Generación de modelos de celulares de cáncer de próstata de la resistencia a lo agente anti-mitotic Docetaxel

El objetivo general de este procedimiento es generar modelos experimentales de células cancerosas resistentes a docetaxel como plataforma para estudiar los mecanismos moleculares que impulsan la resistencia a la terapia antimitótica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología de las células cancerosas y el genoma, como la identificación de las vías de señalización que contribuyen a la progresión de la enfermedad y la determinación de posibles estrategias dirigibles. La principal ventaja de esta técnica es que es una forma fiable y sencilla de generar modelos experimentales para estudiar las respuestas a los fármacos anticancerígenos, además de utilizar muestras tumorales de pacientes y modelos animales.

Lisa Mohr, una investigadora postdoctoral de mi laboratorio, y Jungreem Woo, otro postdoc de nuestro equipo, demostrarán el procedimiento. Para comenzar este procedimiento, coloque las pilas DU145 o 22Rv1 en los matraces de 150 centímetros cuadrados que contienen 20 mililitros de medio. Después de 24 horas, cuando las células están en un 70 a 80% de confluencia, agregue Docetaxel a cinco nanomolares.

Después de 72 horas, aspire el medio que contiene el medicamento y agregue medios nuevos sin Docetaxel. Cambie los medios cada tres o cuatro días. Espere una o dos semanas hasta que aparezcan los clones en el matraz.

Aspirar el medio, lavar cuidadosamente las células con 15 mililitros de PBS e incubarlas con cuatro mililitros de tripsina-EDTA al 0,05% durante tres a cinco minutos a 37 grados centígrados para separar las células de la superficie del matraz. A continuación, vuelva a suspender las células tripsinizadas del matraz utilizando ocho mililitros de medio fresco. Extraiga las células de todos los matraces tratados y granuléelos por centrifugación.

A continuación, retire el superna-den, vuelva a suspender el pellet de la celda en 20 mililitros de medio fresco y coloque las células en matraces de 150 centímetros cuadrados. Después de 24 horas, cuando las células están en aproximadamente 70 a 80% de confluencia, agregue cinco nanomolares de Docetaxel nuevamente. Repita los procedimientos como se muestra anteriormente hasta que los clones aparezcan en el matraz.

A continuación, vuelva a colocar las células en matraces de 150 centímetros cuadrados. Después de 24 horas, cuando las células estén en un 70 a 80% de confluencia, trátelas con Docetaxel 10 nanomolares. Repita los mismos pasos en la forma de aumentar la dosis de Docetaxel y siga agrupando los clones supervivientes después de cada tratamiento de concentración.

Al final del proceso, obtendrá un grupo de células resistentes listas para su uso experimental. En este procedimiento, coloque una placa de 2.000 células utilizando 2 mililitros de medio por pocillo en las seis placas de pocillos. Después de 24 horas, agregue concentraciones crecientes de Docetaxel para las líneas celulares DU145 y 22Rv1.

Agregue DMSO solo a un pocillo como control al mismo volumen que se usa para la dosis más alta de Docetaxel. Después de 72 horas, aspire el medio que contiene el medicamento y agregue medios nuevos sin Docetaxel. Incubar las placas durante una o dos semanas hasta que las colonias sean visibles bajo el microscopio.

Para manchar las colonias, lávelas suavemente con dos o tres mililitros de PBS. Incubarlos con dos o tres mililitros de solución de violeta cristalina durante 20 minutos dentro de la campana de cultivo de tejidos o una campana de gases. Después, retira la solución estancada y lava los platos con dos o tres mililitros de agua.

Luego retire el agua y seque las placas al aire. Tome imágenes digitales de las placas para la representación de figuras. Analice el resultado visualizando los pozos y contando manualmente las colonias con la ayuda de un rotulador.

Y representar el porcentaje de viabilidad de la célula en un gráfico. A continuación se muestra un diagrama que muestra la determinación del docetaxel IC50 en las líneas celulares parentales de cáncer de próstata DU145 y 22Rv1. Aquí se muestran los porcentajes esperados de viabilidad celular en las concentraciones crecientes de dosis de Docetaxel necesarias.

Y aquí están las imágenes representativas de microscopía de campo claro de las células DU145 y 22Rv1 en los momentos indicados durante la generación de resistencia a Docetaxel. Las flechas rojas indican un clon resistente a Docetaxel después de completar el protocolo. Aquí se muestran los ensayos representativos de formación de colonias correspondientes a la validación funcional de las células resistentes a Docetaxel.

Las células se expusieron a concentraciones crecientes de Docetaxel y la supervivencia se evaluó mediante tinción con violeta cristalino. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo generar y validar líneas celulares resistentes a los medicamentos, que luego se pueden usar para exámenes y procedimientos de su elección, como análisis de expresión génica y manipulaciones genéticas. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.