Detección sistema para la identificación de pequeñas moléculas que promueven la diferenciación celular de células de Glioblastoma de drogas basados en citometría flujo

El objetivo general de este procedimiento es examinar bibliotecas de moléculas pequeñas en busca de agentes que promuevan la diferenciación astroglial en las células madre del glioblastoma. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las células madre cancerosas, como cuáles son las vías de señalización necesarias para mantener las células madre del glioblastoma en estado indiferenciado. La ejecución adecuada de esta técnica permite la identificación directa de pequeñas moléculas que promueven la diferenciación de las células madre del glioblastoma.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento del glioblastoma de Ehlers-Danlos, ya que la reducción del porcentaje de células madre del glioblastoma puede disminuir la probabilidad de recurrencia. Este método también se puede aplicar para establecer la diferenciación en otros linajes celulares utilizando otras construcciones reporteras. Nuestro informe es el primero en establecer un enfoque de alto rendimiento para detectar agentes que obliguen a las células madre del glioma a diferenciarse.

Trabajar con partículas de lentivirus en células cancerosas derivadas de pacientes puede ser extremadamente peligroso. Por lo tanto, siempre se debe seguir el procedimiento estándar para trabajar con patógenos transmitidos por la sangre. Para empezar, siembre un millón de células madre de glioblastoma o GSC en dos mililitros de medio de crecimiento completo de células madre neurales en una placa de seis pocillos.

A continuación, transduce las células con el reportero de lentivirus a una multiplicidad de infección igual a cinco. A la mezcla de células y virus, agregue dos microlitros de policeno de manera que la concentración final sea de ocho microgramos por mililitro, e incube las células a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante la noche. Después de la incubación, reemplace el medio de crecimiento para eliminar el virus no unido.

Y centrifugar las celdas a 360 veces G durante cinco minutos. A continuación, aspire con cuidado el medio y las células de la placa en una placa de seis pocillos. Y continuar incubando las células durante 24 horas.

Coseche 0,5 mililitros del volumen total de cultivo. Células de pellets por centrifugación a 360 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Resuspenda las células en un medio de crecimiento de células madre neurales frescas de 0,5 mililitros.

Vuelva a colocar la placa en la incubadora para permitir la expansión durante al menos 72 horas. Añadir 200 microlitros de reactivo de disociación e incubar durante cinco minutos en un baño de agua a 37 grados centígrados. Disocie las células moviéndolas suavemente hacia arriba y hacia abajo.

A las células disociadas se añaden 800 microlitros de HBSS para garantizar una adhesión o agregación celular mínima. A continuación, transfiera 200 microlitros de cada suspensión celular a los pocillos de una placa de 96 pocillos múltiples. Determinar el porcentaje de células que expresan la proteína verde fluorescente por citometría de flujo.

Registre al menos 10.000 células viables en cada adquisición. En todos los análisis de citometría de flujo, utilice células parentales no transducidas o células no fluorescentes transducidas por vectores para establecer la fluorescencia basal. Para seleccionar y expandir subclones individuales de células semilla a una densidad de 0,7 células por pocillo en 100 microlitros de medio de células madre neurales en una placa de 96 pocillos.

Mantenga estos clones en cultivo durante 11 días. Busque neuroesferas con un diámetro superior a 100 micras. Previamente hemos establecido este tamaño de corte para determinar retrospectivamente si la neurosfera se originó a partir de una célula madre de glioblastoma que se renueva a sí misma.

Es posible que sea necesario optimizar este tamaño de corte cuando se trabaja con diferentes modelos de células de glioblastoma. Observe las células bajo un microscopio de fluorescencia equipado con un filtro FITC y marque los pocillos que contienen una sola neurosfera en la que aproximadamente entre el 1% y el 5% de las células son GFP positivas. Después del marcado, expanda los clones individuales hasta que haya un número suficiente de células disponibles para el análisis de citometría de flujo.

