Name: Visualización y en proyección de imagen del Oligodendrocyte organelos en rebanadas de cerebro Organotypic mediante Virus Adeno-asociado y Microscopía Confocal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Aprende a visualizar la dinámica mitocondrial en oligodendrocitos usando rebanadas organotípicas de cerebro y microscopía confocal. Este método permite estudiar la respuesta celular a cambios ambientales en tiempo real.

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Agradecemos a Linda Hildegard Bergersen y Magnar Bjørås para el acceso a laboratorio y equipos, personal de Janelia Biología Molecular compartido recursos para la producción de virus y plásmidos y Koen Vervaeke ayuda con medidas de potencia láser de la célula. Este trabajo fue financiado por la Asociación Noruega de salud, el Consejo Noruego de la investigación y el equipo de microscopía fue financiado por Norbrain.

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</ol>

Los autores no declaran conflictos de interés.

El protocolo para hacer las culturas organotypic descritas aquí es una versión modificada18 del protocolo descrito por De Simoni y Yu (2006)5. Los cambios más importantes han sido subrayados a continuación. Tampón Tris se añade al medio de cultivo, que mejora la supervivencia de las láminas cuando están fuera de la incubadora durante la transducción viral y cambio del medio celular. También se modifica el procedimiento de esterilización de confeti. Mientras que otros protoc...

Sustancia blanca del cerebro se compone de axones de neuronas envueltas en mielina, membrana plasmática prolongada especializada formada por oligodendrocitos. Mielina es necesaria para la supervivencia a largo plazo de axones myelinated y propagación del potencial de acción rápido y confiable, y una pérdida de mielina puede causar disfunción neurológica. A pesar de su importancia, las propiedades de los oligodendrocitos son menos conocidos en comparación con las neuronas y astrocitos. En consecuencia, menos herramientas han sido desarrolladas para el estudio de oligodendrocitos.
Vivo la proyección de imagen de orgánulos celulares como mitocondrias, retículo endoplasmatic (ER) o diferentes estructuras vesiculares pueden ser útiles para el estudio de los cambios dinámicos en los organelos en el tiempo. Tradicionalmente, se ha realizado la proyección de imagen de los oligodendrocitos de la vida en monocultivos1,2. Sin embargo, oligodendrocitos en monocultivo no muestran mielina compacta y organotypic o rebanadas de cerebro agudo por lo tanto, pueden ser una mejor opción al estudiar la localización y movimiento de organelos. Localización de pequeños orgánulos y las proteínas en la mielina puede ser difícil debido a la corta distancia entre el axón mielinizado y la vaina de mielina alrededor. Así, luz microscópico immunostaining procedimientos solo no tiene la resolución espacial para discriminar entre orgánulos en la vaina de mielina y el axón mielinizado. Esto se puede solucionar por transducción viral con genes de proteínas fluorescentes dirigidos a organelo impulsados por promotores específicos del tipo de célula. Las ventajas son una expresión celular específicos y escasa, que permite la evaluación precisa de la localización de organelas y dinámica. Animales transgénicos pueden también utilizarse para lograr tal una expresión célula-específica orientada a organelas3. Sin embargo, la producción y mantenimiento de los animales transgénicos es caros y generalmente no ofrece la expresión escasa que puede lograrse mediante métodos virales.
El método descrito aquí utiliza transducción viral de oligodendrocitos con proteínas fluorescentes dirigidos a mitocondrial (dsred o verde fluorescente protein, GFP) impulsado por el promotor de la proteína básica de mielina (MBP-mito-dsred o MBP-mito-GFP) para visualizar mitocondrias de oligodendrocyte en rebanadas de cerebro organotypic. Además, la expresión de otra proteína fluorescente en el citoplasma (GFP con dsred mito o tdtomato con mito-GFP) se utiliza para permitir la visualización de la morfología de la célula, incluyendo los compartimientos citoplásmicos de la vaina de mielina. El protocolo incluye el procedimiento para hacer rebanadas de cerebro organotypic (una versión modificada del protocolo descrito por De Simoni y Yu, 20064,5). A continuación describimos el procedimiento Time-lapse de imágenes para estudiar movimiento mitocondrial. Este procedimiento utiliza un microscopio confocal vertical con un intercambio continuo de medio de imágenes, una configuración que permite la fácil aplicación de drogas u otros cambios medio durante proyección de imagen. El Time-lapse imagen puede realizarse en cualquier microscopio confocal, con algún equipo adicional para el mantenimiento de sectores de la vida como se describe a continuación. El protocolo también contiene varios consejos para optimizar la proyección de imagen y reducir fototoxicidad.
Por último, se describe una forma rápida y simple para visualizar la mielina sin manchas por Microscopía Confocal de la reflexión (núcleo). Esto puede ser útil para identificar la vaina de mielina durante proyección de imagen vivo. En los últimos años, varias técnicas se han desarrollado para mielina imagen sin ninguna tinción requiere, pero la mayoría de estos requieren específicos equipo y experiencia6,7,8. El procedimiento descrito aquí utiliza las propiedades reflectantes de la vaina de mielina y es una versión de longitud de onda de excitación única simplificada de la Microscopía Confocal espectral de la reflexión (la puntuación, en el que varias longitudes de onda del laser se combina para visualizar la mielina) 9. núcleo puede hacerse en cualquier microscopio confocal que tiene un 488 nm láser y un filtro de emisión de banda 470-500 nm o un filtro de emisión ajustables.

