El examen de los telómeros G-Estructura en voladizo Trypanosoma brucei

El objetivo general del siguiente experimento es examinar la estructura del saliente G de los telómeros. En las celdas de la trampa brucey. La hibridación nativa en gel utiliza una sonda de oligonucleótido específica de secuencia para hibridarse a la región monocatenaria del telómero en la condición nativa.

Esta región monocatenaria es la región saliente del telómero G y, por lo tanto, la cantidad de sonda de oligonucleótido hibridada representa su adaptador de longitud. La ligadura permite determinar la secuencia final del saliente G del telómero cuando se marca el oligonucleótido único. Este método implica la ligadura de un adaptador de secuencia específica al final de la estructura de saliente del telómero G para el ensayo de extensión primaria mediada por ligadura.

El oligonucleótido guía se marca en los extremos y se conecta anal al oligonucleótido único antes de que se lige a los extremos del cromosoma. Después de la ligadura, la extensión primaria se realiza utilizando la ADN polimerasa T cuatro. La longitud del saliente G se puede determinar ya que el producto es n menos seis nucleótidos más largo que el voladizo G real, donde N representa la longitud del oligo guía en el adaptador.

Hola, soy bi Bo, profesor asistente en el Departamento de Ciencias Biológicas, Geológicas y Ambientales de la Universidad Estatal de Cleveland. Hola, soy Gio. Soy estudiante de posgrado en el laboratorio del Dr. Lee, y hoy les vamos a mostrar un procedimiento para analizar la estructura de la madeja geográfica.

Utilizamos este procedimiento para estudiar la estructura y las funciones de los telómeros en Trapasso mientras trabajamos con radiactividad. Al igual que en este experimento, es necesario tomar las precauciones de seguridad adecuadas. Se debe consultar al departamento institucional de salud y seguridad ambiental antes de intentarlo.

En este video, algunos de estos precursores están ausentes solo con fines de demostración. Así que comencemos. El principio de esta parte del procedimiento es que, en condiciones nativas, una sonda tell C no etiquetada comprendía cuatro repeticiones de C-C-C-T-A.

Un oligonucleótido solo puede hibridarse con la región saliente del telómero G monocatenario. Por lo tanto, la intensidad de hibridación es proporcional a la longitud del voladizo. Después de la desnaturalización y neutralización, la misma sonda podrá hibridarse a toda la región de los telómeros.

La intensidad de esta hibridación representa la cantidad total de ADN de los telómeros y se utiliza como control de carga. El nivel final de voladizo G se puede calcular dividiendo la señal de hibridación nativa por la obtenida después de la desnaturalización. Este procedimiento comienza con una separación de cromosomas intactos por electroforesis de gel de campo pasada o PFGE, que requiere que el ADN genómico se prepare en tapones agros para evitar el cizallamiento mecánico del ADN para lograr este primer punto de fusión bajo disuelto, o LMP agros en tampón L al 1,6% manteniéndolo caliente a 50 grados Celsius, luego cosecha 200 millones de células T brucey por centrifugación.

Retire el supinato y vuelva a suspender el pellet celular con tampón L hasta una concentración final de 5 millones de células por mililitro. Incubar la suspensión celular entre 42 y 50 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, añada un volumen de 1,6%LMP a un volumen de células y mezcle rápidamente 85 microlitros de la suspensión de células en cada pocillo de un molde de tapón desechable.

Una vez que los tapones estén solidificados, transfiéralos a un tubo cónico de 15 mililitros con cinco mililitros de tampón L y celda de sarco al 1%. Agrega una pizca de proteinasa K en polvo. Mezclar bien e incubar a 50 grados centígrados durante 48 horas.

Después de la incubación, deseche el tampón y lave los tapones con cinco mililitros de tampón L dos veces. A continuación, repita la digestión de la proteinasa K en el golpe de tampón L SAR caol durante otras 48 horas. Lave los tapones con tampón L nuevo nuevamente y guárdelos a cuatro grados centígrados en tampón L.

Estos tapones deben usarse dentro de las dos semanas. Prepare el gel agros con los tapones de ADN como se describe en el protocolo escrito. A continuación, ejecute el gel en una unidad chef DR de dos.

Siguiendo PFGE, el gel se tiñe des stain photograph y se seca. Una vez que el gel esté seco, coloque el gel en una bolsa de hibridación y agregue 20 mililitros de tampón de prehibridación. Retire la mayor cantidad de aire posible de la bolsa y selle la bolsa.

Incubar la bolsa de hibridación en un baño de agua a 50 grados centígrados con un suave balanceo durante al menos una hora mientras se prehibrida la etiqueta de gel. Las sondas oligonucleótricas incuban la reacción a 37 grados centígrados durante una hora. A continuación, añada 90 microlitros de tampón TNES a la mezcla de reacción.

