Name: Plataforma modular de selección automatizados de alto rendimiento de exopolisacáridos Junto con el análisis de carbohidratos de la huella digital de alta sensibilidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Aprenda a realizar un cribado automatizado de alto rendimiento para productores de exopolisacáridos microbianos y la identificación de huellas dactilares de carbohidratos. Este método modular acelera la investigación de polímeros.

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Agradecemos sinceramente a Thomas Howe y Jörg Carsten por la programación y el soporte técnico con los sistemas de manejo de líquidos.

<ol><li>Milani, J., Maleki, G. Ch. 2, Hydrocolloids in Food Industry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMilani%2C+J+%22Food+Industrial+Processes+-+Methods+and+Equipment%22">Food Industrial Processes - Methods and Equipment</a>. Valdez, B. 2, InTech. (2012).</li>
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<li>Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+method+for+determination+of+sugars+and+related+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Anal. Chem. 28 (3), 350-356 (1956).</li>
<li>Masuko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+analysis+by+a+phenol-sulfuric+acid+method+in+microplate+format%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format.</a> Anal Biochem. 339 (1), 69-72 (2005).</li>
<li>Geater, C. W., Fehr, W. R., Wilson, L. A., Robyt, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+rapid+method+of+total+sugar+analysis+for+soybean+seed%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Sci%22%5BJournal%5D)">A more rapid method of total sugar analysis for soybean seed.</a> Crop Sci. 41 (1), 250-252 (2001).</li>
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<li>Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+carbohydrate+analysis+via+liquid+chromatography+coupled+with+ultra+violet+and+electrospray+ionization+ion+trap+detection+in+96-well+format%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Fast carbohydrate analysis via liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection in 96-well format.</a> J. Chromatogr. A. 1350, 44-50 (2014).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

