La observación y cuantificación de los telómeros y las secuencias repetitivas usando fluorescencia
4 de agosto de 2016
Reportamos un procedimiento conciso de hibridación fluorescente in situ (FISH) en la gónada y embriones de Caenorhabditis elegans para observar y cuantificar secuencias repetitivas. Observamos y cuantificamos con éxito dos secuencias repetitivas diferentes, las repeticiones de telómeros y la plantilla de alargamiento alternativo de telómeros (TALT).
El objetivo general de esta técnica de hibridación fluorescente in situ es analizar de forma concisa el número y la longitud de los telómeros en C. elegans. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la reorganización tumoral, el alargamiento alternativo de los telómeros y la senescencia celular. La principal ventaja de esta técnica es que los procedimientos son concisos y los telómeros pueden visualizarse y cuantificarse en menos de 24 horas.
Recolecte los gusanos adultos grávidos con un poco de medio líquido sin restos en un tubo de 15 mililitros. Lave ahora los gusanos tres veces siguiendo el siguiente procedimiento. Añada tampón M9 hasta alcanzar un volumen total de 15 mililitros.
Luego, centrifugue el tubo a 300 G durante tres minutos y deseche la solución que queda por encima del sedimento de gusanos. A continuación, repita el proceso. Si después de la centrifugación los gusanos flotan, reduzca la fuerza de frenado de la centrífuga.
Después del tercer lavado, deje los gusanos con 5 mililitros de M9. A continuación, agregue 6,5 mililitros de agua destilada, dos mililitros de hipoclorito y un mililitro de hidróxido de potasio cinco molar. Incube los gusanos en esta solución blanqueadora durante tres minutos con agitación de 50 RPM. Luego, vortexee los gusanos para romperlos y liberar sus huevos.
Bajo un microscopio de disección, busque los huevos liberados. Si aún no se han liberado, continúe la incubación hasta por ocho minutos. Si los gusanos están mayormente disueltos y los huevos están libres, complete el tubo hasta 15 mililitros con M9 y lave los huevos tres veces, tal como se lavaron los gusanos anteriormente.
A los huevos lavados, con la mayor parte del M9 eliminado, complete el volumen hasta 500 microlitros con PBST y luego agregue 500 microlitros de PFA al 4%. Ahora cargue alícuotas de 40 microlitros de huevos en PFA al 2% en los pocillos de portaobjetos recubiertos con polilisina. A continuación, transfiera los portaobjetos a una cámara humedecida y deje que incuben durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Para este protocolo, tenga un bloque de aluminio sobre hielo seco almacenado a 80 grados Celsius. Además, tenga metanol y acetona almacenados a 20 grados Celsius. Después de completar el paso de fijación, retire la mayor parte de la solución de PFA de los portaobjetos, dejando aproximadamente cinco microlitros.
Luego, coloque un segundo portaobjetos recubierto con polilisina sobre cada muestra de portaobjetos de modo que las dos superficies recubiertas queden adheridas, atrapando los tejidos en el pozo. Si hay exceso de fijador, retírelo con un papel absorbente. Ahora, congele los portaobjetos colocándolos sobre el bloque de aluminio frío durante al menos 15 minutos.
Mientras tanto, prepare baños de metanol y acetona sobre hielo para los portaobjetos. Una vez que los portaobjetos estén congelados, gire uno para fracturar por congelación la muestra. Deseche el portaobjetos superior y sumerja el portaobjetos inferior en metanol frío con hielo durante cinco minutos.
Haga esto con todas las muestras. La fractura por congelación permite la penetración de sondas y anticuerpos a través del cascarón duro del huevo. Si los huevos se fracturan adecuadamente por congelación, podrá ver los huevos en ambos portaobjetos.
Después de al menos cinco minutos en metanol, pase las laminillas a acetona fría durante cinco minutos. Transcurridos otros cinco minutos, sumerja las muestras en PBST tres veces durante cinco minutos por baño. Después de los lavados con PBST, las laminillas pueden almacenarse en etanol al 100 % a cuatro grados centígrados durante varios días.