<table><tbody><tr><td>Agarosa&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 19G</td><td>BD</td><td>301500</td><td>Agujas utilizadas para la entrada y salida del baño</td></tr><tr><td>Gas de bioóxido Bombillas</td><td></td> de pipeta de la marca <td>AGA</td> 105701 <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z615927</td><td>Bombillas de pipeta</td></tr><tr><td>Quemador Bunsen (Quemador de propano líquido)</td><td>VWR</td><td>89038-530</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de cables para controladores de calefacción</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0106</td><td>Controlador de temperatura - parte del termómetro</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fluka</td><td>21100</td><td></td></tr><tr><td>CO2&nbsp;</td><td>AGA</td><td>100309</td><td>CO2 para incubadora</td></tr><tr><td>Cubreobjetos, cuadrado Corning</td><td>Thermo&nbsp; Fischer Scientific</td><td>13206778</td><td>Para colocar debajo del baño para imágenes en vivo. Selle con pegamento o gelatina de petróleo.</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Pinza delicada</td><td>Finescience</td><td>11063-07</td><td>Para disección</td></tr><tr><td>Rotulador de diamante</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>54463</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de vidrio desechables Pasteur 230 mm</td><td>VWR</td><td>612-1702</td><td>Pipetas de vidrio</td></tr><tr><td>Hoja de afeitar de acero inoxidable de doble filo</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>#7200</td><td>Cuchilla de afeitar para vibratomo</td></tr><tr><td>Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>24010-043</td><td></td></tr><tr><td>Círculos de papel de filtro</td><td>Schleicher & Schuell</td><td>300,220</td><td>Papel de filtro utilizado para la filtración de PFA</td></tr><tr><td>Fun tack</td><td>Loctite</td><td>1270884</td><td>Úselo para conectar/ajustar la posición de entrada y salida en el baño</td></tr><tr><td>Toalla de mano C-Fold 2</td><td>Katrin</td><td>344388</td><td></td></tr><tr><td>Harp, plana para cámara RC-41,</td> <td>Warner Instruments</td><td>&nbsp; 64-1418</td><td>Arpa para sujetar el confeti en el baño. Corte las cuerdas antes de usar con rodajas organotípicas. 1,5 mm, 13 mm, SHD-41/15</td></tr><tr><td>HEPES, FW: 260.3</td><td>Sigma</td><td>H-7006</td><td></td></tr><tr><td>Holten LaminAir, Modelo 1.2</td><td>Heto-Holten</td><td>96004000M</td><td>Campana de flujo laminar Suero</td></tr> de <tr><td>caballo, inactivado por calor</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>LCR Membrana, PTFE,&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>FHLC0130</td><td>confeti&nbsp;</td></tr><tr><td>Leica VT1200</td><td>Leica</td><td>14048142065</td><td>Vibratome</td></tr><tr><td>MEM-Glutamax con HEPES</td><td>Thermo&nbsp; Fischer Scientific</td><td>42360024</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>R.P. Normapur</td><td>25 108.295</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cuchara Heyman Tipo B</td><td>Microscopía Electrónica Ciencias</td><td>62411-B</td><td>Espátula pequeña y redondeada con extremo afilado para disección</td></tr><tr><td>Unidad de filtro Millex-GP</td><td>Millipore</td><td>SLGPM33RA</td><td>Unidad de filtro de jeringa</td></tr><tr><td>Inserto de cultivo de células milicelulares, 30 mm</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td>Insertos de cultivo celular</td></tr><tr><td>Módulo