Detección de polisacárido con el método de fenol-ácido sulfúrico-: Diferentes monosacáridos muestran diferentes máximos de absorción y coeficientes de extinción molar por el uso de este método 9. Esto da lugar a diferentes máximos de absorción de los polímeros, que contienen varios azúcares en cantidades diferentes. Las diferentes longitudes de onda de absorción máxima para 16 polímeros disponibles en el mercado diferentes se dan en la Tabla 5. Los polímeros se disolvieron (1 g / L) en ddH 2 O, se agitó (150 rpm) durante la noche y se mide con el fenol-ácido sulfúrico-método . goma Diutan mostró los máximos de absorción más baja a 470 nm y ácido hialurónico escleroglucano y la más alta en 484 nm. Basándose en estos resultados 480 nm fue elegido para esta plataforma de cribado. La absorbancia relativa de los polímeros se calculó basándose en la absorbancia obtenida con 1 g / l de glucosa (establecido como 100%). Los resultados más bajos se obtuvieron con escleroglucano y succinoglicano, ambos con 92%. Este fue expreflejada porque escleroglucano solamente contiene glucosa y succinoglicano contiene glucosa y galactosa en una proporción de 7: 1. Ambos polímeros comerciales tienen diferentes pérdidas de secado y diferentes contenidos de cenizas, esta es la razón por la cual no se alcanzó el valor teórico de ~ 110%. Xylan mostró la absorbancia relativa más alta con 311%. La razón de esto es el alto coeficiente de extinción molar logrado a partir de xilosa debido a la forma de furanosa más dominante. A un nivel de 0,1 g / L de glucosa se alcanza el límite de cuantificación, así como el límite de detección a una concentración &lt;0,05 g / L. Sin embargo, el límite de detección para las cepas positivas en la proyección es mayor que 0,7 g / L y por lo tanto, el ensayo mostró un buen rendimiento. Con el fin de conseguir resultados fiables, la glucosa restante después de filtración en gel se determinó con un ensayo de glucosa-y este valor se resta del valor a partir del método de fenol-ácido sulfúrico. dilución de la glucosa-Ensayo automatizado: El desempeñode la determinación de glucosa después del cultivo (dilución 1: 100) se investigó. Para esto, 10 l de sobrenadante fueron transferidos a 990 l de ddH 2 O en una placa de pozo profundo y se mezclan a través de diez veces aspiración y dispensación 180 l de esta dilución. El segundo paso crítico fue el pipeteado correcto de solamente 5 alícuota l de la dilución 1:10 de la glucosa-ensayo después de filtración en gel. Con el fin de generar el l de dilución 25 de ddH 2 O fueron transferidos con una l-punta 50 primero, después 20 l de ddH 2 O y 5 l de gel filtrado fueron aspirados juntos. Esto asegura una mejor eliminación de la alícuota de 5 l de la punta. Ambos pasos de dilución fueron verificadas con varios estándares de glucosa a través de una glucosa-ensayo. Los resultados para dos concentraciones ejemplares se dan en la Tabla 6 El 1:. Dilución 100 para la determinación del contenido de glucosa después del cultivo mostró una alta precisión para los estándares con un CV &amp; #60; 1,2%. Al mismo tiempo, la precisión de la norma más alta fue de hasta 11,6 (error%). Sin embargo, esto es insignificante como la determinación de la glucosa representa sólo el contenido de glucosa restante después del cultivo y, por tanto, no es importante para la detección del polímero. La dilución 1:10 de la glucosa que queda después de filtración en gel mostró resultados muy fiables con un CV &lt;1,4% y una precisión &lt;2,1% de error. La consideración de la evaporación: El cribado requiere 3,5 hr de la primera etapa a la primera glucosa-ensayo. Con el fin de averiguar, si este marco de tiempo tiene una influencia en el almacenamiento MTP sin tapar, 50 l de estándares de calibración de glucosa-ensayo fueron almacenados con y sin tapa durante 3,5 horas en el carrusel de robot. En el rango de calibración (45 a 4,5 mg / L) la concentración de la muestra apenas aumentó. Un aumento - causado por la evaporación - estaba por debajo de 2,1% y sólo para las dos concentraciones más bajas (1,8 y 0,9 mg / L) que alcanza hasta el 12,4% ( <strong&gt; Tabla 7). Filtración en gel: Las altas cantidades de glucosa no metabolizada perturban la detección cuantitativa de la glucosa a partir del polímero hidrolizado. Por lo tanto, se requiere una etapa de filtración en gel para eliminar la glucosa restante después del cultivo. Además, el gel-filtración purifica el polímero que contiene sobrenadante de sales y compuestos de hidratos de carbono monoméricos, otros que la glucosa, para minimizar el fondo analítico en el análisis de monómero. En la etapa de filtración en gel se colocaron 35 l de filtrado en el centro del pozo. Para la validación de la robustez de filtración en gel en el sistema automatizado, se filtraron ocho patrones de calibración de 0,045 hasta 9 g / L de glucosa (n = 8). La glucosa de cada concentración siempre se redujo en más de un 95% del valor inicial (Tabla 8). De este modo, la filtración en gel mostró muy buenos resultados para varias concentraciones de glucosa. Además, la glucosa restante después de gel-filtration También se determinó con un ensayo de glucosa y se resta de la determinación de fenol-ácido sulfúrico para recibir la cantidad correcta de glucosa equivalente para el polímero hidrolizado. El piruvato-ensayo: En primer lugar, se investigó si la (1:10) TFA-matriz neutralizado y diluido a partir de la etapa de hidrólisis interfiere con la reacción enzimática. Por lo tanto, el ensayo completo se realizó dos veces, una vez con y otra vez sin matriz y mostró resultados fiables. Finalmente, el contenido de piruvato de 16 polímeros disponibles comercialmente se midió con éxito y se representa en la Figura 3. Se sabe en general que, de esos 16 polímeros solamente succinoglicano y xantana contienen de forma natural piruvato. Con nuestro piruvato-ensayo tanto de estos polímeros fueron correctamente identificados. En escleroglucano, goma welan y piruvato xilano también se detectó en cantidades significativas. En general, la capacidad del enfoque fue validado y la piruvato-ensayo showed un alto rendimiento. Se demostró que es capaz de detectar piruvato en diferentes polímeros después de la hidrólisis. huella digital de hidratos de carbono: Después de realizar todos los módulos de análisis en la detección automatizada, se seleccionaron los productores potenciales de BPA para el análisis de carbohidratos de huellas digitales. Para esto, se aplicaron varios criterios: 1) la observación positiva de la viscosidad después de la centrifugación y / o después de la filtración. 2) Precipitación antes y después de la filtración. fibras observadas y las escamas se evaluaron como positiva. 3) El valor equivalente de la glucosa a partir del método de fenol-ácido sulfúrico. Valores&gt; 700 mg / L se calificaron como positivo y los valores entre 300 y 700 mg / L fueron calificados como productores EPS putativos. Cuando se evaluaron dos o tres criterios como positivos, se seleccionaron las cepas para análisis de huella digital de hidratos de carbono. Los criterios pueden ser personalizados hacia el objetivo individual de la proyección EPS (por ejemplo, EPS de baja viscosidad). Nuestro enfoque dirigido a la búsqueda de efficient EPS productores. Durante la búsqueda de cepas que sólo producen pequeñas cantidades de EPS del límite de evaluación de la glucosa equivalente debe ser reducida. beneficio técnico y aplicaciones futuras: Una característica interesante de este protocolo es el carácter modular de los pasos y los diferentes módulos analíticos. Se pueden combinar de diferentes maneras, ajustado a las necesidades individuales y nuevos módulos pueden implementarse fácilmente. Además, los módulos de análisis se pueden utilizar por separado, por ejemplo, el módulo de hidrólisis en combinación con el módulo de HT-PMP-derivatización es capaz de realizar un análisis de la composición monomérica de diferentes soluciones de polímero (1 g / l) en formato de 96 pocillos. Para los laboratorios sin tener acceso a un sistema de tratamiento de líquidos de la proyección completo pueda ser manipulado manualmente sin ningún cambio en el esquema de pipeteo. Sin embargo, usando un sistema de manejo de líquidos aumenta el rendimiento de hasta 768 cepas (en lugar de 192 cepas si Screened manualmente) por día. El protocolo que se describe aquí es capaz de una detección de diferentes géneros y, por lo tanto, para el cribado de grandes colecciones de cepas para identificar nuevos productores EPS y analizar su huella digital de hidratos de carbono en un enfoque (Figura 4). Por otra parte, una proyección dirigida para polisacáridos que contienen azúcares raras como fucosa, ácidos urónicos o incluso azúcares desconocidos se puede realizar a través del análisis de monosacárido detallada. Además, diferentes combinaciones de azúcar en proporciones definidas pueden ser detectados. Esto permite la sencilla identificación de variantes estructuralmente relacionados de EPS ya conocidos o nuevos EPS.

