Detección sistema para la identificación de pequeñas moléculas que promueven la diferenciación celular de células de Glioblastoma de drogas basados en citometría flujo

El objetivo general de este procedimiento es analizar bibliotecas de moléculas pequeñas en busca de agentes que promuevan la diferenciación astrogliial en células madre de glioblastoma. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las células madre cancerosas, como cuáles son las vías de señalización necesarias para mantener a las células madre de glioblastoma en un estado indiferenciado. La ejecución adecuada de esta técnica permite la identificación directa de moléculas pequeñas que inducen la diferenciación de las células madre de glioblastoma.

La implicación de esta técnica se extiende hacia la terapia para el glioblastoma de Ehlers-Danlos, ya que reducir el porcentaje de células madre de glioblastoma puede disminuir la probabilidad de recurrencia. Este método también puede aplicarse para inducir la diferenciación hacia otras líneas celulares utilizando otros constructos marcadores. Nuestro informe es el primero en establecer un enfoque de alto rendimiento para tamizar agentes que induzcan la diferenciación de las células madre del glioma.

Trabajar con partículas de lentivirus en células cancerosas derivadas de pacientes puede ser extremadamente peligroso. Por lo tanto, siempre se debe seguir el procedimiento estándar para trabajar con patógenos transmitidos por la sangre. Para comenzar, siembre un millón de células madre de glioblastoma o CSM en dos mililitros de medio de crecimiento completo para células madre neurales en una placa de seis pocillos.

A continuación, transduzca las células con el reportero de lentivirus a una multiplicidad de infección igual a cinco. A la mezcla de células y virus, añada dos microlitros de polibreno para que la concentración final sea de ocho microgramos por mililitro, e incube las células a 37 grados Celsius y 5%CO2 durante la noche. Después de la incubación, reemplace el medio de crecimiento para eliminar el virus no unido.

Y centrifugue las células a 360 veces G durante cinco minutos. Luego aspire cuidadosamente el medio y siembre nuevamente las células en una placa de seis pocillos. Y continúe incubando las células durante 24 horas.

Recoger 0,5 mililitros del volumen total de cultivo. Pelotar las células mediante centrifugación a 360 ×g durante cinco minutos a temperatura ambiente. ReSuspender las células en 0,5 mililitros de medio fresco de crecimiento de células madre neurales.

Coloque la placa nuevamente en el incubador para permitir la expansión durante al menos 72 horas. Añada 200 microlitros de reactivo de disociación e incube durante cinco minutos en un baño de agua ajustado a 37 grados Celsius. Disocie las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.

A las células disociadas, añada 800 microlitros de HBSS para asegurar una adhesión o agregación celular mínima. A continuación, transfiera 200 microlitros de cada suspensión celular a los pocillos de una placa de 96 pocillos. Determine el porcentaje de células que expresan la proteína verde fluorescente mediante citometría de flujo.

Registre al menos 10.000 células viables en cada adquisición. En todo análisis citométrico de flujo, utilice células parentales no transducidas o células transducidas con vector no fluorescentes para establecer la fluorescencia basal. Para seleccionar y expandir subclones individuales, siembre las células a una densidad de 0,7 células por pocillo en 100 microlitros de medio para células madre neurales en una placa de 96 pocillos.

Mantenga estos clones en cultivo durante 11 días. Esté atento a los neuroesferas con un diámetro mayor a 100 micrones. Anteriormente hemos establecido este tamaño de corte para determinar retrospectivamente si la neuroesfera se originó a partir de una célula madre de glioblastoma con capacidad de autorrenovación.

Este tamaño de corte puede requerir optimización al trabajar con diferentes modelos celulares de glioblastoma. Observe las células bajo un microscopio de fluorescencia equipado con un filtro FITC y marque los pocillos que contienen un solo neuroesferoide en el que aproximadamente del 1% al 5% de las células son positivas para GFP. Después de marcarlos, amplíe clones individuales hasta que haya un número suficiente de células disponible para el análisis por citometría de flujo.