de control Minipuls de 3 velocidades</td><td>GILSON</td><td>F155001</td><td>Bomba peristáltica para imágenes en vivo - Parte del módulo de control (conectar a un cabezal de dos canales)</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fluka</td><td>71628</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta</td><td>Surface Thermo&nbsp; Fischer Scientific</td><td>140675</td><td>Placa de cultivo</td></tr><tr><td>Suspensión de nistatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1638</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>441452-9900-000&nbsp;</td><td>Objetivo de inmersión en agua utilizado para imágenes en vivo. (WD=2,5 mm), VIS-IR</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>291-1211</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído, granular</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>#19208</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de perfusión PC-R</td><td>SiSkiYou</td><td>&nbsp; 15280000E</td><td>Baño para imágenes en vivo</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina, líquido</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri 140 mm&nbsp;</td><td>Heger</td><td>1075</td><td>Placa de Petri grande&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de Petri 92x16 mm&nbsp;</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>82.1473</td><td>Placa de Petri mediana&nbsp;</td></tr><tr><td>Petridish 55x14,2 mm</td><td>VWR</td><td>391-0868</td><td>Placa de Petri pequeña Solución</td></tr><tr><td>salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td>PBS comprimidos</td></tr><tr><td>R2 Cabezal de dos canales&nbsp;</td><td>GILSON</td><td>F117800</td><td>Bomba peristáltica para imágenes en vivo - Cabezal de dos canales (requiere módulo de control)</td></tr><tr><td>Espátulas redondas/planas, acero inoxidable</td><td>VWR</td><td>82027-528</td><td>Espátula grande para disección</td></tr><tr><td>Papel de lija</td><td>VWR</td><td>MMMA63119</td><td>Opcional, para alisar pipetas de vidrio roto</td></tr><tr><td>Tijeras,&nbsp; 17,5 cm</td><td>Finescience</td><td>14130-17</td><td>Tijeras grandes para disección</td></tr><tr><td>Tijeras, 8,5&nbsp;</td><td>Finescience</td><td>14084-08</td><td>Tijeras pequeñas y afiladas para disección</td></tr><tr><td>Hoja de un solo filo</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>#71972</td><td>Hoja de afeitar de un solo filo</td></tr><tr><td>Calentador de solución en línea simple SH-27B</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102 Controlador de</td><td>temperatura - parte del calentador</td></tr><tr><td>Unidad de filtro Steritop-GP, 500 ml , 45 mm</td><td>Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td>Filtro para esterilizar soluciones</td></tr><tr><td>Súper pegamento precisión</td><td>Loctite</td><td>1577386</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de bisturí quirúrgico n.º 22</td><td>Swann Morton Ltd.</td><td>209</td><td>Hoja de bisturí redondeada</td></tr><tr><td>Controlador de temperatura TC324B</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0100 Controlador de</td><td>temperatura para imágenes en vivo (requiere solución de calentador y ensamblaje de cables)</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trizma HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora con camisa de agua serie II</td><td>Incubadora Forma Scientific</td><td>78653-2882</td><td></td></tr></tbody></table>