exopolisacáridos microbianos (EPS) son un grupo estructuralmente muy diversa de polímeros que cumplen diversas funciones biológicas. Por lo general se construyen de unidades repetitivas complejas, que se distinguen por diferentes tipos de monómeros (azúcar, derivados de azúcares, ácidos azúcar), los enlaces entre estos monómeros y sus sustituciones. La diversidad estructural de los polisacáridos microbianos confiere características muy diferentes a los miembros de esta clase molécula, lo que permite su aplicación en diferentes campos como la alimentación 1, 2,3 cosméticos, química construcción de 4 o 5 de tratamiento de agua. Para ampliar aún más el campo de aplicación de estos polímeros sostenibles de base biológica y tales la identificación de nuevos polisacáridos microbianos naturales, así como la ingeniería de variantes estructurales representa enfoques prometedores. De cualquier manera, se requiere un método de cribado rápido para explorar rápidamente un gran número de cepas microbianas para their formación de polisacárido, y analizar sus productos. Por lo tanto, hemos desarrollado recientemente una plataforma HT-cribado de 96 pocillos para el análisis de la producción de polisacáridos microbianos a partir de aislados naturales o variantes de cepas de ingeniería que incluye la identificación de la composición monomérica 6. La aplicación de esta plataforma para una primera ronda de cribado de ~ 500 aislados naturales nos permitió identificar sólo alrededor del 10 al 20% de las cepas aisladas como ser capaz de producir EPS (datos no mostrados). Esto significa que el 80-90% de las cepas analizadas no produjo EPS en las condiciones aplicadas, y por lo tanto, un nuevo análisis de la huella digital detallada de hidratos de carbono no era necesario. Como esta identificación altamente sofisticado de la composición monomérica es un proceso que consume tiempo, especialmente para el análisis de datos, un método de pre-selección rápido para identificar las cepas positivas en la producción de EPS, aumentaría drásticamente la eficiencia. Además, los reactivos,consumibles y tiempo de medición en el UHPLC-UV-ESI-MS se reducirían. Además, los diferentes módulos de análisis, mientras que por un lado hacer que el método altamente fiable, son por el contrario lo que complica la manipulación manual de más de dos placas de 96 pocillos en paralelo, y como tal restringir al máximo el potencial del método. Por estas razones, hemos decidido desarrollar una plataforma de exploración automático. Por lo tanto, se combinaron el formato modular de la técnica de la huella digital de hidratos de carbono existente con un método de detección rápido totalmente automatizada del contenido total de azúcar, basado en la medición de la absorbancia. El método de fenol-ácido sulfúrico representa todavía el método de elección para la determinación rápida del contenido total de hidratos de carbono de polisacáridos bacterianos de plantas y 7,8. Este método fue descrito por primera vez por Dubois et al. 9 y adaptado para diferentes aplicaciones y tamaños de muestra, incluso para pequeña escala en placas de 96 pocillos 10,11. el phemétodo nol-ácido sulfúrico-mide el contenido total de carbohidratos por un valor, summating todo monómeros, oligómeros y los carbohidratos poliméricos de las muestras. Teniendo en cuenta estos aspectos, la elección de un medio de cultivo adecuado es esencial para aplicar este método. medios complejos que contienen oligómeros o compuestos poliméricos de hidratos de carbono como el extracto de levadura pueden conducir a un contenido de polímero modificado y, por tanto, en sentido estricto debe ser evitado. Además, altas cantidades de azúcares se utilizan como fuente de C para el cultivo de las cepas. Los altos niveles de hidratos de carbono restantes del proceso de cultivo podrían interferir negativamente con la medición del contenido de EPS. Por lo tanto, se aconseja el uso de azúcares definidos y puros. En nuestros experimentos usamos la glucosa para el cultivo de las células. La glucosa restante después del cultivo se redujo a través de una filtración en gel y se determina a través de una glucosa-ensayo. Por último, el equivalente de glucosas de los polisacáridos se calcularon restando la glucosa restante después de la filtración en gel a partir del contenido total de carbohidratos que había sido detectado con el método de fenol-ácido sulfúrico. Filtración en gel y la glucosa-ensayo en combinación con el método de fenol-ácido sulfúrico-garantizan resultados fiables y son capaces de ser nuestra primera, sistema de detección completamente automatizada. Dos nuevos módulos de análisis se incluyeron en la plataforma de cribado automatizado para aumentar la cantidad de información desde el sistema de detección de EPS: la precipitación y la observación de un aumento de la viscosidad. Muchos EPS diferentes - por ejemplo, succinoglicano, xantano y colon ácido 12 - se informa que ser modificado con un cetal piruvato no de hidratos de carbono en las posiciones de azúcar C4 y C6. Esos cetales piruvato (justo como ésteres succinil medio y ácidos urónicos) contribuyen a la naturaleza polianiónica y, por tanto, a la prope físicarties del polímero mediante la interacción a través de puentes de cationes divalentes 13. Con el fin de identificar aquellos polímeros particular la determinación de piruvato se estableció como otro módulo de análisis adicional. Esto aumenta la información acerca de los sustituyentes de polisacáridos y sus propiedades macroscópicas potenciales. La combinación de todos los módulos permite la identificación de diferentes EPS, así como una determinación rápida y eficiente de los productores de EPS. Por que el enfoque de la plataforma de cribado podría dividirse en dos partes principales (Figura 1). Dentro de la proyección automatizada (parte I) se produce el flujo de trabajo totalmente automatizado (Tabla 1) para preseleccionar rápidamente las cepas productoras de EPS. El análisis de carbohidratos de huellas digitales (parte II) determina cuantitativamente la composición de monómero de la EPS producidos por las cepas preseleccionadas. De este modo, el análisis de datos se reduce al mínimo con el fin de optimizar la detección de grandes colecciones de cepas. Estaofrece la posibilidad de analizar 384 cepas en una sola corrida de detección automatizada y con dos carreras que son posibles por día de 768 cepas por día. Además, el análisis de carbohidratos huella digital ofrece una visión general más detallada de todas las EPS identificados. Esto permite el análisis dirigido y la identificación de sólo ligeramente diferentes variantes EPS o otros completamente nuevos en comparación con las estructuras químicas ya descritos de EPS.

