Name: Cuantificación de la Quimiotaxis de monocitos humanos In Vitro y linfocitos murinos, tráfico en Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Aprende a cuantificar la quimiotaxis de monocitos humanos in vitro y el tráfico de linfocitos murinos in vivo. Estos protocolos permiten evaluaciones cuantitativas en tiempo real para estudios inmunológicos.

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Este trabajo fue financiado por el programa de Bernard L. Schwartz para los científicos de médico en la Universidad de Rockefeller, el fondo de desarrollo terapéutico de Robertson de la Universidad de Rockefeller y el centro de Sackler para Biomedicina e investigación de la nutrición en la Universidad de Rockefeller.

todos los procedimientos fueron aprobados por la Universidad de Rockefeller &#39; s cuidado de Animal institucional y Comité de uso. Todos los animales fueron alojados en condiciones libres de patógenos específicas.
 1. quimiotaxis In Vitro <ol><li>cultura THP-1 células 6 en Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y 4-(2-hidroxietil) -1- ácido-1-ácido (HEPES; 25 mM) (completar los medios), mantener la densidad entre 0.5-1.0 x 10 6 células/mL.</li>
	<li>Cultivo de células en un 35 mm plato, etiqueta 3.5 x 10 5 THP-1 de células por condición con calceína acetoxymethyl (calceína-AM; 2.5 μm) u otro colorante fluorescente adecuado en medios completo a 37 ° C durante 30 minutos 
	Nota: Tintes deben ser compatible con el etiquetado de células vivas y permeable a la membrana celular.</li>
	<li>Pre-caliente un lector de placas a 37 ° C. 
	Nota: Además del control de temperatura, funcionalidad de lectura de la parte inferior también es necesario. Ver paso 1.10.2 para una alternativa a un lector de placas para la cuantificación de la migración de las células.</li>
	<li>Mientras que las células son etiquetas, preparar la placa de ensayo y la cámara baja.
	Placa de <ol><li>uso un cultivo de tejido de 24 pozos, con una condición por pozo. Realizar cada condición por triplicado.</li>
		<li>Añadir 750 μl de Hank &#39; s solución salina tamponada (HBSS) tamponado con 25 mM HEPES y 0,1% de seroalbúmina bovina (BSA) para la placa de 24 pocillos. Esto sirve como la condición basal de control.
		<ol><li>Uso otros pozos para las condiciones de comparación, manteniendo siempre el volumen total en la cámara inferior en 750 μl. 
			Nota: En este ejemplo, humano monocito chemoattractant protein-1 (MCP-1) sirve como control positivo para quimiotaxis 7.
			<ol><li>Montar la mezcla de reactivo HBSS con 25 mM HEPES, BSA (0.1%) y MCP-1 (75 ng/mL). Utilizar suero bovino adulto (2,7% v / v) con MCP-1 como un control positivo adicional. 
				Nota: Concentración de Chemokine y chemokine dependerá el eje quimiotáctico bajo estudio. Liofilizado de MCP-1 se resuspendió en agua destilada con BSA (0,1%) para hacer una solución con una concentración final de 50 μg/mL. Esto se puede diluir en agua a una solución de trabajo de 10 μg/mL. Añadir 5.6 μL de esta solución a la cámara baja.</li>
			</ol></li></ol></li> <li>Una vez finalizada la composición de las cámaras inferiores, coloque una pieza porosa en cada pocillo, asegurando que alineen las lengüetas del inserto con las muescas de la placa. 
		Nota: Elija el tamaño de poro adecuado para los insertos. Para monocitos y linfocitos, realiza bien un tamaño de poro de 3 μm. Algunos tipos de células o sistemas de chemokine pueden requerir una superficie revestida de matriz para la migración óptima. Por ejemplo, para la medición de la Quimiotaxis de monocitos THP-1 hacia la MCP-1, fibronectina o insertos recubiertos de colágeno se recomiendan. Para el lector de placas para la cuantificación, el inserto debe tener una capa luz impermeant, tales como tereftalato de polietileno, para evitar la detección de no-migrar las células en la parte superior del compartimiento 8.</li>
	</ol></li> <li>Después de incubar las células por 30 min con calceína-AM, transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 15mL. Centrifugar las células a 1.000 x g durante 2 minutos inspección visualmente las células para confirmar la absorción de calceína-AM ( figura 1).</li>
	<li>Retire con cuidado el sobrenadante utilizando un aspirador de vacío. Lavar las células etiquetadas en 1640 RPMI sin suero suplementado con HEPES 25 mM. Centrifugar las células a 1.000 x g durante 2 min y descarte el sobrenadante.</li>
	Resuspender las células en suero RPMI 1640 suplementado con HEPES 25 mM <li>. Contar las células y ajustar el volumen para que las células están en una concentración final de 1.0-1.5 x 10 6 células/mL.</li>
	<li>Suministrar 250 μL de la suspensión de células en el inserto (cámara alta).</li>