Suponiendo que los clones del gen reportero contengan entre 1% y 5% de células GFP-positivas, recolecte 0,5 mililitros de cada clon junto con una cantidad igual de células de control no transducidas para determinar el porcentaje exacto de células GFP-positivas. Después de centrifugar las células a 360 × g durante cinco minutos a temperatura ambiente, aspire el sobrenadante. Añada 200 microlitros de reactivo de disociación a cada precipitado y incube los tubos en un baño de agua ajustado a 37 grados Celsius.

Después de la incubación, triture las células aproximadamente de 20 a 30 veces para obtener una suspensión de células individuales. Luego agregue 800 microlitros de HBSS para asegurar una adhesión o agregación celular mínima. A continuación, transfiera 200 microlitros de cada suspensión celular a los pocillos de una placa de 96 pocillos.

Finalmente, realice citometría de flujo, registrando al menos 10.000 células viables en cada adquisición. Para evaluar la capacidad clonogénica, prepare suspensiones simples de células de subclonas con reportero de diferenciación triturando las células entre 20 y 30 veces. Luego, siembre estas células en 100 microlitros de medio completo de crecimiento de células madre neurales a una densidad de aproximadamente cinco a 500 células por pocillo en placas de 96 pocillos.

Mantenga estas células en cultivo durante nueve a 11 días. Busque neuroesferas bajo un microscopio óptico. Un pocillo que contenga al menos una neuroesfera grande individual se considera positivo.

Considerando las células parentales no transducidas y las células transducidas con lentivirus GFP-positivo como controles, introduzca en la interfaz en línea de ELDA el número total de pocillos analizados y la cantidad de células positivas. Para comenzar el tamizaje, siembre 5000 células en 99 microlitros de medio de crecimiento completo para células madre neurales en una placa de 96 pocillos. Luego, con una pipeta multicanal de 12 canales, trate las células con una concentración final de dos micromolar de los compuestos de la biblioteca diluidos o con el control de DMSO.

Incube las células durante 72 horas. Añada ahora 150 microlitros de reactivo de disociación celular utilizando un pipetador de 12 canales en cada pocillo e incube a 37 grados Celsius durante 20 minutos. Luego, triture suavemente las células en cada pocillo aproximadamente de 20 a 30 veces utilizando un pipetador de 12 canales hasta obtener una suspensión de células individuales.

Ahora realice citometría de flujo y determine el porcentaje de células que expresan el reportero GFAP:GFP. Primero determine el tamaño celular y la viabilidad a partir de los dispersos hacia adelante y laterales, y seleccione la población de células viables. Luego determine las células positivas para GFP dentro de la población de células viables.

Se considera un resultado positivo un aumento en el porcentaje de células GFP-positivas de tres desviaciones estándar por encima de los controles, aunque este criterio puede ajustarse según la preferencia del usuario en cuanto a la rigurosidad. Se muestran imágenes representativas de subclonas de células troncales glioblásticas HSR-GBM1 que expresan niveles bajos y altos de GFAP:GFP. Las subclonas positivas para la expresión de GFAP:GFP se seleccionaron mediante citometría de flujo en la línea de neuroesferas derivadas de paciente.

Aquí, GFAP:GFP bajo indica que menos del 5 % de las células en el clon son positivas para GFP, mientras que GFAP:GFP alto indica que más del 75 % de las células en el clon son positivas para GFP. Estos resultados muestran que la capacidad de autorrenovación in vitro de los subclones GFAP-bajos es mayor que la de sus contrapartes GFAP-altos, según se determinó mediante ELDA. Por lo tanto, los subclones GH están más diferenciados que los subclones GL.

Finalmente, se analizaron bibliotecas de fármacos para identificar agentes capaces de inducir la diferenciación astrogliogénica en CSG. Se encontró que 12 fármacos aumentaban significativamente el porcentaje de células que expresaban el reportero GFAP:GFP. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en unas pocas semanas si se lleva a cabo adecuadamente.

Después de seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el ensayo con alamarBlue, el ensayo clonogénico en medios semisólidos o la inyección de xenoinjertos en el flanco o intracraneal, con el fin de responder preguntas adicionales, como el efecto de fármacos selectivos sobre la proliferación celular y la clonogenicidad in vitro, y la tumorigenicidad in vivo. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo identificar compuestos capaces de inducir la diferenciación astrogliogénica en células madre de glioblastoma.