<table><tbody><tr><td>Placa de pocillo profundo de 96 pocillos de 2,0 ml (DWP)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>780271</td><td>Main-culture (CP 1-1 a 1-4), placas de equilibrio para la filtración de gel (CP 1-6, 1-7, 2-6 y 2-7), dilución 1:100 para el ensayo de glucosa (CP 4-1 a 4-4) que contiene 990&nbsp; y micro; l de ddH2O</td></tr><tr><td>Película de sellado transpirable</td><td>Axygen</td><td>BF-400-S Película de</td><td>incubación para precultivo y main-culture DWP</td></tr><tr><td>Película de sellado de aluminio</td><td>Axygen</td><td>PCR-AS-200-80</td> <td>&deg; C Película de almacenamiento para placas de glicerol</td></tr><tr><td>MCA96 Nested Disposable Tips 200 &micro; l</td><td>TECAN</td><td>30038619</td><td>Posición de la mesa de trabajo (WTP 2-1 a 2-4)</td></tr><tr><td>A/B placa de filtro de vidrio 1&nbsp; y micro; m</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 8031</td><td>Almacenado en placa colectora (CP 2-1 a 2-4)</td></tr><tr><td>Placa de microtitulación de 96 pocillos V-Bottom</td><td>Greiner Bio-One</td><td>651201</td><td>Placa colectora para placa de filtración (CP 2-1 a 2-4)</td></tr><tr><td>SpinColumn G-25 de 96 pocillos</td><td>Harvard Apparatus</td><td>74-5612</td><td>Almacenado en lavado DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 y 2-7)</td></tr><tr><td>Placa de microtitulación de 96 pocillos V-Bottom</td><td>Nunc</td><td>249944</td><td>Placa colectora para placa de filtración de gel (CP 3-1 a 3-4)</td></tr><tr><td>Puntas desechables anidadas SBS 50 &micro; l puntas</td><td>TECAN</td><td>30038609</td><td>Posición del carrusel (CP 4-6, 4-7 y 5-1 a 5-6)</td></tr><tr><td>Comedero 250 ml</td><td>Axygen</td><td>Res-SW96-HP</td><td>Water WTP 1-1, Mezcla de reactivos para ensayo de glucosa WPT 1-2, tampón de acetato de amonio pH 5,6 (CP 5-7)</td></tr><tr><td>Placa de microtitulación de 96 pocillos F-Bottom (MTP)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>precipitación 1 (CP 6-1 a 6-4), valor de pH (CP 7-1 a 7-4), precipitación 2 (CP 8-1 a 8-4), método del ácido fenol-sulfúrico (CP 8-5 a 8-8), ensayo de glucosa (CP 9-1 a 9-9), placas ficticias (WTP 3-1, 3-2)</td></tr><tr><td>96 pocillos de tapa de silicona;</td><td>Whatmann</td><td>7704-0105</td><td>Alfombrilla de cubierta para MTP</td></tr><tr><td>200 y micro; l puntas de pipeta</td><td>Sarstedt</td><td>70.760.002</td><td>Para la manipulación manual</td></tr><tr><td>de 1.000 y micro; l puntas de pipeta</td><td>Sarstedt</td><td>70.762</td><td>Para la manipulación manual</td></tr><tr><td>de placas de microtitulación PCR de 96 pocillos&nbsp;</td><td>Marca</td><td>781350</td><td>Hidrólisis, derivatización PMP</td></tr><tr><td>TPE (elastómero termoplástico) tapa mat&nbsp;</td><td>Marca</td><td>781405</td><td>Hidrólisis, derivatización PMP</td></tr><tr><td>Placa de filtro 0.2&nbsp; y micro; m Supor</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 8019</td><td>Filtración de muestras para análisis UHPLC-ESI-MS con una placa colectora MTP</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta LHS 5-300&nbsp; y micro; l</td><td>Marca</td><td>732150</td><td>Marca LHS sistema</td></tr><tr><td>Glucosa oxidasa&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td>Ensayo de glucosa</td></tr><tr><td>Peroxidasa de rábano picante&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6782</td><td>Ensayo de glucosa, ensayo de piruvat</td></tr><tr><td>DA-64 (N-(Carboximetilaminocarbonilo)-4,4'-bis(dimetilamino)-difenilamina sal sódica)</td><td>Wako Chemicals GmbH</td><td>043-22351</td><td>Ensayo de piruvato</td></tr><tr><td>oxidasa&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4591</td><td>Ensayo de piruvato</td></tr><tr><td>Dibásico de fosfato de potasio</td><td>Carl-Roth</td><td>P749.3</td><td>Ensayo de piruvato y glucosa</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Carl-Roth</td><td>3904.3</td><td>Ensayo de piruvato y glucosa</td></tr><tr><td>Pirofosfato de tiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8754</td><td>Ensayo de piruvato</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31413</td><td>Ensayo de piruvato</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>VWR</td><td>20922.466</td><td>Precipitación</td></tr><tr><td>Fenol</td><td>VWR</td><td>20599.231</td><td>Método del ácido fenol-sulfúrico</td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico</td><td>Carl-Roth</td><td>4623.4</td><td>Método del ácido fenol-sulfúrico</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td>Hidrólisis</td></tr><tr><td>Solución de amonio</td><td>Carl-Roth</td><td>P093.1</td><td>Hidrólisis, derivatización de PMP</td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td>Hidrólisis, derivatización de PMP</td></tr><tr><td>Rojo de fenol&nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21710</td><td>Hidrólisis, derivatización de PMP</td></tr><tr><td>1-fenil-3-metil-5-pirazolona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M70800</td><td>Derivatización de PMP</td></tr><tr><td>Metanol LC-MS</td><td>VWR</td><td>83638.320</td><td>Derivatización de PMP</td></tr><tr><td>Acetonitril LC-MS</td><td>VWR</td><td>83040.320</td><td>Derivatización de PMP</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338826</td><td>derivatización de PMP</td></tr><tr><td>Etanol absolut</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td>PMP-derivatización</td></tr><tr><td>Rojo de metilo</td><td>Alfa Aesar</td><td>36667</td><td>valor de pH</td></tr><tr><td>Sistema robótico de manejo de líquidos&nbsp;</td>Configuración de la mesa de trabajo <td>Tecan</td><td>Freedom EVO</td><td>en Figura 2Estación de</td></tr> <tr><td>manipulación de líquidos LHS</td><td>Brand</td><td>709400</td><td>Configuración de la mesa de trabajo en Figure 2</strong</td></tr><tr><td>>Tip-Adapter</td><td>Brand 709434</td><td></td><td>configuración de la mesa de trabajo en Figura 2</td></tr><tr><td>Liquid Ends MC 20-300&nbsp; y micro; l</td><td>Marca</td><td>709416</td><td>Configuración de la mesa de trabajo en <fuerte>Figura 2</fuerte></td></tr><tr><td>Adaptador 60 mm</td><td>Marca</td><td>709430</td><td>Configuración de la mesa de trabajo en <fuerte>Figura 2</fuerte></td></tr></tbody></table>