	<li>Después de las cámaras superiores se han llenado, suavemente Levante la placa e inspección la parte inferior la presencia de burbujas de aire que pueden interferir con la detección y la migración. Para quitar una burbuja, primero prueba a quitar entonces reposicionar el inserto. Si no lo consigue, use una aguja de 27 G a pinchar la burbuja y luego vuelva a colocar el inserto.</li>
	<li>Coloque la placa en el lector de la placa con 37 ° C.
	<ol><li>Adquirir lecturas de fluorescencia desde el fondo a intervalos de 1-3 min. Cuando se utiliza calceína-AM, establece la fluorescencia longitudes de onda de excitación y emisión a 485 nm y 520 nm, respectivamente. Dependiendo del sistema de la tipo y quimioquinas de la célula, chemotaxis ocurre típicamente durante 1-4 h ( figura 2A).</li>
		<li>Como una alternativa a las mediciones continuas utilizando un lector de placas, imagen los pozos utilizando un microscopio fluorescente invertido ( figura 2B) capaz de excitación y detección de la luz a 485 nm y 520 nm, respectivamente. Usar una ampliación baja para capturar a la mayoría de la parte inferior de la inserción. Cuantificar las células mediante el procesamiento de imágenes ImageJ o software similar 9.</li>
	</ol></li></ol> 2. La transferencia adoptiva de linfocitos murinos <ol><li>preparación de células de donante <ol><li>Anesthetize semana 8-12-viejos ratones C57BL/6J donante masculino usando un vaporizador de la anestesia isoflurano (1-3%). Confirmar la adecuada profundidad de la anestesia del dedo del pie-pizca.</li>
		<li>Colocar el ratón en la posición supina. Haga una incisión de línea media con un bisturí y localizar el bazo en el espacio peritoneal izquierdo superior. Suprimir el bazo entero y coloque en medio completo (RPMI suplementado con 10% FBS y 25 mM HEPES; 1 bazo mL) en hielo. Eutanasia a animales anestesiados donantes por degollación.</li>
		<li>Moler tejidos bazo suavemente a través de malla de nylon de 40 μm en medios completo (/spleen de 1 mL) con el extremo de un émbolo de la jeringa para hacer una suspensión unicelular y transferencia a un tubo cónico de 15 mL.</li>
		<li>Añadir 4 volúmenes de cloruro de amonio lisis de potasio (ACK) de búfer e incubar 5 min a temperatura ambiente para lisar eritrocitos.</li>
		<li>Centrifugar las células a 1.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante. Si los eritrocitos permanecen en el sedimento, resuspender en tampón de lisis ACK, incubar 5 min a temperatura ambiente, centrifugar las células a 1.000 x g durante 2 min y descartar el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspender las células en medios de comunicación completa en una concentración de 2-5 x 10 7 células/mL, luego cuele la suspensión de células a través de una malla de nylon de 40 μm para eliminar restos de células.</li>
		<li>Etiqueta de 1 x 10 7 ratón de células/receptor con un colorante fluorescente compatible con vive las células y que se mantendrá con fijación posterior, como 5-chloromethylfluorescein diacetato (concentración final 2 μM) 10 . Incubar a 37 ° C por 30 minutos 
		Nota: Para el seguimiento de más de una población celular, utilizar otros tintes fluorescentes con poblaciones celulares adicionales. Visualizador, una porción de células del donante puede ser etiquetada con 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) benzoilo) amino) tetramethylrhodamine (concentración final 2 μM) 11.</li>
		<li>4 añadir volúmenes HBSS complementado con 25 mM HEPES, luego centrifugar a 1.000 x g durante 2 minutos y descartar sobrenadante. Resuspender el precipitado en HBSS suplementado con HEPES 25 mM para una concentración final de 1 x 10 8 células/mL.
		<ol><li>Si utiliza más de un colorante fluorescente, mantener poblaciones celulares separadas hasta inmediatamente antes de la inyección.</li>
			<li>Transferir una pequeña alícuota (10 μL) de las células de cada color en una solución fijadora (1 mL) para compensación de citometría de flujo posterior.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Transferencia de linfocitos <ol><li>anestesiar 8-12 semanas-ratones viejo receptoras de machos C57BL/6J con isoflurano (1-3%) usando un vaporizador; confirmar la profundidad de la anestesia del dedo del pie-pizca. Aplique ungüento veterinario animal &#39; ojos s para prevenir la resequedad.</li>
		<li>Brevemente las células donantes de vortex (1 s) y la transferencia a la jeringa de inyección de 1 mL 27 g, 0,5 en aguja, combinando poblaciones de células marcadas diferencialmente, en su caso.
		<ol><li>Transferir una pequeña alícuota (10 μL) de las células mixtas con una solución fijadora (1 mL) para los análisis de citometría de flujo posterior.</li>
		</ol></li> <li>Lugar animales donadores en la posición propensa. Aplicar presión caudal suave sobre la piel dorsal a la vista, haciendo que el globo ocular sobresale un poco.</li>
		<li>Dirigir la aguja medialmente e inyectar 100 μl de suspensión de la célula donante retro-orbitally cada ratón receptor. Las células también pueden ser inyectadas a través de la vena de la cola.</li>