visualización y en proyección de imagen del oligodendrocyte organelos en rebanadas de cerebro organotypic mediante virus adeno-asociado y microscopía confocal

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Las neuronas dependen del aislamiento eléctrico y soporte trófico de oligodendrocytes myelinating. A pesar de la importancia de los oligodendrocitos, las herramientas avanzadas actualmente utilizadas para estudiar las neuronas, sólo en parte se han tomado por los investigadores del oligodendrocyte. Celular tipo-específicas de tinción por transducción viral es un enfoque útil para estudiar dinámica organelo vivo. Este papel describe un protocolo para visualizar las mitocondrias oligodendrocyte en rebanadas de cerebro organotypic por transducción con virus adeno-asociado (AAV) portadores de genes para proteínas mitocondriales de fluorescentes específicos bajo el control transcripcional de el promotor de la proteína básica de mielina. Incluye el protocolo para hacer organotypic rodajas de cerebro de ratón coronal. Un procedimiento para Time-lapse de imágenes de las mitocondrias luego sigue. Estos métodos pueden ser transferidos a otros organelos y pueden ser particularmente útiles para el estudio de organelos en la vaina de mielina. Finalmente, describimos una técnica fácilmente disponible para la visualización de la mielina sin manchas en rebanadas de vida por microscopia Confocal de la reflexión (núcleo). No requiere ningún equipo adicional y puede ser útil para identificar la vaina de mielina durante proyección de imagen vivo.

Rebanadas de cerebro Organotypic que fueron cultivadas y transduced como se describe anteriormente demostraron una escasa distribución de corticales oligodendrocitos expresan mito_dsred y GFP. Immunostaining con los anticuerpos contra Olig2 y MBP confirmaron que la expresión era específica de oligodendrocitos (figura 1).
Para la proyección de imagen vivo, oligodendrocitos transduced fueron reconocid...

Oligodendrocytes myelinating promoción la propagación del potencial de acción rápida y la supervivencia neuronal. Descrito aquí es un protocolo específico de oligodendrocyte expresión de proteínas fluorescentes en organotypic rebanadas de cerebro con imágenes de lapso de tiempo posterior. Además, se presenta un procedimiento sencillo para la visualización de mielina sin manchas.

Visualización y en proyección de imagen del Oligodendrocyte organelos en rebanadas de cerebro Organotypic mediante Virus Adeno-asociado y Microscopía Confocal

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

El objetivo general de esta transducción viral y grabación con lapso de tiempo es visualizar el movimiento de las mitocondrias de oligodendrocitos en cortes cerebrales organotípicos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los oligodendrocitos, como la forma en que los oligodendrocitos y sus orgánulos responden a los cambios en el entorno local. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona información detallada sobre la estructura de los oligodendrocitos y la dinámica de sus orgánulos en una preparación donde están presentes todos los diferentes tipos celulares del cerebro y los oligodendrocitos producen mielina compacta. Transducir los oligodendrocitos en cultivos de cortes al séptimo día in vitro. Primero, aspirar 1,3 microlitros de AAV diluido por corte. Asegurándose de que el exterior de la punta de pipeta esté seco, sostener la pipeta por encima de la corteza lo más cerca posible sin tocar el corte con la punta y expulsar lentamente la solución de la pipeta. Cuando la solución toque el corte, mover la punta de la pipeta sobre la corteza para extender la solución sobre toda el área cortical. Una vez que todos los cortes en un plato hayan s

visualization-live-imaging-oligodendrocyte-organelles-organotypic

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Aquí presentamos la inyección intracraneal de vectores AAV de marcaje fluorescente de las neuronas y la glía en la corteza visual.

Inyección intracraneal de adeno-asociado vectores virales

Este protocolo describe un ensayo de corte organotípicos optimizado para el cerebro postnatal y de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo de la migración de los neuroblastos en la corriente migratoria rostral.

Un ensayo Cortar organotípicos de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo de la migración neuronal en el cerebro postnatal

Fuente: Kennedy, L. H., et. al. Visualización e imagen en vivo de orgánulos de oligodendrocitos en cortes de cerebro organotípicos utilizando virus adenoasociados y microscopía confocal. J. Vis. Exp. (2017)Este video muestra la imagen de las mitocondrias de oligodendrocitos en cortes de cerebro de ratón organotípicos. La loncha se coloca dentro de una cámara de baño con circulación continua de fluido y temperatura controlada. Después de configurar varios parámetros del microscopio confocal, se...

