Cuantificación de transmigración de monocitos y formación de la célula de la espuma de individuos con enfermedades inflamatorias crónicas

El objetivo general de este ensayo es cuantificar la capacidad de los monocitos de muestras clínicas humanas para experimentar migración transendotelial y formación de células espumosas. Este método se puede utilizar para responder a preguntas clave en el campo cardiovascular, como el potencial aterogénico de las células de individuos que corren el riesgo de sufrir enfermedad arterial coronaria aguda. La principal ventaja de esta técnica es que las muestras clínicas se pueden medir tanto a partir de sangre entera fresca como de cohortes de pacientes almacenadas.

Además, la formación de células espumosas se puede cuantificar tanto por microscopía como por citometría de flujo. Primero, prepare los geles de colágeno polimerizado a partir de una suspensión de colágeno fresco. A un tubo de poliestireno de cinco mililitros, agregue hidróxido de sodio, luego M199 10 veces, luego ácido ácido y, finalmente, agregue colágeno fibroso.

Mezcle esto bien pipeteando. A continuación, alícuota 50 microlitros en los pocillos internos de una placa de cultivo de tejidos estéril de fondo plano de 96 pocillos. En los bordes exteriores de los pozos, cargue 200 microlitros de Dulbecco PBS para evitar la desecación.

Después de dos horas de incubación a 37 grados centígrados, el colágeno se polimerizará. A continuación, superponga los geles con 150 microlitros de M199 suplementado una vez y regolpérelos hasta que los necesite para su uso cinco días después. Para expandir las células endoteliales de la vena umbilical humana almacenadas, prepare un matraz de cultivo de 25 centímetros cuadrados con un mililitro de solución de fibronectina e incube la placa durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Mientras tanto, descongele las células almacenadas en un baño de agua para volver a suspenderlas en M20. Una vez que las células se descongelen, aspire cualquier solución residual de fibronectina de la placa y coloque las células. Luego, la cultura a la confluencia mediante la sustitución de los medios después de dos o tres días.

Los HUVEC deben ser confluentes en el quinto día de cultivo. Sepárelos aspirando el sobrenadante del cultivo del matraz y luego lave el medio que contiene suero usando dos o tres mililitros de PBS una vez. A continuación, añade cinco mililitros de tripsina diluida e incuba las células brevemente a temperatura ambiente agitándolas suavemente hasta que parezcan desprendidas.

Luego, recójalos rápidamente con cinco mililitros de M20 y transfiera la suspensión a un tubo de 10 mililitros y celdas centrifugadas. Ahora, vuelva a suspender las células en M20 a 200.000 células por mililitro. A continuación, aspire el M199 de la placa de colágeno preparada y añada 100 microlitros de HUVEC a cada gel.

Continúa la cultura durante tres días. En el octavo día de cultivo de los HUVEC, active las monocapas antes de agregar los monocitos. Después de aspirar el medio de recubrimiento, agregue 100 microlitros de solución humana de TNF-alfa a cada pocillo.

Luego, incuba la placa a 37 grados centígrados durante cuatro horas. Después de la incubación, retire el medio y lave los geles dos veces con 100 microlitros de M199 por lavado. Ahora, agregue 50.000 monocitos recién aislados o subconjuntos de monocitos purificados en 100 microlitros de M20 a las monocapas de HUVEC.

Después de agregar los monocitos, incube la placa durante una hora para permitir la transmigración hacia adelante de las células. Después de una hora, recoja las células no transmigradas en una solución de lavado. Comience agrupando dos lavados EGTA con 100 microlitros por pocillo.

A continuación, reduzca las soluciones de lavado combinadas a 300 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 30 microlitros de PBS y cuente las células para determinar el porcentaje de células transmigradas hacia adelante. Ahora, lave los pocillos de la placa una vez con M199 y agregue 100 microlitros de M20 fresco a los pocillos de la placa e incube la placa durante dos días.

Después de dos días, repita el procedimiento para recolectar las células no transmigradas en la solución de lavado EGTA para recolectar las células transmigradas inversas y proceda con el análisis fenotípico de las células. Para caracterizar fenotípicamente las células unidas a gel mediante el análisis FACS, digiera las células agregando 100 microlitros de colágeno D a 37 grados centígrados e incubando durante 20 minutos a 37 grados centígrados. Después de la incubación, macerar los geles con una punta de pipeta de 200 microlitros e incubarlos durante 20 minutos más para digerir completamente los geles.

Una vez que se hayan digerido por completo, filtre y agrupe los geles replicados digeridos a través de una malla de nailon de 35 micras en un tubo FACS sobre hielo. Ahora, lave las celdas filtradas una vez con una solución de lavado FACS fría. Centrifugar las células y resuspenderlas en 100 microlitros de solución de lavado en frío.

A continuación, realice la tinción y el análisis de FACS de acuerdo con el protocolo de texto. Para analizar las células por microscopía, primero tiña las células como se describe en el protocolo de texto. Para separar las células teñidas, bordee los pocillos con una aguja de calibre 21 con el bisel hacia afuera.

A continuación, prepare los portaobjetos para montar los geles. Perfore dos agujeros pequeños en una tira de cinta adhesiva de doble cara y luego fije la cinta a la corredera y retire la capa protectora. A continuación, añade una gota de agua a cada agujero de la cinta.

Luego, con unas pinzas, transfiera suavemente dos geles a los dos orificios y cubra la cinta. Finalmente, adjunte con cuidado un cubreobjetos a la cinta y proceda con la visualización de las celdas. Después de la transmigración, las células no transmigradas se contaron como se describe.

Se recuperaron un total de 15.000 células no transmigradas, y se determinó que el porcentaje de transmigración directa era del 95%Después de 48 horas de incubación adicional, se recuperaron 36.000 células transmigradas inversas, lo que equivale al 12,6% de transmigración inversa. Al teñir los geles con aceite rojo O, se revelaron células espumosas señaladas con flechas blancas y macrófagos señalados con flechas negras. Estos monocitos fueron tratados con LDL oxidado durante la transmigración, una sustancia utilizada para inducir la formación de células espumosas en modelos convencionales de inducción de células espumosas.

Los datos agregados del recuento de células de 12 donantes confirmaron que la incubación de monocitos con LDL oxidado indujo más formación de células espumosas que cuando los monocitos se incuban solo con LDL nativo o medios M199. Las células transmigradas también se analizaron por citometría de flujo. Después de excluir las células muertas, los dobletes y los HUVEC CD45 negativos, se seleccionó la población mayor de células migradas y se comparó la intensidad de fluorescencia media de los receptores de interés con los datos de fluorescencia menos uno o control de isotipo.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar este ensayo para cuantificar la migración transendotelial de monocitos y la formación de células espumosas a partir de muestras clínicas humanas. No hay que olvidar que trabajar con muestras clínicas humanas puede ser extremadamente peligroso y siempre se debe utilizar una buena técnica de laboratorio.