plataforma modular de selección automatizados de alto rendimiento de exopolisacáridos junto con el análisis de carbohidratos de la huella digital de alta sensibilidad

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Muchos microorganismos son capaces de producir y secretar exopolisacáridos (EPS), que tienen importantes implicaciones en los campos médicos, aplicaciones de alimentos o en la sustitución de productos químicos basados ​​en petroquímicos. Se describe una plataforma de análisis para ser automatizado en un sistema de tratamiento de líquidos que permite el análisis rápido y fiable del tipo y la cantidad de EPS producidas por microorganismos. Se permite al usuario identificar nuevos productores de exopolisacáridos microbianas naturales y analizar la huella digital de hidratos de carbono de los polímeros correspondientes dentro de un día en de alto rendimiento (HT). El uso de esta plataforma, colecciones de cepas, así como bibliotecas de variantes de cepas que podrían ser obtenidos en los enfoques de ingeniería pueden ser examinados. La plataforma tiene una configuración modular, lo que permite una separación del protocolo en dos partes principales. En primer lugar, hay un sistema de detección automatizada, que combina diferentes módulos de detección de polisacárido: un análisis semi-cuantitativo de viscosity la formación a través de una etapa de centrifugación, un análisis de la formación de polímero a través de precipitación con alcohol y la determinación del contenido total de hidratos de carbono a través de una transformación de fenol-ácido sulfúrico. Aquí, es posible seleccionar hasta 384 cepas por corrida. La segunda parte ofrece un análisis monosacárido detallada para todos los productores de EPS seleccionados identificados en la primera parte mediante la combinación de dos módulos esenciales: el análisis de la composición de monómero completa mediante cromatografía líquida de ultra-alto rendimiento junto con la luz ultravioleta y la ionización por electrospray detección de trampa de iones ( UHPLC-UV-ESI-MS) y la determinación de piruvato como sustituyente polímero (presencia de cetal piruvato) a través de la oxidación enzimática que se acopla a una formación de color. Todos los módulos de análisis de esta plataforma de cribado se pueden combinar de diferentes maneras y se ajustan a las necesidades individuales. Además, todos ellos pueden ser manejados manualmente o realizarse con un sistema de manejo de líquidos. De esta manera, el pla de cribadoTForm permite una gran flexibilidad con el fin de identificar las diversas EPS.

