Caracterización bioquímica y estructural de la SP0092 de proteína de unión a sustrato de transporte de hidratos de carbono

El objetivo general de este procedimiento es la caracterización bioquímica y estructural de una proteína de unión al sustrato de carbohidratos de Streptococcus pneumoniae. Este método puede ayudar a proporcionar datos clave para ayudar a los estudios instructivos de la proteína de unión al sustrato, como la identificación de los perfiles de estabilidad del tampón, los estados de oligomerización y las estructuras atómicas. Las ventajas de este procedimiento es que proporciona datos que pueden aumentar la tasa de éxito de la cristalización y la solución de estructura para las proteínas de unión al sustrato de una manera robusta y sencilla.

Primero, prepare 48 soluciones tampón con un rango de pH de 4.0 a 9.5 y concentraciones de cloruro de sodio que van de cero a 0.5 molar. Dispense 40 microlitros de cada solución en una placa de 96 pocillos. Obtener una solución purificada de la proteína de unión al sustrato elegida.

Agregue cinco microlitros de la solución SBP a cada pocillo para obtener una concentración de uno a dos miligramos por mililitro. A continuación, añada cinco microlitros de una tinción fluorescente 20 veces concentrada a cada pocillo. Mezcle las soluciones pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

Selle la placa con una película adhesiva transparente. Centrifugar la placa a 112 veces G a temperatura ambiente durante dos minutos. Configure un sistema de PCR en tiempo real para que pase de cuatro a 99 grados Celsius a una velocidad de tres grados por minuto con un tiempo de espera de 10 segundos.

Configure el sistema para tomar lecturas de fluorescencia cada medio grado. Establezca la configuración del filtro de fluorescencia. y asigne las muestras.

Ejecute el experimento e identifique la condición de tampón con la temperatura de fusión más alta. A continuación, prepare un tampón con el pH y la concentración de cloruro de sodio elegidos que incluya un 2,5% en volumen de glicerol y una concentración de TCEP de 0,5 milimolares. Caracterice la PAS purificada con cromatografía analítica de exclusión por tamaño con dispersión de luz multiángulo.

Identificar las especies más estables aptas para la cristalización, y utilizar el SEC preparatorio para obtener fracciones puras de esas especies. Realizar pruebas de precristalización para determinar la concentración óptima de proteínas para la cristalización. Utilice un sistema robótico de cristalización para dispensar las soluciones de cristalización comerciales deseadas en los depósitos de solución de una placa abatible óptica de 96 pocillos.

A continuación, utilice el sistema para dispensar 100 nanolitros de la solución proteica en cada pocillo de cristalización. Transfiera 100 nanolitros de cada solución de cristalización desde los pozos del depósito a las gotas de pozo correspondientes. Selle la placa con una película adhesiva óptica.

Utilice un microscopio o un sistema de imágenes automatizado para evaluar la formación y el crecimiento de los cristales cada uno o dos días durante dos semanas, y una vez a la semana a partir de entonces. Cuando se hayan formado cristales suficientemente grandes y bien formados, prepare un lote de la solución de cristalización con un 25% adicional de volumen de glicerol para que sirva como crioprotector. A continuación, llene un dewar de espuma con nitrógeno líquido.

Sumerja un recinto de muestra unipuck en el nitrógeno líquido y deje que el recinto se enfríe. A continuación, recorta la película sobre una gota que contenga un cristal de interés. Deposite 0,5 microlitros del crioprotector en un portaobjetos de cubierta cerca de la gota o en la cámara de caída vacía de la misma condición, si está disponible.

Fije a una varilla magnética un cryoloop montado en una base estándar SPINE. Utilice el cryoloop para transferir el cristal de interés a la gota de crioprotector. A continuación, utilice el cryoloop para transferir el cristal del crioprotector a la primera posición vacía del recinto de muestras unipuck sumergido.

Repite este proceso para recolectar cristales adicionales. Una vez que todos los cristales de interés se hayan cargado en el recinto de muestra, utilice la varilla de disco para colocar la placa base de unipuck en el recinto. Transporta el unipuck en nitrógeno líquido a la línea de luz.

Utilice pinzas criogénicas y una herramienta de carga de disco dewar para cargar el unipuck en el cambiador de muestras de la línea de luz dewar y para separar el recinto de muestras. A continuación, seleccione la muestra en el software de la línea de luz para cargar y centrar automáticamente la muestra en el haz de rayos X. Adquiera un espectro fluorescente de rayos X e identifique cualquier elemento que se pueda utilizar en un experimento de difracción anómala.

Determine la longitud de onda óptima para recopilar datos de difracción anómala mediante la realización de un escaneo de energía de borde de absorción de rayos X. Luego adquiera tres patrones de difracción de rayos X a intervalos de 45 grados en modo de oscilación estándar para determinar automáticamente los parámetros de la celda unitaria de cristal, la simetría y el límite de difracción. Importe los parámetros de recopilación de datos recomendados en el software de la línea de luz y ejecute un experimento de difracción anómala de una o varias longitudes de onda, según corresponda.

Se evaluó la estabilidad de la proteína de unión al sustrato SP0092 en varios tampones de sal para identificar la solución tampón óptima. Las temperaturas de fusión más altas se encontraron para los tampones con un pH de 6,5 y concentraciones de cloruro de sodio que oscilaron entre cero y 0,2 molar. Para el procedimiento se seleccionó un tampón con un pH de 6,5 y una concentración de cloruro de sodio de 0,2 molar.

Los diversos estados de oligomerización de SP0092 se identificaron y separaron con SEC-MALS. Un análisis del perfil SEC a diferentes concentraciones de proteínas indicó que el aumento de la concentración de proteínas desencadena la oligomerización, lo que sugiere que los oligómeros más grandes son más estables a altas concentraciones. De acuerdo con esto, los grandes oligómeros produjeron cristales en los ensayos de cristalización, mientras que el monómero no lo hizo.

La fluorescencia de rayos X de los cristales SP0092 nativos y marcados con selenometionina indicó que el zinc se unió a la proteína en ambas formas. La señal anómala se maximizó ajustando la longitud de onda de rayos X incidente a los bordes de absorción de rayos X de zinc o selenio. A continuación, se obtuvo un conjunto completo de datos anómalos, y el análisis automatizado desencadenado por la presencia de una señal anómala generó mapas iniciales de las estructuras de las proteínas.

Los modelos incorporados en estos mapas iniciales se refinaron y validaron para producir los modelos finales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo completar una caracterización estructural completa de una proteína de unión al sustrato o de cualquier proteína objetivo potencial. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el desarrollo de nuevas terapias para la enfermedad mirocócica, ya que proporciona información fundamental para el diseño basado en la estructura de inhibidores de esta clase de proteínas.

Estos métodos también se pueden aplicar a proteínas de unión a sustratos de otros organismos, y potencialmente se pueden utilizar para cualquier tipo de proteína.