Imágenes confocales del movimiento mitocondrial dentro de los oligodendrocitos en cultivos organotípicos de cortes de cerebro

Fuente: Moye, S. L., et.al.  Visualización de la morfología de los astrocitos mediante la iontoforesis amarilla de Lucifer. J. Vis. Exp. (2019).  Este video demuestra el uso de la iontoforesis de colorante fluorescente para estudiar la morfología de los astrocitos en cortes de cerebro fijos. Detalla la perforación del soma del astrocito con un electrodo para administrar un tinte aniónico e hidrofílico en el citoplasma bajo una corriente de bajo voltaje, lo que permite que el tinte se difunda y...

Visualización de la morfología de los astrocitos mediante iontoforesis de colorante fluorescente en un corte fijo de cerebro de ratón

Se describe una técnica para estudiar las células NG2 y los oligodendrocitos utilizando un sistema de cultivo en cortes del prosencéfalo y el cerebelo.  Este método permite examinar la dinámica de proliferación y diferenciación de las células dentro del linaje de oligodendrocitos, donde el entorno extracelular puede manipularse fácilmente mientras se mantiene la citoarquitectura tisular.

Culturas Organotípicos Slice para Estudiar Oligodendrocyte Dinámica y mielinización

Para abordar los mecanismos de desmielinización y apoptosis neuronal en lesiones corticales de trastornos inflamatorios desmielinizantes, se utilizan diferentes modelos animales. Aquí describimos un enfoque ex vivo mediante el uso de células T CD8+ específicas de oligodendrocitos en cortes de cerebro, lo que resulta en la muerte oligodendroglial y neuronal. Se discuten las posibles aplicaciones y limitaciones del modelo.

Una Ex vivo Modelo de un ataque de células T Oligodendrocyte dirigida en Rebanadas cerebral agudo

Presentado aquí es un método de tubo de rodillo modificado para cultivo e intermitente proyección de imagen de alta resolución del cerebro de roedor rodajas durante muchas semanas con reposicionamiento preciso en photoetched cubreobjetos. Viabilidad neuronal y la morfología de la rebanada se mantienen bien. Se proporcionan aplicaciones de este sistema totalmente cerrado con virus para la expresión específica de tipo celular.

Método de tubo de rodillo modificado precisamente localizada y repetitiva imagen intermitente durante el cultivo a largo plazo de las rebanadas de cerebro en un sistema cerrado

Describimos un protocolo para la expresión específica de tipo celular del sensor basado en FRET genéticamente codificado ATeam1.03YEMK en cultivos de rebanadas organotípicas del forebrain del ratón. Además, mostramos cómo utilizar este sensor para imágenes dinámicas de los niveles de ATP celular en neuronas y astrocitos.

Imagen de ATP intracelular en rebanadas de tejido organotípico del cerebro del ratón utilizando el sensor basado en FRET ATeam1.03YEMK

Aquí, presentamos un método para investigar la morfogénesis de neuritas en explantes retinianos de ratón postnatales mediante microscopía confocal de lapso de tiempo. Describimos un enfoque para el etiquetado disperso y la adquisición de tipos de células retinianas y sus procesos finos utilizando vectores de virus adenoasociados recombinantes que expresan proteínas fluorescentes dirigidas a la membrana de una manera dependiente de Cre.

Imágenes de lapso de tiempo de arborización neuronal utilizando el etiquetado de virus adenoasociados dispersos de poblaciones de células retinianas genéticamente dirigidas

Aquí, describimos un protocolo que combina la inyección de virus adenoasociados con la implantación de ventana craneal para obtener imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos.

Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos

Aprende a visualizar la dinámica mitocondrial en oligodendrocitos usando rebanadas organotípicas de cerebro y microscopía confocal. Este método permite estudiar la respuesta celular a cambios ambientales en tiempo real.

Visualización y en proyección de imagen del Oligodendrocyte organelos en rebanadas de cerebro Organotypic mediante Virus Adeno-asociado y Microscopía Confocal (Video) | JoVE Journal

Visualización y en proyección de imagen del Oligodendrocyte organelos en rebanadas de cerebro Organotypic mediante Virus Adeno-asociado y Microscopía Confocal

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