Presentamos un método modular automatizado de alto rendimiento para la identificación y caracterización de exopolisacáridos microbianos a pequeña escala. Este método combina una preselección rápida para analizar la cantidad total de polisacáridos secretados con una huella digital detallada de carbohidratos para permitir el cribado rápido de cepas bacterianas recién aisladas o colecciones completas de cepas.

Plataforma modular de selección automatizados de alto rendimiento de exopolisacáridos Junto con el análisis de carbohidratos de la huella digital de alta sensibilidad

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

El objetivo general de este enfoque es la detección rápida y fiable de los productores de exopolisacáridos microbianos y la identificación de su huella digital de carbohidratos. Este es un paso esencial para utilizar la diversidad inexplorada de exopolisacáridos. Nuestro método puede ayudar a acelerar la investigación de polímeros en el campo de los exopolisacáridos microbianos.Permite la identificación rápida de nuevas variantes de polisacáridos con diferentes propiedades para aplicaciones específicas. La principal ventaja de esta técnica es la combinación de diferentes sistemas de detección de exopolisacáridos en un concepto de cribado modular y completamente automatizado. Esto lo hace extremadamente rápido y confiable.Esta técnica también se puede realizar de forma manual en laboratorios donde no se dispone de una plataforma de automatización, por lo que su uso es muy flexible y se puede ajustar a las diferentes necesidades de cribado. Esta plataforma de cribado de exopolisacáridos, o EPS, tiene una configuración modular, que permite una separación del protocolo en dos partes principales, el cribado automatizado y la huella digital de carbohidratos. La primera tarea es cultivar las cepas para el cribado y eliminar las células por centrifugación.Las cepas se cultivan en glucosa como fuente de carbono en placas de 96 pocillos cubiertas con una película de sellado transpirable en un agitador de placas de microtítulo a 30 grados Celsius y 1.000 RPM. El día de la pantalla, prepare la mesa de trabajo del robot y el carrusel de almacenamiento como se describe en el texto del protocolo. Retire la película de sellado transpirable de las placas y asigne los cultivos principales en las posiciones de carrusel 1-1 a 1-4.Inicie el programa robótico automatizado. Para eliminar las células después del cultivo, transfiera las placas de pocillos profundos de cultivo principales del carrusel a la centrífuga y centrifuga a 4, 300 x g y 20 grados Celsius durante 30 minutos. Para la precipitación antes de la filtración, mueva las placas de microtitulación, así como las placas de microtitulación indicadoras de pH, del carrusel a la mesa de trabajo.Transfiera también las placas de filtración, que aseguran la eliminación completa de todas las células bacterianas, junto con las placas colectoras a sus posiciones de mesa de trabajo. Después de la centrifugación, transfiera 180 microlitros del sobrenadante de cultivo principal a la placa de filtración. Aspire 150 microlitros del sobrenadante del cultivo principal y dispense 50 microlitros en la placa de microtitulación para la precipitación antes de la filtración, y 100 microlitros en la placa indicadora de pH.La precipitación del sobrenadante con 2-propanol se realiza para evaluar la producción de EPS. Utilice una pipeta de varios pasos de 12,5 mililitros para añadir manualmente 150 microlitros de 2-propanol a cada pocillo. Después de agitar las placas de microtitulación a temperatura ambiente durante 10 minutos a 900 RPM, observe visualmente las formaciones de fibras o escamas que indican la producción de EPS.Después de que las placas de cultivo principales se almacenen de nuevo en el carrusel, examine los caldos de fermentación, que deberían mostrar una sedimentación disminuida después de la centrifugación. El aumento de la viscosidad es otra indicación de la producción de EPS. La segunda tarea es asegurar la eliminación completa de las células del caldo de fermentación viscoso a través de una filtración de 96 pocillos.Centrifugar las placas de filtración a 3.000 x g y 20 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, vuelva a colocar las placas en su posición de inicio del carrusel y realice el equilibrio de la filtración de gel como se describe en el texto del protocolo. A continuación, pipetee 35 microlitros de filtrado en el centro de la placa de filtración de gel equilibrada y 50 microlitros en la placa de microtítulo que se utiliza para la precipitación.Mueva las placas de filtración de gel a la centrífuga y mueva todas las demás placas de la mesa de trabajo a las posiciones iniciales en el carrusel. Después de almacenar todas las placas en el carrusel, tome nota de los sobrenadantes altamente viscosos según lo indicado por los residuos en la placa del filtro. La falta de filtrado puede dar lugar a resultados falsos negativos en los siguientes módulos analíticos.La tercera tarea en el cribado automatizado es la eliminación de los azúcares monoméricos restantes del medio de crecimiento a través de una filtración en gel de 96 pocillos. Centrifugar las placas de filtración de gel a 1.000 x g y 20 grados centígrados durante dos minutos. Prepare la mesa de trabajo a través del manipulador robótico para procesar los filtrados de gel.Para detectar la glucosa restante después de la filtración en gel, utilizamos consejos de 50 microlitros para transferir 25 microlitros de agua doblemente destilada a una placa de microtítulo fresca. Aspire 20 microlitros de agua doblemente destilada, cinco microlitros de aire y 5 microlitros de gel-filtrado, y dispense en la misma placa. Tome puntas de 200 microlitros y aspire 50 microlitros de mezcla de reactivos de