		<li>Poco a poco retirar la aguja de inyección y mouse solo en una jaula de recuperación. Animal del monitor hasta que ha recuperado la conciencia; una vez totalmente recuperado retorno del animal a la vivienda social.</li>
	</ol></li> <li>Recogida y análisis de <ol><li>después de 1 h, anestesiar ratones receptores con anestesia isoflurano (1-3%) utilizando un vaporizador, confirmar la profundidad de la anestesia del dedo del pie-pizca. El bazo (u otro tejido de interés) de la cosecha (paso 2.1.2.) de cada lugar en medios completo (1 mL/destinatario) y ratón receptor. Eutanasia a animales anestesiados por degollación. 
		Nota: Intervalos más largos antes de la cosecha de tejido aumentará la acumulación del tejido a través de al menos 24 h.</li>
		<li>Moler tejidos bazo suavemente a través de malla de nylon de 40 μm en completa comunicación con el extremo de un émbolo de la jeringa para hacer una suspensión unicelular y transferencia a tubo cónico de 15 mL.</li>
		<li>4 añadir volúmenes de lisis ACK del almacenador intermediario e incuban 5 min a temperatura ambiente. Centrifugue la suspensión de células a 1.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspenda cuidadosamente los eritrocitos de la tinción buffer (tampón fosfato salino suplementado con 1% FBS). Contar las células y ajustar a una concentración final de 3 x 10 7 células/mL. Transferir 100 μl de la suspensión celular a un pozo 96 placa inferior redondo.</li>
		<li>Tinción de células para marcadores deseadas (véase tabla de materiales) para el análisis por citometría de flujo. Añadir anticuerpos conjugados fluoróforo (véase la tabla de materiales) contra los marcadores deseados e incubar a 4 ° C por 20 min en la oscuridad. Añada 100 μl tampón de tinción, centrifugar las células a 1.000 x g durante 3 min y descarte el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspender el pellet en 200 μL tampón de tinción, centrifugar las células a 1.000 x g durante 3 min y descarte el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspender el pellet en la tinción de 125 μl tampón y adquirir muestras utilizando un citómetro de flujo utilizando procedimientos estándar de. 
		Nota: El tinte verde es excitado por un láser 488 y la emisión se detecta con los filtros dicroicos 505 y 530/30. El tinte anaranjado es excitado por un 561 nm y la emisión se detecta por un filtro dicroico 582/15.
		<ol><li>Uso salvo las células de 2.1.8.2 para compensar cada colorante fluorescente. 
			Nota: Utilizando compensación de grano con fluoróforos que empareja la excitación y espectros de emisión de los tintes Etiquetadoras dará lugar a indemnización subóptima.</li>
			<li>Utilizar las células entradas guardadas desde el paso 2.2.2.1 para determinar con precisión la relación de marcado diferencialmente células de entrada si utiliza más de una población marcada ( figura 3). Calcular la migración específica de tejido basada en la relación de etiquetado a las células sin etiqueta ( figura 4).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+chemokine+receptors%3A+positioning+cells+for+host+defense+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity.</a> Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%3A+the+multistep+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li>
<li>Ponda, M. P., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+stimulation+of+CCR7+chemotaxis+due+to+coagulation+factor+XIIa-dependent+production+of+high-molecular-weight+kininogen+domain+5%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.protocol-online.org/protocols/4464.pdf">Boyden chamber assay.</a> Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).</li>
<li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li>
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<li>Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+fluorescence+based+assay+of+neurite+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An automated fluorescence based assay of neurite formation.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+cell+cycle-dependent+changes+in+cell+thiol+level+by+combining+a+new+laser+dye+with+Hoechst+33342%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342.</a> Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).</li>
<li>West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+fixation+of+thiol-reactive+fluorescent+cytoplasmic+probes+for+tracking+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration.</a> J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).</li>
<li>Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+greater+chemotactic+network+for+lymphocyte+trafficking%3A+chemokines+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond.</a> Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