Para continuar, agregue 20 microlitros de solución de RNasa a los pocillos de la muestra e incúbelos en una cámara humedecida a 37 grados Celsius durante una hora. A continuación, lave los portaobjetos en SSCT 2x dos veces durante 15 minutos por cada lavado. Después de los dos lavados, agregue 20 microlitros de solución de hibridación a las muestras e incúbelas a 37 grados Celsius durante una hora en una cámara humedecida.
Mientras tanto, prepare la sonda para una sonda de ADN bicatenario. Desnaturalícela a 95 grados Celsius durante cinco minutos y luego enfríela brevemente en hielo. Después de una hora, aspire la solución de hibridación y agregue la solución de sonda.
A partir de este paso, proteja la muestra de la luz. Después de agregar la sonda, cubra las muestras con cubreobjetos de vidrio. Luego, prepare una cámara humidificada sobre un bloque calefactor a 80 grados Celsius.
Cuando el bloque térmico se haya estabilizado nuevamente a 80 grados Celsius, coloque las laminillas de muestra en la cámara calentada y déjelas desnaturalizar durante tres minutos. A continuación, incube todas las laminillas procesadas en una cámara humedecida a 37 grados Celsius durante la noche. Después de la incubación nocturna, lave las muestras en PBST a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Como preparación, caliente la solución de hibridación a 37 grados Celsius una hora antes del lavado. Luego cargue los portaobjetos en un frasco con solución de lavado de hibridación e incube durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Para eliminar la solución de hibridación, lave las muestras con PBST a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Realice esto tres veces. Después de aspirar el último lavado con PBST, agregue 20 microlitros de solución bloqueante a cada muestra e incúbelas en cámaras humedecidas a temperatura ambiente durante una hora en la oscuridad. Luego, aspire la solución bloqueante y sustitúyala por la solución de anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con FITC al uno a 200.
Cubra los portaobjetos e incúbelos a temperatura ambiente durante tres horas en la oscuridad. Después de la tinción con anticuerpo, lave las muestras dos veces con PBST durante 15 minutos por lavado en la oscuridad. A continuación, aspire el PBST y reemplácelo con 10 microlitros de solución de montaje que contenga DAPI.
Coloque un cubreobjetos y absorba cualquier exceso de solución. Finalmente, selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas y proceda a observar las muestras bajo un microscopio fluorescente. Utilizando la sonda PNA, se observaron los telómeros de animales que sobrevivieron una mutación suficiente en telómeros.
En las gónadas, es posible cuantificar el número de telómeros por núcleo. La señal de los telómeros se localizó conjuntamente con una señal de TALT1, lo que respalda la idea de que TALT1 es responsable de la supervivencia sin telómeros. La intensidad de la señal de los telómeros se comparó utilizando software.
La señal fue más intensa en los supervivientes ALT que en las cepas parentales utilizadas para generar los mutantes deficientes en telómeros. No olvide que el trabajo con paraformaldehído y formamida puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes, al realizar este procedimiento.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Resumen
Este artículo presenta una técnica concisa de hibridación fluorescente in situ (FISH) para analizar la longitud y el número de telómeros en Caenorhabditis elegans. El método permite la visualización y cuantificación de repeticiones teloméricas y del alargamiento alternativo de telómeros (TALT) en menos de 24 horas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Genética
Antecedentes
- Los telómeros protegen los extremos de los cromosomas y son fundamentales en el envejecimiento celular.
- Comprender la dinámica de los telómeros es importante para la investigación del cáncer.
- La hibridación fluorescente in situ (FISH) es una herramienta poderosa para visualizar material genético.
- Caenorhabditis elegans sirve como organismo modelo para estudios genéticos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un procedimiento conciso de FISH para C. elegans.
- Cuantificar la longitud y el número de telómeros en un breve período de tiempo.
- Investigar el papel de los telómeros en la regeneración tumoral y la senescencia celular.
Métodos Utilizados
- Recolección de adultos grávidos de C. elegans en medio líquido.
- Lavado de gusanos con tampón M9 para prepararlos para la FISH.
- Aplicación de la FISH para visualizar las secuencias teloméricas.
- Cuantificación de repeticiones teloméricas y TALT.