ensayo de glucosa desde la posición 1-2 de la mesa de trabajo para comenzar el primer ensayo.Mueva las placas de microtitulación a la incubadora. Después de 30 minutos de incubación, mueva las placas de la incubadora al lector de microtítulos y registre la absorbancia a 418 y 480 nanómetros. Para determinar el contenido total de carbohidratos por el método de ácido fenol-sulfúrico, pipetee 20 microlitros de filtrado de gel en las placas de microtítulo.Retire manualmente las placas del carrusel y colóquelas en la estación de manejo de líquidos. Incluye la placa de calibración con 20 microlitros de diferentes concentraciones de glucosa por triplicado. Coloque un contenedor de residuos en la posición 1, una caja de puntas de 300 microlitros en la posición 2 y un comedero de 250 mililitros con 110 mililitros de ácido fenol-sulfúrico recién preparado en la posición 3.Utilice una pipeta de 8 canales con puntas de 300 microlitros para transferir 180 microlitros de ácido fenol-sulfúrico a cada fila de todas las placas. Cubra todas las placas de micro titulación con tapas y mezcle agitando durante cinco minutos a 900 RPM a temperatura ambiente. Incubar durante 35 minutos a 80 grados centígrados en un horno para la reacción del color.Después de enfriar las placas bajo una campana extractora, mida la extinción a 480 nanómetros. Las cepas del cribado automatizado se designan como positivas para EPS si cumplen al menos dos de los tres criterios siguientes. Control de viscosidad, detección de polímero y cálculo de equivalente de glucosa.El equivalente de glucosa se calcula utilizando esta ecuación. La huella digital de carbohidratos de la plataforma de cribado contiene las tres últimas tareas que se realizan manualmente. El filtrado restante de los impactos positivos de la tarea dos proporciona la base para el filtrado de gel en la tarea cinco.La sexta tarea es la microhidrólisis de 96 pocillos del filtrado de gel. Para lograr esto, primero use una pipeta de 12 canales y 50 microlitros para transferir 20 microlitros de filtrado de gel a una nueva placa de PCR. A continuación, utilice una pipeta multipaso de 1,25 mililitros para añadir 20 microlitros de ácido trifluoroacético cuatro molares a cada pocillo.Cubra la placa de PCR con una alfombrilla de tapa de elastómero termoplástico y coloque la placa de PCR en un dispositivo de sujeción especial. Mezcle las soluciones invirtiendo el dispositivo de sujeción 10 veces. Después de centrifugar la placa de PCR y asegurarla en el dispositivo de sujeción, coloque el dispositivo de sujeción asegurado en un baño de arena precalentado e incube a 121 grados centígrados durante 90 minutos.Con una pipeta de 12 canales y 200 microlitros, añada una solución de amoníaco al 3,2 % para ajustar el pH a aproximadamente ocho. Cubra la placa de PCR con una alfombrilla de elastómero termoplástico y agítela manualmente con el dispositivo de sujeción. La tarea final es analizar la huella digital de carbohidratos a través del método de alto rendimiento de 1-fenil-3-metil-5-pirazolona, o HTPMP.Para comenzar este procedimiento, utilice una pipeta de 12 canales y 50 microlitros para transferir 25 microlitros del hidrolizado neutralizado a una placa de PCR nueva. Agregue 75 microlitros de reactivo de derivatización y cubra la placa con una estera de tapa de elastómero termoplástico. Coloque la placa de PCR en un ciclador de PCR a 70 grados centígrados durante 100 minutos, seguido de un enfriamiento a 20 grados centígrados.Transfiera una alícuota de 20 microlitros a una nueva placa de microtitulación, luego use una pipeta de 12 canales y 200 microlitros para agregar 130 microlitros de ácido acético de 19,23 milimolares a cada línea. Mezcle directamente a través de la aspiración y la dispensación al menos seis veces, y transfiera todo el líquido a una placa de filtro de 0,2 micrómetros con una placa colectora de microtítulo. Centrifugar la placa a 1.000 x g durante cinco minutos, retire la placa del filtro y selle la placa colectora de microtítulos con una alfombrilla de silicona.Coloque la placa de microtitulación en el UHPLC-UV-ESI-MS para la determinación de la huella dactilar de carbohidratos. En esta tabla se muestran los resultados de tres nuevas cepas ejemplares identificadas con éxito con esta plataforma de cribado. La parte izquierda de la tabla muestra los resultados de los módulos de cribado automatizados relativos a la formación de viscosidad, la producción de polímeros y el equivalente de glucosa de la hidrólisis total, que se utilizaron como parámetros de evaluación para el análisis detallado de las huellas dactilares de carbohidratos.La huella digital de carbohidratos basada en azúcares calibrados, así como en azúcares, dímeros y sustituyentes desconocidos, se da en la parte derecha de la tabla. Mediante el uso de esta información, se puede calcular la composición monomérica y compararla con estructuras poliméricas ya conocidas. Además, se puede realizar un cribado específico de composiciones monoméricas interesantes y carbohidratos raros.Una vez dominada, esta técnica se puede hacer para 386 cepas en solo cinco horas. Siguiendo este procedimiento, se pueden incluir ensayos adicionales como el piruvato ya existente o ensayos adicionales para acetatos o fosfato con el fin de responder a la pregunta adicional de la declaración de exopolisacáridos. Después de su desarrollo, esta técnica, por su alta sensibilidad, allanó el camino para nuestra investigación en el campo de los productores de exopolisacáridos microbianos mediante ingeniería genética para explorar el efecto de las vías biosintéticas de exopolisacáridos alteradas en la estructura química residente.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar nuevos productores de exopolisacáridos de una manera muy rápida y confiable.