Para purificar la sonda etiquetada, cargue la sonda en la parte superior de una columna G 25 prefabricada. Lavar con 700 microlitros de tampón TNAS y eluir la sonda en 600 microlitros. Después de la prehibridación en gel, hierva la sonda etiquetada durante cinco minutos y agréguela a 25 mililitros de tampón de prehibridación fresco.

Para hacer el tampón de hibridación, retire el tampón de prehibridación del filtro de mangas. Esterilice la mezcla de hibridación con un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros y agréguela directamente a la bolsa de hibridación. Selle la bolsa y colóquela en un recipiente poco profundo con agua tibia.

Coloque todo el recipiente en el baño de agua a 50 grados centígrados e incube durante la noche con un suave balanceo. Al día siguiente, corte una pequeña abertura en la bolsa de hibridación en un tubo cónico de 50 mililitros. Vierte la mayor cantidad posible de la mezcla de hibridación.

Mantenga la sonda congelada a menos 20 grados centígrados. Retire el gel de la bolsa de hibridación y colóquelo en un recipiente, lave y seque el gel como se describe en el protocolo escrito. Una vez seco, envuelva el gel con una envoltura de plástico y expongalo a un generador de imágenes de fósforo durante aproximadamente tres días.

Después de tres días, escanee el generador de imágenes de fósforo para realizar la hibridación después de la desnaturalización. Comience incubando el gel en tampón desnaturalizante a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, lave el gel y el tampón de neutralización durante 30 minutos.

A continuación, enjuague el gel en agua destilada durante tres minutos. Hibridar previamente el gel a 55 grados centígrados durante una hora. Repita la hibridación utilizando la misma sonda que contiene la mezcla de hibridación que antes, pero a 55 grados centígrados durante la noche después de la hibridación.

Lava y seca el gel como antes. A continuación, envuelva el gel y expóngalo a un generador de imágenes de fósforo durante aproximadamente dos horas. Escanee el generador de imágenes de fósforo Finalmente, normalice la señal de hibridación obtenida antes de la desnaturalización con la obtenida después de la desnaturalización.

En esta parte del procedimiento, la T, el mero nucleótido terminal, se determina mediante ligadura adaptadora. El oligonucleótido único está marcado en el extremo anil de los oligonucleótidos guía y ligado al extremo de los telómeros. Solo cuando el adaptador de guía único tiene un voladizo de tres puntos principales que es compatible con la secuencia de telómeros terminales, se ligará el adaptador.

Para T brucey. Los telómeros pueden terminar en uno de los seis nucleótidos diferentes del TT, se repite una GGG. Por lo tanto, se utilizan seis oligonucleótidos guía diferentes para comenzar este proceso.

Trate el oligonucleótido único con quinasa mezclando seis microlitros de 10 mol por microlitro de oligonucleótido único con tres microlitros de tampón 10 veces PNK, cinco microlitros de gamma P 32 A TP, 14 microlitros de agua destilada doble y dos microlitros de T cuatro PNK. Incubar la mezcla a 37 grados centígrados durante una hora. A continuación, utilice el kit de extracción rápida de nucleótidos para kayak para eliminar el TP y el eluido del A caliente no incorporado.

El oligo marcado con 60 microlitros de tampón de elución. Para obtener una concentración final de aproximadamente un P mol por microlitro para crear el adaptador se arrodilla el oligo único al oligo guía. Añadir 10 microlitros de oligo único purificado a dos microlitros de cada oligonucleótido guía y un microlitro de un tampón arrodillado.

Coloque los tubos en un bloque de calor a 85 grados centígrados y apague el bloque de calor. Deje que los tubos y el bloque de calor se enfríen a la temperatura RI durante unas horas. A continuación, ligar los adaptadores al ADN genómico total.

Incubar la mezcla a 16 grados centígrados en una máquina de PCR durante la noche. Después de una incubación durante la noche, realice una digestión de endonucleasas de restricción como se describe en el protocolo escrito. Agregue tres microlitros de colorante 10 veces naranja G a cada muestra.

Cargue las muestras de ADN en un gel de 20 por 20 centímetros 0.7%agros. Deje correr el gel a 30 voltios durante 30 minutos. Luego continúe con un voltaje más alto, manteniendo el voltaje por debajo de 120 voltios para un total de 1000 voltios en una hora.

Una vez que el gel se haya ejecutado, escanee el gel de tinte de bromuro AUM con el escáner de tifones. Finalmente, seque el gel agros y exponga el gel seco al generador de imágenes de fósforo durante la noche. En la extensión del cebador mediada por ligadura, el oligonucleótido guía se marca en el extremo y se une al oligonucleótido único antes de que se lige solo a los extremos del cromosoma.

