Cuantificación de la Quimiotaxis de monocitos humanos In Vitro y linfocitos murinos, tráfico en Vivo

Los objetivos generales de estos ensayos son cuantificar la quimiotaxis de monocitos in vitro en tiempo real y rastrear la migración de linfocitos in vivo. El método in vitro puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como cuáles son los efectos de los factores séricos en la quimiotaxis de las células inmunitarias. La principal ventaja de la técnica in vitro es que permite realizar mediciones cuantitativas y multiplex en tiempo real.

El método in vivo puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología sobre cómo migran tipos específicos de células dentro de un animal receptor. La técnica in vivo es particularmente útil para la evaluación cuantitativa de la migración de múltiples tipos de células dentro del mismo animal. Antes de comenzar el experimento, etiquete las células THP-1 con un tinte fluorescente en una placa de cultivo celular de 35 milímetros en medio completo a 37 grados Celsius durante 30 minutos.

Mientras las células están incubando, agregue 750 microlitros de HBSS tamponado con 25 milimolares HEPES y 0.1%BSA a los pocillos de fondo y control positivo de una placa de 24 pocillos. Añadir la concentración adecuada de MCP-1 en el agua suplementada con BSA a los pozos experimentales y de control positivo. Y coloque insertos porosos en cada pocillo, teniendo cuidado de que las lengüetas de los insertos se alineen con las muescas de la placa.

Es fundamental eliminar las burbujas de los pocillos inferiores después de colocar los insertos, ya que las burbujas interferirán con las mediciones de fluorescencia. Al final de la incubación, transfiera las células marcadas a un tubo cónico de 15 mililitros para su recolección por centrifugación. E inspeccione visualmente el pellet resultante para confirmar la absorción del tinte.

A continuación, aspire cuidadosamente al vacío el sobrenadante y lave las células en medio RPMI-1640 sin suero suplementado con 25 milimolares HEPES en las mismas condiciones de centrífuga. Vuelva a suspender el pellet en un medio fresco sin suero con HEPES para contar. Y ajuste el volumen a una concentración final de uno a 1,5 veces 10 a las seis celdas por mililitro.

Agregue 250 microlitros de células a la cámara superior de cada pocillo y coloque la placa en un lector de placas a 37 grados Celsius. A continuación, adquiera lecturas de fluorescencia de las cámaras inferiores a intervalos de uno a tres minutos a las longitudes de onda de excitación y emisión de fluorescencia adecuadas para el tinte. Para preparar las células del donante para su transferencia adoptiva, primero, extraiga todo el bazo de un ratón C57 negro de ocho a 12 semanas de edad anestesiado en un filtro de malla de nailon de 40 micrómetros en una placa de cultivo celular que contenga medio completo en hielo.

Con el extremo de un émbolo de jeringa, macere suavemente el bazo a través de la malla. Cuando se haya obtenido una suspensión de una sola célula, transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros y agregue cuatro volúmenes de tampón de lisis de cloruro de amonio y potasio para agotar los glóbulos rojos. Después de cinco minutos a temperatura ambiente, recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en medio completo a una concentración de dos a cinco veces 10 a la séptima célula por mililitro.

Cuele las células a través de una nueva malla de nailon de 40 micrómetros para eliminar los restos de células. Y etiquete una vez de 10 a las siete células por ratón receptor con un tinte fluorescente compatible con células vivas que se conservará tras la fijación posterior durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, lavar las células en cuatro volúmenes de HBSS suplementado con HEPES.

Y vuelva a suspender el pellet en HBSS fresco más HEPES a una concentración de una vez 10 a la octava celda por mililitro. A continuación, haga un vórtice breve de las células del donante y cárguelas en una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de 0,5 pulgadas de calibre 27. Coloque a los ratones receptores C57 black six anestesiados de ocho a 12 semanas de edad en posición prona y aplique una presión caudal leve en la piel dorsal al ojo del primer animal, haciendo que el globo ocular sobresalga ligeramente.

Dirija la aguja medialmente para la inyección retroorbitaria de 100 microlitros de células del donante. A continuación, retire gradualmente la aguja y coloque el ratón en una jaula de recuperación individual con monitorización hasta la recuperación completa. Es fundamental que los animales estén adecuadamente anestesiados y que el procedimiento de inyección se haya practicado bien para garantizar una entrega celular consistente entre los animales y entre los experimentos.

Hasta 24 horas después de la transferencia adoptiva, coseche el bazo en un mililitro de medio completo por receptor. Y generar una suspensión de células individuales libres de glóbulos rojos, como se acaba de demostrar. Después de contar, ajuste la suspensión celular a una concentración de tres veces 10 a siete celdas por mililitro en el tampón de tinción.

Y transfiera 100 microlitros de células a pocillos individuales de una placa inferior redonda de 96 pocillos. Tiñir las células para los marcadores de interés de acuerdo con los protocolos estándar de análisis de citometría de flujo. Después de 20 minutos en hielo protegido de la luz, lavar las células con 100 microlitros de tampón de tinción y volver a suspender los gránulos en 200 microlitros de tampón de tinción fresco para una segunda centrifugación.

A continuación, vuelva a suspender el pellet en 125 microlitros de tampón de tinción fresco y analice las muestras de células en un citómetro de flujo de acuerdo con los protocolos estándar. Las lecturas fluorescentes automatizadas para rastrear la migración demuestran claramente una inducción de la migración celular hacia MCP-1 que aumenta en presencia de suero. Dependiendo de la fuerza del estímulo migratorio, hay un retraso de al menos 15 minutos antes de un aumento en la señal fluorescente que puede alcanzar su punto máximo y disminuir gradualmente a medida que las células pasan a la solución a la cámara inferior desde la parte inferior del inserto a una velocidad más rápida que la de las células que migran desde la cámara superior.

Si se transfiere más de una población celular marcada con fluorescencia, es importante cuantificar la proporción relativa de poblaciones celulares dentro del material de entrada para tener en cuenta cualquier variación en la mezcla de las poblaciones celulares. Por ejemplo, en este experimento, la proporción de células fluorescentes verdes y naranjas fue de 0,97 a uno. El tráfico se cuantificó dividiendo el número de células marcadas recuperadas por el número total de células recuperadas.

Si bien existe una variación considerable en el número de células recuperadas entre los animales, para cualquier animal dado, la proporción de células fluorescentes verdes y naranjas suele ser aproximadamente igual. Una vez dominada, la técnica in vitro se puede completar en cuatro horas, y la técnica in vivo se puede completar en seis horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que hay que evitar la creación de burbujas en las cámaras experimentales y esforzarse por mantener la consistencia durante la inyección retroorbital de las células transferidas adoptivamente.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología exploraran la quimiotaxis in vitro e in vivo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar y monitorear un ensayo de quimiotaxis in vitro en tiempo real y aislar linfocitos nativos para su transferencia adoptiva y para rastrear su migración in vivo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.