Cuantificación de la migración de células inmunes puede lograrse usando simple y rápido de ensayos tanto in vitro como in vivo. Demostramos en vitro la Quimiotaxis de monocitos humanos en respuesta a un gradiente de MCP-1 y aumento por el suero. In vivo, esplenocitos murinos donantes fueron etiquetados diferencialmente y tras transferencia adoptiva, fueron recuperados de los animales receptores.
Usando un lector de placa tiene la ventaja de varios puntos del...

Inmunidad sólida requiere la compleja coordinación temporal y espacial de una gran variedad de tipos de la célula para responder adecuadamente a la lesión, la infección y generar autotolerancia. Se han descubierto varios receptores del chemokine docena y sus correspondientes ligandos y mecanismos moleculares que caracterizado por que las células específicas pueden dirigirse en un tejido específico en un momento específico. Así, estudiar la quimiotaxis y migración es un componente indispensable de la investigación de la inmunología. De hecho, el ensayo descrito en vitro recientemente fue utilizado como una herramienta de detección para identificar quimiotáctico cofactor que acelera el quimiotactismo de las células T hacia C-C quimiocinas 19 y 213. El propósito de los métodos descritos aquí son permitir evaluaciones cuantitativas de la Quimiotaxis de células inmunitarias en vitro y en vivo.
El análisis de la cámara de Boyden (migración celular e invasión) es un método rápido, barato y reproducible para evaluar la migración de la célula4,5. En el ensayo estándar, la cámara superior es sembrada con células y está separada por una inserción porosa de una cámara inferior, en el cual las células migran. En el tiempo deseado, las células que han emigrado a la parte inferior de la inserción pueden ser fijo y manchadas para cuantificación por microscopia ligera. Sin embargo, estas mediciones restringen la recopilación de datos para un único punto de la final, que excluye la recolección de datos dinámica y pueden requerir extensa optimización para determinar el momento óptimo para el análisis. Aquí, se describen varias adaptaciones que permiten mediciones en tiempo real, cuantitativas y multiplexadas de quimiotaxis en vitro.
Estudios en vivo , se utiliza un punto funcional, es decir, la acumulación específica de células en un compartimento determinado tejido. Células de un donante previamente etiquetados se introducen animales receptores a través de transferencia adoptiva. Estas células del donante pueden identificarse posteriormente mediante citometría de flujo después de la cosecha de tejido receptor. También es una estrategia Co etiquetada que permite la determinación del tráfico de diferentes tipos de células dentro de un solo animal receptor. Este método elimina la variación entre animal de la inyección de células y representa la variabilidad entre animales fisiológica.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de cultivo celular</td><td>Corning</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1430</td><td>Excitación: 485 nm, Emisión: 520 nm</td></tr><tr><td>Célula placa de cultivo</td><td>Corning</td><td>1007</td><td></td></tr><tr><td>placa de 24 pocillos</td><td>Corning</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroblok Inserto de fibronectina</td><td>Corning</td><td>CB354597</td><td></td></tr><tr><td>tubo cónico de 15 mL</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Albúmina sérica</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>9998S</td><td></td></tr><tr><td>Humano Recombinante MCP-1</td><td>Peprotech</td><td>300-04</td><td></td></tr><tr><td>Bovino adulto Suero</td><td>Sigma</td><td>B9433</td><td></td></tr><tr><td>HBSS con calcio y magnesio; sin rojo fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M2e</td> lector de placas <td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia invertida Olympus IX71</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein salud animal</td><td>11695-6776-2</td><td>Anestesia con isofluorano</td></tr><tr><td>Colador de células 40um nylon</td><td>Falcon Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>ACK tampón de lisado</td><td>Calidad Biológica</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Naranja CMTMR Tinte</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2927</td><td>Excitación: 541 nm, Emisión: 565 nm</td></tr><tr><td>CellTracker Verde CMFDA Tinte</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2925</td><td>Excitación: 485 nm, Emisión: 520 nm</td></tr><tr><td>Jeringa de 5 ml</td><td>Jeringa BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>jeringa TB de 1 ml Jeringa</td><td>BD</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>línea celular THP-1</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anti-ratón Anticuerpo CD3</td><td>Biolegend</td><td>100228</td><td>Excitación: 405 nm, Emisión: 421 nm</td></tr><tr><td>Violeta brillante 605 anti-ratón CD19 Anticuerpo</td><td>Biolegend</td><td>115540</td><td>Excitación: 405 nm, Emisión: 603 nm</td></tr><tr><td>Placa inferior redonda de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>LSRII</td><td>BD Biosciences</td><td>Citómetro</td> de <td></td> flujo</tr></tbody></table>

