Detección simultánea basada en imágenes y citometría de flujo de múltiples marcadores de senescencia fluorescente en células cancerosas senescentes inducidas por terapia

Aquí presentamos un método basado en citometría de flujo para la visualización y cuantificación de múltiples marcadores asociados a la senescencia en células individuales.

Este método puede generar rápidamente imágenes de alta resolución que permiten un análisis de la distribución espacial y la cuantificación de señales fluorescentes dentro de las células, al tiempo que permite un análisis rápido de múltiples muestras. Las células se miden utilizando el sistema avanzado de citometría de flujo de imágenes, que combina velocidad, sensibilidad e imágenes detalladas de células individuales con información espacial que produce datos únicos que no pueden ser proporcionados por optometría de flujos o microscopía. Un consejo importante es proporcionar suficientes celdas para establecer la configuración del instrumento y suspendemos las celdas a alta densidad para las mediciones.

Aparte de esto, la adquisición de datos es sencilla y similar a la citometría de flujo convencional. Primero genere las líneas celulares DLBCL como se describe en el manuscrito. Luego agregue una solución de EdU milimolar a una proporción de uno a 1000 en el cultivo celular DLBCL e incube la placa en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados durante tres horas después de mezclar la placa balanceándola suavemente.

Saque la placa después de la incubación y agregue 100 milimolares de solución de cloroquina a una concentración final de 75 micromolares. Mezclar meciendo suavemente e incubar durante 30 minutos. Luego agregue 20 soluciones milimolares de C12 FDG a una concentración final de 20 micromolares.

Después de mezclar suavemente, incubar el plato durante una hora como se demostró anteriormente. A continuación, agregue 100 milimolares de solución de 2-feniletil-beta-d-tiogalactósido de uno a 50 para detener la tinción de FSA beta-gal. Y gire suavemente la placa para mezclar.

Transfiera las células a tubos de centrífuga estériles de 15 mililitros y gire a 100 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Una vez desechado el sobrenadante, lave las celdas con cuatro mililitros de PBS y centrifugar a 100 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Luego vuelva a suspender los gránulos celulares en 500 microlitros al 4% de solución de fijación de paraformaldehído.

Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, centrifugar a 250 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y lave las células con cuatro mililitros de PBS dos veces y centrifugue a 100 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después del lavado, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 200 microlitros de tampón de permeabilización de saponina.

Ahora transfiera la suspensión a un nuevo tubo de 1.5 mililitros e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Granular las células a 250 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego vuelva a suspender las células en 200 microlitros de solución de anticuerpos primarios e incube a cuatro grados centígrados durante la noche, en la oscuridad.

Centrifugar los tubos a 250 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y lave con 100 microlitros de solución de lavado de saponina. Después de lavar las células dos veces, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos celulares en 500 microlitros de cóctel de detección EdU.

Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad y centrifugar a 250 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y lave con un mililitro de solución de lavado de saponina. Repita el lavado dos veces, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos celulares en 20 a 50 microlitros de PBS.

Antes de encender el instrumento, vacíe la botella de líquido residual y verifique los niveles de SpeedBeads, esterilizador, limpiador, desbocadillo y suficiente fluidos de vaina. Después de encender el instrumento y el software de imágenes, haga clic en el botón de inicio para inicializar la fluidez y la calibración del sistema. Ajuste el aumento a 40 veces y establezca la velocidad fluídica en baja.

Después de encender los láseres, encienda un láser de 405 nanómetros para medir EdU Pacific Blue, 488 nanómetros para medir C12-FDG y 642 nanómetros para medir Alexa-Fluor-647-gamma-H2AX. Establezca el canal seis para el canal de dispersión, el canal uno y el canal nueve para el campo claro. Luego comience con la muestra que se espera que tenga la fluorescencia más alta para configurar la intensidad de los láseres y voltee suavemente el tubo de muestra para mezclar.

Después de abrir la tapa del tubo, inserte el tubo de muestra en la base. Haga clic en Cargar para iniciar y abrir un diagrama de dispersión. A continuación, seleccione el área Características, el subrayado MO1 y la relación de aspecto subrayar MO1 para los ejes X e Y, respectivamente.

Establezca una puerta por encima de la relación de aspecto de 0,5 para excluir dobletes y agregados de celdas debajo y en el lado derecho y la población de SpeedBead en el lado izquierdo. Ahora, abra Gráfico de histograma y seleccione el cuadrado medio de la raíz del gradiente de entidad de la máscara uno y el canal uno para el eje X. Elija la población de singletes y establezca la puerta para seleccionar celdas enfocadas.

Abra un gráfico de histograma y seleccione intensidades de píxeles máximas sin procesar para los canales dos, siete y 11 del eje X. Luego ajuste las potencias del láser de 488 nanómetros, 405 nanómetros y 642 nanómetros para los canales dos, siete y 11 respectivamente para que cada fluorocromo tenga un valor máximo de píxeles bruto entre 100 y 4, 000 para evitar la sobresaturación. Elija la población enfocada para registrar y haga clic en Adquirir para medir las muestras de DLBCL con configuraciones consistentes.

Al cambiar las muestras para la medición, haga clic en retorno para recuperar el tubo de muestra. Pulse Cargar para descartar la muestra. Después de medir todas las muestras, apague el láser de campo brillante y dispersión.

Mida muestras de control de un solo color para generar una matriz de compensación. Haga clic en Apagar para cerrar el sistema de imágenes. Analice los datos en el software de análisis de imágenes.

Utilice la herramienta Spot Wizard del software de análisis de imágenes para contar y cuantificar automáticamente los focos gamma H2AX nucleares y las imágenes de células vivas. Seleccione dos poblaciones de celdas, una con un recuento de puntos alto y otro con un recuento de puntos bajo para entrenar al Asistente para obtener un análisis de recuento de puntos más detallado. El método de citometría de flujo en imágenes unicelulares mostró un aumento de C12-FDG positivo, EdU negativo, gamma H2AX positivo, población senescente y KARPAS422.

Células WSU-DLCL2 y OCI-LY1, pero no en células SU-DHL6. El análisis basado en imágenes presentó un número significativamente mayor de focos gamma H2AX y KARPAS422, WSU-DLCL2 y OCI-LY1, pero no en células SU-DHL6. Resultados similares fueron representados por datos de frecuencia y cuantificación.

Agregar saponina a la suspensión celular es crucial, de lo contrario los anticuerpos no pueden llegar a los antígenos internos de la célula y los detergentes fuertes conducen a la pérdida de la señal C12-FTG La citometría de imagen es óptima para analizar los cambios en la localización del marcador, como la translocación de un factor de transcripción al núcleo en respuesta a ciertos estímulos. Tal análisis también se puede lograr con nuestro protocolo. Este método permite la visualización de múltiples marcadores fluorescentes a nivel de una sola célula, lo que ayuda a detectar la presencia, intensidad y localización de las señales individuales.