Resultados principales
- Visualización exitosa de repeticiones teloméricas en C. elegans.
- Se logró la cuantificación de dos secuencias repetitivas diferentes.
- Se demostró la eficacia de la técnica FISH en un corto período de tiempo.
- Proporcionó información sobre la biología de los telómeros relevante para la investigación del cáncer.
Conclusiones
- El método FISH desarrollado es eficiente para estudiar los telómeros en C. elegans.
- Esta técnica puede facilitar la investigación sobre enfermedades relacionadas con los telómeros.
- Estudios futuros pueden ampliar las implicaciones de la dinámica de los telómeros.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método de FISH permite la visualización directa y la cuantificación de la dinámica de los telómeros en un modelo multicelular, apoyando la validación de objetivos en la biología de los telómeros y en las vías de alargamiento alternativo. Al proporcionar una resolución a nivel de célula individual de secuencias repetitivas, mejora la confianza predictiva en estudios mecanicistas de la estabilidad genómica y la senescencia celular. El enfoque ofrece un ensayo rápido que preserva la morfología, adecuado para flujos de trabajo de descubrimiento temprano centrados en objetivos relacionados con los telómeros.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar los mecanismos de mantenimiento de los telómeros, incluida la actividad de la vía ALT, para validar hipótesis terapéuticas.
- Valor operativo: Proporciona mediciones cuantitativas del número y longitud de los telómeros por núcleo para la evaluación funcional del objetivo.
- Valor predictivo: Facilita la evaluación alineada con biomarcadores de la inestabilidad genómica en sistemas relevantes para la enfermedad.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera señales estandarizadas y reproducibles de FISH para secuencias teloméricas y TALT, permitiendo la preparación del ensayo.
- Valor operativo: Proporciona resultados cuantitativos de imágenes compatibles con tuberías de análisis de alto contenido.
- Escalabilidad: Facilita la preparación de sistemas biológicos validados para cribado de compuestos en etapas posteriores.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Relaciona la visualización de telómeros con la actividad ALT, lo que apoya la reducción mecanicista de riesgos en modelos preclínicos.
- Continuidad traslacional: Permite la correlación de señales de telómeros con la co-localización de TALT1 para la validación de vías.
- Avance ajustado al riesgo: Apoya decisiones de avance o interrupción basadas en la dinámica de los telómeros en contextos relevantes para la enfermedad.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en flujos de trabajo desde el descubrimiento temprano hasta la fase preclínica, proporcionando la cuantificación de telómeros que informa sobre la confianza en el blanco y la validación de rutas antes de la optimización del fármaco líder.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la regulación de la longitud de los telómeros y el mecanismo ALT en C. elegans.
- Tamizaje: Proporciona señales cuantitativas y reproducibles de telómeros para la estandarización de ensayos y la evaluación de compuestos.
- Análisis: Permite la comparación basada en intensidad de las señales de telómeros mediante software de análisis de imágenes para lecturas objetivas.
- Investigación Traducional: Conecta la dinámica de los telómeros con la actividad de la vía ALT mediante la co-localización de TALT1 para obtener información mecanicista.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad FISH reutilizable para el análisis de telómeros y secuencias repetitivas en diversos proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la biología de los telómeros, validación de objetivos y reducción de la ambigüedad mecanicista en los mecanismos ALT.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad de la cuantificación de telómeros en muestras fijadas.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas en programas dirigidos a los telómeros.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo basada en la validación del mecanismo de mantenimiento de los telómeros.
Consideraciones de Implementación
- Experiencia en microscopía de fluorescencia, hibridación de sondas y preparación de muestras en montaje completo de C. elegans.
- Requisito de portaobjetos recubiertos con polilisina, cámaras humedecidas y sistemas de incubación con control de temperatura.
- Necesidad de manipulación de sondas de PNA, tratamiento con RNasa y pasos de amplificación de señal basados en anticuerpos.
- Consideraciones para la adaptación a diferentes sistemas modelo o tipos de tejidos más allá de embriones y gónadas.
- Las limitaciones prácticas incluyen la manipulación de reactivos peligrosos (paraformaldehído, formamida) y la necesidad de protección contra la luz durante la hibridación.
