Plataforma modular de selección automatizados de alto rendimiento de exopolisacáridos Junto con el análisis de carbohidratos de la huella digital de alta sensibilidad

El objetivo general de este enfoque es la detección rápida y fiable de los productores de exopolisacáridos microbianos y la identificación de su huella digital de carbohidratos. Este es un paso esencial para utilizar la diversidad inexplorada de exopolisacáridos. Nuestro método puede ayudar a acelerar la investigación de polímeros en el campo de los exopolisacáridos microbianos.

Permite la identificación rápida de nuevas variantes de polisacáridos con diferentes propiedades para aplicaciones específicas. La principal ventaja de esta técnica es la combinación de diferentes sistemas de detección de exopolisacáridos en un concepto de cribado modular y completamente automatizado. Esto lo hace extremadamente rápido y confiable.

Esta técnica también se puede realizar de forma manual en laboratorios donde no se dispone de una plataforma de automatización, por lo que su uso es muy flexible y se puede ajustar a las diferentes necesidades de cribado. Esta plataforma de cribado de exopolisacáridos, o EPS, tiene una configuración modular, que permite una separación del protocolo en dos partes principales, el cribado automatizado y la huella digital de carbohidratos. La primera tarea es cultivar las cepas para el cribado y eliminar las células por centrifugación.

Las cepas se cultivan en glucosa como fuente de carbono en placas de 96 pocillos cubiertas con una película de sellado transpirable en un agitador de placas de microtítulo a 30 grados Celsius y 1.000 RPM. El día de la pantalla, prepare la mesa de trabajo del robot y el carrusel de almacenamiento como se describe en el texto del protocolo. Retire la película de sellado transpirable de las placas y asigne los cultivos principales en las posiciones de carrusel 1-1 a 1-4.

Inicie el programa robótico automatizado. Para eliminar las células después del cultivo, transfiera las placas de pocillos profundos de cultivo principales del carrusel a la centrífuga y centrifuga a 4, 300 x g y 20 grados Celsius durante 30 minutos. Para la precipitación antes de la filtración, mueva las placas de microtitulación, así como las placas de microtitulación indicadoras de pH, del carrusel a la mesa de trabajo.

Transfiera también las placas de filtración, que aseguran la eliminación completa de todas las células bacterianas, junto con las placas colectoras a sus posiciones de mesa de trabajo. Después de la centrifugación, transfiera 180 microlitros del sobrenadante de cultivo principal a la placa de filtración. Aspire 150 microlitros del sobrenadante del cultivo principal y dispense 50 microlitros en la placa de microtitulación para la precipitación antes de la filtración, y 100 microlitros en la placa indicadora de pH.

La precipitación del sobrenadante con 2-propanol se realiza para evaluar la producción de EPS. Utilice una pipeta de varios pasos de 12,5 mililitros para añadir manualmente 150 microlitros de 2-propanol a cada pocillo. Después de agitar las placas de microtitulación a temperatura ambiente durante 10 minutos a 900 RPM, observe visualmente las formaciones de fibras o escamas que indican la producción de EPS.

Después de que las placas de cultivo principales se almacenen de nuevo en el carrusel, examine los caldos de fermentación, que deberían mostrar una sedimentación disminuida después de la centrifugación. El aumento de la viscosidad es otra indicación de la producción de EPS. La segunda tarea es asegurar la eliminación completa de las células del caldo de fermentación viscoso a través de una filtración de 96 pocillos.

Centrifugar las placas de filtración a 3.000 x g y 20 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, vuelva a colocar las placas en su posición de inicio del carrusel y realice el equilibrio de la filtración de gel como se describe en el texto del protocolo. A continuación, pipetee 35 microlitros de filtrado en el centro de la placa de filtración de gel equilibrada y 50 microlitros en la placa de microtítulo que se utiliza para la precipitación.

Mueva las placas de filtración de gel a la centrífuga y mueva todas las demás placas de la mesa de trabajo a las posiciones iniciales en el carrusel. Después de almacenar todas las placas en el carrusel, tome nota de los sobrenadantes altamente viscosos según lo indicado por los residuos en la placa del filtro. La falta de filtrado puede dar lugar a resultados falsos negativos en los siguientes módulos analíticos.

La tercera tarea en el cribado automatizado es la eliminación de los azúcares monoméricos restantes del medio de crecimiento a través de una filtración en gel de 96 pocillos. Centrifugar las placas de filtración de gel a 1.000 x g y 20 grados centígrados durante dos minutos. Prepare la mesa de trabajo a través del manipulador robótico para procesar los filtrados de gel.

Para detectar la glucosa restante después de la filtración en gel, utilizamos consejos de 50 microlitros para transferir 25 microlitros de agua doblemente destilada a una placa de microtítulo fresca. Aspire 20 microlitros de agua doblemente destilada, cinco microlitros de aire y 5 microlitros de gel-filtrado, y dispense en la misma placa. Tome puntas de 200 microlitros y aspire 50 microlitros de mezcla de reactivos de ensayo de glucosa desde la posición 1-2 de la mesa de trabajo para comenzar el primer ensayo.

Mueva las placas de microtitulación a la incubadora. Después de 30 minutos de incubación, mueva las placas de la incubadora al lector de microtítulos y registre la absorbancia a 418 y 480 nanómetros. Para determinar el contenido total de carbohidratos por el método de ácido fenol-sulfúrico, pipetee 20 microlitros de filtrado de gel en las placas de microtítulo.