El adaptador de guía único que lleva un voladizo de tres cebadores compatible con el voladizo G estará ligado. Después de la eliminación de los pares de oligonucleasas no ligados, la extensión primaria se puede llevar a cabo con la ADN polimerasa T cuatro, que carece de desplazamiento de la hebra y actividad endonucleasa de cinco primos a tres primos. Por lo tanto, la longitud final del oligo guía extendido refleja la longitud del voladizo G.

Para comenzar la ligadura mediada por la ligadura de cebadores quinasa, trate el oligonucleótido único y el oligonucleótido guía incube ambas mezclas a 37 grados centígrados durante 60 minutos. Aneel el oligo guía y el oligo único combinando 10 microlitros del oligo único fosforilado y 10 microlitros del oligo guía marcado en el extremo en un tubo de einor de 1,5 mililitros, Anil los oligonucleótidos y ligar la guía Anil. Adaptador único de oligonucleómeros a los extremos de los telómeros como se describió anteriormente, precipita el ADN y realiza la extensión primaria como se describe en el protocolo escrito.

Prepare un gel de TPE al 10% de acrilamida, urea de siete molares una vez para ejecutar los productos de extensión. Cargue cuatro microlitros de cada muestra prehervida con colorante agregado sobre el gel. Ejecute el gel a 800 voltios en una vez TBE hasta que el tinte azul llegue al fondo del gel.

Posteriormente, retire el gel de la placa de vidrio. Configure el secador de gel para que se mantenga a 65 grados centígrados durante 30 minutos y seque el gel, siga secándose durante 30 minutos más después de que el secador de gel vuelva a la temperatura ambiente, finalmente expuesto al generador de imágenes de fósforo durante dos horas. Se muestran cromosomas tbrc intactos separados por PFGE.

Las células T brucey normalmente contienen aproximadamente 100 copias de mini cromosomas, todos con un tamaño similar que migran a la misma posición en el gel. Debido a este hecho, después de la hibridación con la sonda de oligonucleótidos TC, la señal de saliente del telómero G es más prominente en los mini cromosomas. Después de la desnaturalización y neutralización, la hibridación con la sonda de oligonucleótidos TLC revela señales de telómeros en todos los extremos de los cromosomas.

La hibridación con la sonda de oligonucleótidos TLG normalmente no produce ninguna señal de hibridación porque las células T brucey no tienen estructuras de saliente de telómeros C. Después de la desnaturalización y neutralización, la hibridación con la sonda de oligonucleótidos Tel G también revela señales de telómeros en todos los extremos de los cromosomas. La carga de cantidades iguales de ADN en cada carril es esencial para determinar el nucleótido terminal del telómero mediante el ensayo de ligadura del adaptador y esto se demuestra mediante la tinción con bromuro de mio del gel en este protocolo, los adaptadores de oligonucleótidos únicos y oligonucleótidos guía marcados solo están ligados a los extremos del cromosoma con la secuencia de saliente del telómero g es compatible con un oligonucleómero guía.

Dado que el oligonucleótido único está marcado en el extremo, el producto de ligadura será radiactivo y emitirá una señal fuerte. El carril uno da una señal fuerte que indica que una gran cantidad de adaptador TG one único se ha ligado al extremo de los telómeros. TG uno tiene una secuencia final de C-C-C-T-A, por lo tanto, el telómero g sobresale ligado a este adaptador y es TT A GGG.

No se observa una cantidad significativa de producto de ligadura utilizando otros oligonucleótidos guía, lo que indica que los telómeros terminados en TT A GGG son predominantes en las células T brucey. La carga del oligonucleótido guía etiquetado en el extremo sirve como control negativo y marcador de tamaño sin ligadura. El oligonucleótido guía marcado en el extremo tiene una longitud de 22 nucleótidos.

La banda de unos 44 nucleótidos es probablemente el residuo no desnaturalizado del adaptador después de la ligadura al extremo del cromosoma. El tamaño del producto extendido refleja la longitud de la estructura del voladizo G. La mayoría de los voladizos de los telómeros T brucey G terminan en TT A GGG.

Sin embargo, estos salientes G parecen ser muy cortos, de unos 10 nucleótidos. Como los productos extendidos desde el TG ligado un oligo guía no son mucho más largos que el propio oligo guía, aunque solo una pequeña cantidad de adaptador TG cuatro se ligó a los extremos de los telómeros, los productos extendidos desde el TG cuatro ligado son mucho más largos, siendo el producto más largo de unos 55 nucleótidos. Por lo tanto, se observaron dos tipos de estructuras de saliente de los telómeros G en las células tbrc.

Si la ligadura es el resultado de la estructura de saliente G del telómero, el tratamiento del ADN genómico con XO one o XOT, que son nucleasas específicas de voladizo de tres principales, debería resultar en la pérdida de los productos de ligadura. Ambos tipos de estructuras de voladizo G son sensibles a este tipo de tratamiento. Acabamos de mostrarte cómo analizar la estructura giang de los telómeros en trapasso bru.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar cargar la misma cantidad de muestras en cada carril. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.