST y luego agregue 500 microlitros de PFA al 4%. Ahora cargue alícuotas de 40 microlitros de huevos en PFA al 2% en los pocillos de portaobjetos recubiertos con polilisina. A continuación, transfiera los portaobjetos a una cámara humedecida y deje que incuben durante 15 minutos a temperatura ambiente.Para este protocolo, tenga un bloque de aluminio sobre hielo seco almacenado a 80 grados Celsius. Además, tenga metanol y acetona almacenados a 20 grados Celsius. Después de completar el paso de fijación, retire la mayor parte de la solución de PFA de los portaobjetos, dejando aproximadamente cinco microlitros.Luego, coloque un segundo portaobjetos recubierto con polilisina sobre cada muestra de portaobjetos de modo que las dos superficies recubiertas queden adheridas, atrapando los tejidos en el pozo. Si hay exceso de fijador, retírelo con un papel absorbente. Ahora, congele los portaobjetos colocándolos sobre el bloque de aluminio frío durante al menos 15 minutos.Mientras tanto, prepare baños de metanol y acetona sobre hielo para los portaobjetos. Una vez que los portaobjetos estén congelados, gire uno para fracturar por congelación la muestra. Deseche el portaobjetos superior y sumerja el portaobjetos inferior en metanol frío con hielo durante cinco minutos.Haga esto con todas las muestras. La fractura por congelación permite la penetración de sondas y anticuerpos a través del cascarón duro del huevo. Si los huevos se fracturan adecuadamente por congelación, podrá ver los huevos en ambos portaobjetos.Después de al menos cinco minutos en metanol, pase las laminillas a acetona fría durante cinco minutos. Transcurridos otros cinco minutos, sumerja las muestras en PBST tres veces durante cinco minutos por baño. Después de los lavados con PBST, las laminillas pueden almacenarse en etanol al 100 % a cuatro grados centígrados durante varios días.Para continuar, agregue 20 microlitros de solución de RNasa a los pocillos de la muestra e incúbelos en una cámara humedecida a 37 grados Celsius durante una hora. A continuación, lave los portaobjetos en SSCT 2x dos veces durante 15 minutos por cada lavado. Después de los dos lavados, agregue 20 microlitros de solución de hibridación a las muestras e incúbelas a 37 grados Celsius durante una hora en una cámara humedecida.Mientras tanto, prepare la sonda para una sonda de ADN bicatenario. Desnaturalícela a 95 grados Celsius durante cinco minutos y luego enfríela brevemente en hielo. Después de una hora, aspire la solución de hibridación y agregue la solución de sonda.A partir de este paso, proteja la muestra de la luz. Después de agregar la sonda, cubra las muestras con cubreobjetos de vidrio. Luego, prepare una cámara humidificada sobre un bloque calefactor a 80 grados Celsius.Cuando el bloque térmico se haya estabilizado nuevamente a 80 grados Celsius, coloque las laminillas de muestra en la cámara calentada y déjelas desnaturalizar durante tres minutos. A continuación, incube todas las laminillas procesadas en una cámara humedecida a 37 grados Celsius durante la noche. Después de la incubación nocturna, lave las muestras en PBST a temperatura ambiente durante cinco minutos.Como preparación, caliente la solución de hibridación a 37 grados Celsius una hora antes del lavado. Luego cargue los portaobjetos en un frasco con solución de lavado de hibridación e incube durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Para eliminar la solución de hibridación, lave las muestras con PBST a temperatura ambiente durante 15 minutos.Realice esto tres veces. Después de aspirar el último lavado con PBST, agregue 20 microlitros de solución bloqueante a cada muestra e incúbelas en cámaras humedecidas a temperatura ambiente durante una hora en la oscuridad. Luego, aspire la solución bloqueante y sustitúyala por la solución de anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con FITC al uno a 200.Cubra los portaobjetos e incúbelos a temperatura ambiente durante tres horas en la oscuridad. Después de la tinción con anticuerpo, lave las muestras dos veces con PBST durante 15 minutos por lavado en la oscuridad. A continuación, aspire el PBST y reemplácelo con 10 microlitros de solución de montaje que contenga DAPI.Coloque un cubreobjetos y absorba cualquier exceso de solución. Finalmente, selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas y proceda a observar las muestras bajo un microscopio fluorescente. Utilizando la sonda PNA, se observaron los telómeros de animales que sobrevivieron una mutación suficiente en telómeros.En las gónadas, es posible cuantificar el número de telómeros por núcleo. La señal de los telómeros se localizó conjuntamente con una señal de TALT1, lo que respalda la idea de que TALT1 es responsable de la supervivencia sin telómeros. La intensidad de la señal de los telómeros se comparó utilizando software.La señal fue más intensa en los supervivientes ALT que en las cepas parentales utilizadas para generar los mutantes deficientes en telómeros. No olvide que el trabajo con paraformaldehído y formamida puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes, al realizar este procedimiento.

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La observación y cuantificación de los telómeros y las secuencias repetitivas usando fluorescencia

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