cuantificación de la quimiotaxis de monocitos humanos in vitro y linfocitos murinos, tráfico en vivo

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Quimiotaxis es la migración a lo largo de un gradiente químico específico1. Quimiocinas son citocinas quimiotácticas que promueven el tráfico celular con especificidad anatómica y temporal2. Chemotaxis es una función crítica de los linfocitos y otras células inmunes que pueden ser cuantitativamente evaluaron in vitro. Este manuscrito describe métodos que permiten la evaluación de la quimiotaxis, en vitro y en vivo, para tipos de diversas células incluyendo líneas celulares y células nativas. El en vitro, formato basado en la placa permite la comparación de varias condiciones simultáneamente en tiempo real y puede terminar dentro de 1-4 h. In vitro ensayo condiciones pueden manipularse para introducir agonistas y antagonistas, como así como diferenciarse quimiotaxis chemokinesis, que es el movimiento al azar. En vivo tráfico evaluaciones, las células inmunes pueden ser marcadas con colorantes fluorescentes múltiples y utilizan para la transferencia adoptiva. El etiquetado diferencial de células permite que las poblaciones de mezclado de la célula se introduce en el mismo animal, lo que disminuye la varianza y reducir el número de animales requeridos para un experimento estadístico adecuado. Migración en el tejido linfoide ocurre en tan poco como 1 h, y múltiples compartimentos de tejido pueden ser muestreados. Citometría de flujo después de la cosecha de tejido permite un análisis rápido y cuantitativo de los patrones migratorios de múltiples tipos de células.