Suponiendo que los clones reporteros contienen entre el 1% y el 5% de células GFP positivas, recoja 0,5 mililitros de cada clon junto con una cantidad igual de células de control no transducidas para determinar el porcentaje exacto de células GFP positivas. Después de peletizar las células a 360 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente, aspire el sobrenadante. Agregue 200 microlitros de reactivo de disociación a cada pellet e incube los tubos en un baño de agua a 37 grados centígrados.

Después de la incubación, triture las células unas 20 a 30 veces para lograr una suspensión de una sola célula. A continuación, añada 800 microlitros de HBSS para garantizar una adhesión o agregación celular mínima. Ahora transfiera 200 microlitros de cada suspensión celular a los pocillos de una placa de 96 pocillos múltiples.

Por último, realice la citometría de flujo, registrando al menos 10.000 células viables en cada adquisición. Para evaluar la capacidad clonogénica, prepare suspensiones unicelulares de subclones reporteros de diferenciación triturando las células unas 20 a 30 veces. A continuación, coloque estas células en 100 microlitros de medio de crecimiento completo de células madre neurales a una densidad de aproximadamente cinco a 500 células por pocillo en placas de 96 pocillos múltiples.

Mantenga estas células en cultivo durante nueve a 11 días. Busca neuroesferas bajo un microscopio óptico. Un pozo que contiene al menos una sola neurosfera grande se considera positivo.

Teniendo en cuenta las células parentales no transducidas y las células transducidas por lentivirus positivas para GFP como entrada, el total de pocillos analizados y el número de células positivas en la interfaz en línea de ELDA. Para comenzar la detección, coloque 5000 células en 99 microlitros de medio de crecimiento completo de células madre neurales en una placa de 96 pocillos. A continuación, con una pipeta de 12 canales, trate las células con dos micromolares de concentración final de compuestos de biblioteca diluidos o con el control DMSO.

Incubar las células durante 72 horas. Ahora agregue 150 microlitros de reactivo de disociación celular usando una pipeta de 12 canales en cada pocillo e incube a 37 grados Celsius durante 20 minutos. A continuación, triture suavemente las células de cada pocillo unas 20 a 30 veces con una pipeta de 12 canales hasta conseguir una suspensión de una sola célula.

Ahora realice la citometría de flujo y determine el porcentaje de células que expresan el indicador GFAP:GFP. En primer lugar, determine el tamaño de la célula y la viabilidad a partir de las dispersiones frontales y laterales y controle la población de células viables. A continuación, determine las células GFP positivas dentro de la población de células viables.

Un aumento del porcentaje de células positivas para GFP en tres desviaciones estándar con respecto a los controles se considera un acierto positivo que puede ajustarse para adaptarse a las preferencias del usuario de rigurosidad. Se muestran imágenes representativas de subclones de HSR-GBM1 GSC que expresan niveles bajos y altos de GFAP:GFP. Los subclones positivos para la expresión de GFAP:GFP se seleccionaron mediante citometría de flujo para la línea de neurosfera derivada del paciente.

En este caso, un GFAP:GFP bajo indica que menos del 5% de las células del clon son GFP positivas, mientras que un GFAP:GFP alto indica que más del 75% de las células del clon son GFP positivas. Estos resultados muestran que la capacidad de autorrenovación in vitro de los subclones con bajo contenido de GFAP es mayor que la de sus homólogos con alto contenido de GFAP, según lo determinado por ELDA. Por lo tanto, los subclones de GH están más diferenciados que los subclones de GL.

Por último, se examinaron las bibliotecas de fármacos para identificar agentes capaces de inducir la diferenciación astroglial en las GSC. Se encontró que 12 fármacos aumentaban significativamente el porcentaje de células que expresaban el indicador GFAP:GFP. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en unas pocas semanas si se realiza correctamente.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el ensayo de alamarBlue, el ensayo clonogénico en medios semisólidos, el flanco o la inyección intracraneal de xenógrafo para responder a preguntas adicionales como el efecto de los fármacos selectivos sobre la proliferación celular y la clonogenicidad in vitro y la tumorigénesis in vivo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar compuestos capaces de inducir la diferenciación astroglial en las células madre del glioblastoma.