Retire manualmente las placas del carrusel y colóquelas en la estación de manejo de líquidos. Incluye la placa de calibración con 20 microlitros de diferentes concentraciones de glucosa por triplicado. Coloque un contenedor de residuos en la posición 1, una caja de puntas de 300 microlitros en la posición 2 y un comedero de 250 mililitros con 110 mililitros de ácido fenol-sulfúrico recién preparado en la posición 3.

Utilice una pipeta de 8 canales con puntas de 300 microlitros para transferir 180 microlitros de ácido fenol-sulfúrico a cada fila de todas las placas. Cubra todas las placas de micro titulación con tapas y mezcle agitando durante cinco minutos a 900 RPM a temperatura ambiente. Incubar durante 35 minutos a 80 grados centígrados en un horno para la reacción del color.

Después de enfriar las placas bajo una campana extractora, mida la extinción a 480 nanómetros. Las cepas del cribado automatizado se designan como positivas para EPS si cumplen al menos dos de los tres criterios siguientes. Control de viscosidad, detección de polímero y cálculo de equivalente de glucosa.

El equivalente de glucosa se calcula utilizando esta ecuación. La huella digital de carbohidratos de la plataforma de cribado contiene las tres últimas tareas que se realizan manualmente. El filtrado restante de los impactos positivos de la tarea dos proporciona la base para el filtrado de gel en la tarea cinco.

La sexta tarea es la microhidrólisis de 96 pocillos del filtrado de gel. Para lograr esto, primero use una pipeta de 12 canales y 50 microlitros para transferir 20 microlitros de filtrado de gel a una nueva placa de PCR. A continuación, utilice una pipeta multipaso de 1,25 mililitros para añadir 20 microlitros de ácido trifluoroacético cuatro molares a cada pocillo.

Cubra la placa de PCR con una alfombrilla de tapa de elastómero termoplástico y coloque la placa de PCR en un dispositivo de sujeción especial. Mezcle las soluciones invirtiendo el dispositivo de sujeción 10 veces. Después de centrifugar la placa de PCR y asegurarla en el dispositivo de sujeción, coloque el dispositivo de sujeción asegurado en un baño de arena precalentado e incube a 121 grados centígrados durante 90 minutos.

Con una pipeta de 12 canales y 200 microlitros, añada una solución de amoníaco al 3,2 % para ajustar el pH a aproximadamente ocho. Cubra la placa de PCR con una alfombrilla de elastómero termoplástico y agítela manualmente con el dispositivo de sujeción. La tarea final es analizar la huella digital de carbohidratos a través del método de alto rendimiento de 1-fenil-3-metil-5-pirazolona, o HTPMP.

Para comenzar este procedimiento, utilice una pipeta de 12 canales y 50 microlitros para transferir 25 microlitros del hidrolizado neutralizado a una placa de PCR nueva. Agregue 75 microlitros de reactivo de derivatización y cubra la placa con una estera de tapa de elastómero termoplástico. Coloque la placa de PCR en un ciclador de PCR a 70 grados centígrados durante 100 minutos, seguido de un enfriamiento a 20 grados centígrados.

Transfiera una alícuota de 20 microlitros a una nueva placa de microtitulación, luego use una pipeta de 12 canales y 200 microlitros para agregar 130 microlitros de ácido acético de 19,23 milimolares a cada línea. Mezcle directamente a través de la aspiración y la dispensación al menos seis veces, y transfiera todo el líquido a una placa de filtro de 0,2 micrómetros con una placa colectora de microtítulo. Centrifugar la placa a 1.000 x g durante cinco minutos, retire la placa del filtro y selle la placa colectora de microtítulos con una alfombrilla de silicona.

Coloque la placa de microtitulación en el UHPLC-UV-ESI-MS para la determinación de la huella dactilar de carbohidratos. En esta tabla se muestran los resultados de tres nuevas cepas ejemplares identificadas con éxito con esta plataforma de cribado. La parte izquierda de la tabla muestra los resultados de los módulos de cribado automatizados relativos a la formación de viscosidad, la producción de polímeros y el equivalente de glucosa de la hidrólisis total, que se utilizaron como parámetros de evaluación para el análisis detallado de las huellas dactilares de carbohidratos.

La huella digital de carbohidratos basada en azúcares calibrados, así como en azúcares, dímeros y sustituyentes desconocidos, se da en la parte derecha de la tabla. Mediante el uso de esta información, se puede calcular la composición monomérica y compararla con estructuras poliméricas ya conocidas. Además, se puede realizar un cribado específico de composiciones monoméricas interesantes y carbohidratos raros.

Una vez dominada, esta técnica se puede hacer para 386 cepas en solo cinco horas. Siguiendo este procedimiento, se pueden incluir ensayos adicionales como el piruvato ya existente o ensayos adicionales para acetatos o fosfato con el fin de responder a la pregunta adicional de la declaración de exopolisacáridos. Después de su desarrollo, esta técnica, por su alta sensibilidad, allanó el camino para nuestra investigación en el campo de los productores de exopolisacáridos microbianos mediante ingeniería genética para explorar el efecto de las vías biosintéticas de exopolisacáridos alteradas en la estructura química residente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar nuevos productores de exopolisacáridos de una manera muy rápida y confiable.