Cuando se usa tinte de calceína-AM, inspección visual de las células confirmará absorción de etiqueta (figura 1). Lecturas de fluorescentes automatizadas seguimiento migración como tránsito de las células en la parte inferior del parte movible en el tiempo. Estos datos muestran claramente una inducción de la migración celular hacia la MCP-1, así como un aumento de esta respuesta por el suero (figura 2A). Dependiendo de la fuerza ...

Protocolos para la evaluación cuantitativa de la migración y Quimiotaxis de linfocitos son herramientas importantes para la investigación de la inmunología. Aquí, se describe un protocolo en vitro que permite en tiempo real, multiplexado evaluación de migración celular, así como un complementario en vivo técnica que permite seguimiento de células nativas del bazo.

Cuantificación de la Quimiotaxis de monocitos humanos In Vitro y linfocitos murinos, tráfico en Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Los objetivos generales de estos ensayos son cuantificar la quimiotaxis de monocitos in vitro en tiempo real y rastrear la migración de linfocitos in vivo. El método in vitro puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como cuáles son los efectos de los factores séricos sobre la quimiotaxis de las células inmunitarias. La principal ventaja de la técnica in vitro es que permite mediciones cuantitativas y multiplex en tiempo real.El método in vivo puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología sobre cómo migran tipos específicos de células dentro de un animal receptor. La técnica in vivo es particularmente útil para la evaluación cuantitativa de la migración de múltiples tipos de células dentro del mismo animal. Antes de comenzar el experimento, marque las células THP-1 con un colorante fluorescente en una placa de cultivo celular de 35 milímetros en medio completo a 37 grados Celsius durante 30 minutos.Mientras las células están en incubación, agregue 750 microlitros de HBSS tamponado con 25 milimolares de HEPES y 0,1 % de BSA a los pozos de control de fondo y control positivo de una placa de 24 pozos. Agregue la concentración adec

quantifying-human-monocyte-chemotaxis-vitro-murine-lymphocyte

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Se describe un protocolo de la microscopía de campo claro intravital para medir la dinámica de los neutrófilos interacciones célula endotelial durante el reclutamiento de neutrófilos en respuesta a la fuente de un quimioatrayente de neutrófilos en vivo. Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración y la quimiotaxis transendotelial en tejido de ratón músculo cremáster se visualizan con la fotografía de vídeo de tiempo transcurrido y el seguimiento con ImageJ.

Seguimiento de Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración transendotelial y la quimiotaxis de los tejidos por microscopía de vídeo intravital

Este video muestra una investigación experimental de la transmigración de linfocitos a través de un modelo de endotelio de barrera hematoencefálica (BBB). Se genera una monocapa de células endoteliales microvasculares del cerebro humano (HBMEC) in vitro, y se añaden a la monocapa células mononucleares de sangre periférica (PBMC) que contienen linfocitos. A continuación, las células se incuban para permitir la transmigración de los linfocitos, y las células migradas se cuantifican mediante...

Estudio de la transmigración de linfocitos a través de una monocapa de células endoteliales microvasculares

Se describe un protocolo para medir la transmigración por monocitos a través de monocapas endoteliales humanas y su posterior maduración en células espumosas. Esto proporciona un método versátil para evaluar las propiedades aterogénicas de monocitos aislados de personas con diferentes enfermedades y evaluar factores en sangre que puede aumentar esta propensión.

