傷害による老化と生体内での骨格筋におけるリプログラミングの評価

このプロトコルの全体的な目標は、in vivo 老化と組織損傷時の骨格筋の再プログラミングの両方を評価することです。この手法は、筋肉の再生を促進するために細胞の可塑性をどのように高めるかなど、再生医療分野における重要な課題に対処するのに役立ちます。この技術の主な利点は、常在環境内の老化細胞を検出および定量するための信頼性の高い方法を提供することです。

最近、細胞老化は組織の修復と再生に関与しています。老化が組織の修復や再生にどのように寄与するのか、そのメカニズムを理解することは、再生医療に確実に影響を与えるでしょう。この手法のアイデアを最初に思いついたのは、骨格筋のin vivoリプログラミングに対する組織損傷の潜在的な影響を調査したときでした。

この手順を開始するには、筋肉サンプルのスライドをPBS中の1%パラホルムアルデヒドと0.2%グルタルアルデヒドで4分間固定します。次に、スライドをPBSで2回、毎回10分間洗浄します。次に、スライドをPBS、pH 5.5で30分間洗浄します。

次に、X-gal溶液を含む切片を37°Cの暗所で最低24時間インキュベートします。その後、スライドをPBSで3回、毎回10分間洗います。次に、1%パラホルムアルデヒドを含むPBSでスライドを30分間後置します。

最後に、スライドをPBSで3回洗います。その後、スライドをエオシン溶液に1分間浸漬することにより、0.2%エオシンで対比染色します。次に、蒸留水で短時間すすぎます。

スライドを水性の非蛍光封入剤でマウントします。スライドを4%パラホルムアルデヒドを含むPBSで10分間固定します。PBSで2回、毎回10分間洗います。

その後、透過化溶液を添加し、5分間インキュベートします。これに続いて、スライドをPBSで2回、毎回5分間洗います。最後の洗浄では、0.25%BSAを含む200マイクロリットルのPBSをスライドに直接5分間追加します。

スライドを一次抗Nanog抗体と1.25μg/mLで、5%FBSを含むPBSで摂氏4度で一晩インキュベートします。スライドをPBSで2回、毎回10分間洗います。最後の洗浄では、0.25%BSAを含む200マイクロリットルのPBSを5分間使用します。

その後、スライドを100 μLのRAB-HRP二次抗体とインキュベートし、すぐに使用できるキットから取り出します。次に、スライドをPBSで3回、毎回5分間洗浄して、二次抗体を除去します。その後、すぐに使用できるキットに付属の基質バッファーでDABを希釈します。

勢いよく渦を巻きます。100マイクロリットルのDAB溶液を各スライドに直接加え、室温で最大10分間インキュベートします。次に、スライドを水ですすいでDAB溶液を取り除きます。

スライドを高速赤色溶液で2分間対比染色します。次に、スライドを再度水で短時間洗います。その後、95%エタノールで5分間、続いて100%エタノールを2回、毎回5分間脱水します。

その後、速硬化封入剤でスライドを埋込します。スライドを顕微鏡で20倍の明視野で観察し、背景を避けます。この手順では、スライドをスキャンし、組織の完全性、染色の品質、および対比染色に基づいて、間に可能な限り最大の距離を持つ各スライドの2つの最高品質のセクションを選択します。

これら 2 つのセクションの SA-Beta-Gal 陽性細胞をカウントし、平均値を計算します。次に、最小および最大の陽性のSA-Β-Gal細胞を手動で選択することにより、ピクセルサイズのランクを決定します。ImageJインターフェースで、分析、ツール、ROIマネージャー、分析、測定の設定をクリックします。

次に、[エリア] を選択します。選択ツールを使用して、最小および最大の正のSA-Beta-Galセルを囲み、[追加]をクリックしてROIマネージャーに追加します。その後、[測定] ボタンを使用してサイズを測定し、後で使用するために値を保存します。

次に、しきい値パラメータを調整して、表示されているすべての正のセルが選択されていることを確認します。画像、タイプ、8ビットの順にクリックして、画像をグレースケールに変換します。その後、画像、調整、しきい値に移動します。

すべての陽性のSA-Beta-Gal細胞が赤で覆われるまで2番目のカーソルを動かし、[適用]をクリックします。「Analyze」、「Analyze」、「Analyze Particles」、続いて「Size」をクリックしてパーティクルを分析し、前に定義した値を適用します。「Circularity, 0.00-1.00」と入力し、[OK]をクリックします。カウントされたすべての粒子の概要がROIマネージャーに表示されます。

次に、選択したすべての粒子を元の画像に転送します。選択を手動で調整して、正確な定量化を確保します。陽性細胞を追加するか、偽陽性細胞を削除します。

最後に、選択ツールを使用してセクションの輪郭を描き、面積を測定します。「ROI マネージャー」、「追加」、「測定」の順にクリックします。顕微鏡下で、明視野中のNanog陽性細胞を20倍の倍率で手動でカウントします。

ここに示されているのは、筋肉損傷後のin vivoリプログラミングと老化レベルを評価するための概略図です。SA-Β-GalとNanogが損傷した骨格筋の凍結切片に染色した代表的な写真です。これらの画像は、エオシンで対比染色したSA-Beta-Gal染色と、Fast Redで対比染色したNanogの染色を示しています。

負傷していない筋肉は上部に表示され、負傷した筋肉は下部に表示されます。このグラフは、損傷後10日での連続切片におけるSA-Β-Gal陽性細胞とNanog陽性細胞の定量化と相関を示しています。この手順を試行する際には、染色の特異性を確保するために、常にネガティブコントロールを含めることを忘れないでください。

この手順に続いて、免疫蛍光法、老化の異なるマーカーの選択、老化細胞の細胞同一性などの追加の質問に答えるために、すべての細胞タイプを含むすべての方法を実行できます。開発が進むたびに、この技術は、老化、または組織の修復と再生の分野の研究者が、細胞老化が哺乳動物の組織修復と再生を促進するために細胞の可塑性をどのように促進できるかを探求する道を開きました。したがって、このビデオを見た後、in vivoで老化細胞と再プログラム細胞の両方を特定する方法について十分に理解しているはずです。