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Investigación

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Biología

Una manera rápida se describe para obtener información sobre la estructura de los polisacáridos en una matriz extracelular. El método tiene la ventaja de la especificidad de glycosylhydrolases y la sensibilidad de la espectrometría de masas permite pequeñas cantidades de materiales para ser analizados. Esta técnica se puede adaptar para utilizarse directamente sobre el tejido en sí.

Oligo perfiles Misa (OLIMP) de polisacáridos extracelulares

Un método simple, rápido para determinar el potencial de la sacarificación de un gran número de muestras de biomasa vegetal se describe. La plataforma automatizada para este análisis consiste en la preparación de la biomasa vegetal para su análisis en placas de 96 pozos y la realización posterior de pretratamiento, hidrólisis y la cuantificación de los azúcares liberados.

De alto rendimiento de sacarificación de ensayo para materiales lignocelulósicos

Perfiles de Polímeros Glycan la pared celular vegetal utilizando microarrays

En este video, demostramos un ensayo de alto rendimiento para el cribado de enzimas activas en carbohidratos utilizando sustratos de hidrogel de polímeros cromogénicos insolubles. La enzima degrada estos sustratos en un producto coloreado soluble que se puede cuantificar midiendo la intensidad del color del producto.

Ensayo de cribado enzimático basado en hidrogel de polímero cromogénico: un método de alto rendimiento para cribar las enzimas activas en carbohidratos utilizando sustratos sintéticos

Se evalúan la estructura de la pared celular de la planta y los rasgos químicos para identificar las materias primas ideales para biocombustibles y biomateriales. Los métodos estándar tienen limitaciones cuando se aplican a grandes conjuntos de datos. Estos métodos de pretratamiento de alto rendimiento, sacarificación enzimática y espectrometría de masas de haz molecular de pirólisis comparan un gran número de muestras de biomasa con una disminución del tiempo y el costo experimental.

Selección de alto rendimiento de las Variaciones obstinación en lignocelulósica Biomasa: Total lignina, lignina Monómeros y enzimática Azúcar de lanzamiento

Se desarrolló un protocolo de alto rendimiento para la purificación combinada de proteómica y glicómica y la cuantificación de LC-MS/MS en plasma. El análisis de desamidación de los motivos de glicosilación ligados a N fue específico para los sitios desglicosilados. La cuantificación precisa de N-glicanos se logró acoplando la separación de N-glicanos asistida por filtro a la normalización de la individualidad al marcar con la estrategia de etiquetas de hidrazida de glicano.

Un Glicómica cuantitativa y Proteómica estrategia de purificación combinada

Se describe un ensayo de alto rendimiento para el cribado enzimático. Este kit de ensayo multiplexado y listo para usar se compone de sustratos Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) preseleccionados y sustratos C insolubles complejos C hromogenicB iomass (ICB). Las enzimas diana son endoenzimas degradadoras de polisacáridos y proteasas.

La selección de alto rendimiento de los hidratos de carbono-El uso de enzimas que degradan la novela insoluble cromogénico sustrato de ensayo Kits

Describimos aquí el alto rendimiento detección y cuantificación de fucosylated oligosacáridos de leche humana (HMO) utilizando un biosensor de célula entera. También demostramos aquí, la adaptación de esta plataforma hacia análisis de cepas de producción de HMO, centrándose en mejorar la relación señal a ruido.

Análisis de los trisacáridos de leche Fucosylated humanos en contexto biotecnológico mediante genéticamente codifican en biosensores

El perfil de polímeros de microarrays (MAPP) es una técnica de alto rendimiento para el análisis de la composición de glicanos en muestras biológicas.

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Anteriormente se desarrolló un sistema para el análisis automatizado y rápido de glicanos en proteínas. Este artículo presenta el protocolo para el "análisis glicocualitativo", optimizado para un amplio espectro de usuarios, como los que se dedican al análisis de estructuras de glicanos en biofarmacéuticos y otros materiales glicoconjugados.

Evaluación glicocualitativa rápida de proteínas recombinantes mediante un sistema totalmente automatizado

Este protocolo presenta un flujo de trabajo estándar de cribado de alto rendimiento para microorganismos industriales. Consiste en construir una biblioteca mutante mediante mutagénesis ARTP, realizar cribado positivo de gotas con microfluidica automatizada y, posteriormente, verificar los resultados. La fiabilidad del flujo de trabajo se validó mediante el cribado de cepas de B. coagulans de alto rendimiento.

Cribado de alto rendimiento de mutantes de Bacillus coagulans hiperproductores de ácido L-láctico utilizando una plataforma microfluídica automatizada de gotas

Aprenda a realizar un cribado automatizado de alto rendimiento para productores de exopolisacáridos microbianos y la identificación de huellas dactilares de carbohidratos. Este método modular acelera la investigación de polímeros.

Plataforma modular de selección automatizados de alto rendimiento de exopolisacáridos Junto con el análisis de carbohidratos de la huella digital de alta sensibilidad (Video) | JoVE Journal

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