Cuantificación de transmigración de monocitos y formación de la célula de la espuma de individuos con enfermedades inflamatorias crónicas

Leucocitos con avidez interactúan con las células vasculares y las plaquetas después de lesión de pared del recipiente o durante la inflamación. Aquí, describimos un análisis sencillo basado en el flujo laminar para caracterizar los mecanismos moleculares que subyacen a las interacciones entre los leucocitos y sus socios celulares.

Ensayos de flujo laminar para investigar el reclutamiento leucocitario en cultivos de células vasculares y las plaquetas adherentes

Aquí, presentamos un protocolo integrado que mide la subpoblación de monocito tráfico bajo flujo in vitro por el uso de marcadores de superficie específicos y microscopía de fluorescencia confocal. Este protocolo puede utilizarse para explorar medidas de reclutamiento secuencial así como a otros subtipos de leucocitos usando otros marcadores de superficie específicos del perfil.

Estudio simultáneo de la contratación de las subpoblaciones de monocitos bajo flujo In Vitro

Aquí, demostramos los métodos de cuantificación en vivo de la salida de leucocitos de ingenuo, inflamado y mala piel murina. Realizamos una comparación directa de dos modelos: photoconversion de aplicación y en situ FITC transdérmica. Además, demostramos la utilidad de photoconversion para el seguimiento de salida de leucocitos de tumores cutáneos.

Cuantificación de leucocitos salida vía los recipientes linfáticos de la piel murina y tumores

El protocolo introdujo aquí permite la caracterización de la capacidad de pulmón homing de linfocitos humanos primarios en condiciones inflamatorias en vivo. La infiltración pulmonar de células inmunes humanas eventualmente transferidas en un modelo murino de inflamación alérgica puede ser reflejada y cuantificada mediante microscopía de fluorescencia de luz hoja de tejido pulmonar químicamente limpia.

Avanzadas de la proyección de imagen de pulmón Homing de linfocitos humanos en un Experimental en modelo Vivo de inflamación alérgica basada en microscopia de luz hoja

Aquí presentamos un protocolo para cuantificar la actividad quimiotáctica de los monocitos sanguíneos en modelos de ratón, para evaluar los efectos de las intervenciones nutricionales, farmacológicas y genéticas en los monocitos sanguíneos y para caracterizar los monocitos sanguíneos derivados de los macrófagos en modelos de ratón utilizando tapones de gel de membrana de sótano cargados de monocitos-quimioattractant-1 (MCP-1).

Cuantificación de la actividad quimiotáctica monocitos en Vivo y caracterización de los macrófagos derivados de monocitos sanguíneos

En este protocolo, los linfocitos se colocan en la cámara superior de un sistema de transmigración, separados de la cámara inferior por una membrana porosa. La quimiocina se añade a la cámara inferior, lo que induce la migración activa a lo largo de un gradiente de quimiocina. Después de 48 h, los linfocitos se cuentan en ambas cámaras para cuantificar la transmigración.

Evaluación de la migración de linfocitos en un sistema de transmigración ex Vivo

Aquí describimos métodos que utilizan la microscopía de lapso de tiempo y contraste de fase para crear imágenes de macrófagos peritoneales residentes del ratón en un complemento quimiotáctico gradiente C5a. Los protocolos se pueden extender a otras células inmunitarias.

Imágenes de lapso de tiempo de Macrófago de ratón Chemotaxis

Este protocolo proporciona un método de aislamiento primario de células T murinas y microscopía de lapso de tiempo de la migración de células T en condiciones ambientales específicas con análisis cuantitativo.

Ensayo de migración in vitro en tiempo real para linfocitos T murinos CD8+ primarios

Aprende a cuantificar la quimiotaxis de monocitos humanos in vitro y el tráfico de linfocitos murinos in vivo. Estos protocolos permiten evaluaciones cuantitativas en tiempo real para estudios inmunológicos.

Cuantificación de la Quimiotaxis de monocitos humanos In Vitro y linfocitos murinos, tráfico en Vivo

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