Cuantificación de microorganismos a bajas concentraciones usando microscopia holográfica Digital (DHM)

El objetivo general de este experimento es demostrar la detección de microorganismos a niveles muy bajos utilizando microscopía holográfica digital. Esta técnica es más sensible que la microscopía óptica tradicional y proporciona información en tiempo real sobre el comportamiento de las bacterias. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos biológico y cosmológico, como la búsqueda de organismos patógenos en el agua o la vida dentro de nuestro sistema solar en lunas heladas.

La principal ventaja de esta técnica es que el DHM es una técnica volumétrica, lo que significa que podemos capturar información tridimensional de nuestra muestra de forma instantánea sin necesidad de reenfocar físicamente. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de infecciones del torrente sanguíneo o del líquido cefalorraquídeo debido a la capacidad de detectar bajas concentraciones bacterianas. Para comenzar este procedimiento, el día del experimento, se toma una lectura espectrofotométrica del cultivo maestro bacteriano que se espera que esté en el rango de 0,6 a 0,7.

A continuación, tome una muestra del cultivo maestro y cuente las células directamente utilizando una cámara de recuento de Petroff-Hausser para enumerar tanto las células vivas como las muertas. Transfiera una muestra de 10 microlitros del cultivo sin diluir con una micropipeta a la cámara. Visualícelo bajo un microscopio de objetivo altamente seco usando contraste de fase.

Posteriormente, cuente las bacterias en al menos 20 cuadrados y promedie. Calcule la concentración como el promedio de 20 cuadrados por el factor de dilución. Para enumerar solo células vivas, realice una dilución en serie de cada una de las muestras bacterianas seleccionadas con solución salina estéril al 0,9% transfiriendo 20 microlitros de la solución bacteriana a otro pocillo y diluyéndola con 180 microlitros de solución salina.

Repita el procedimiento hasta que la concentración más baja sea de aproximadamente 10 a las tres celdas por mililitro. A continuación, tome 100 microlitros de las muestras de al menos dos diluciones y colóquelas en las placas de medios sólidos adecuadas. Extiéndalos con un esparcidor estéril y realice al menos tres repeticiones de cada dilución.

Después de eso, incubarlos a una temperatura adecuada durante la noche o hasta que crezcan las colonias. Luego cuenta las colonias. Calcule las unidades formadoras de colonias y promedie las réplicas.

En este procedimiento, realice diluciones en serie del cultivo maestro para DHM y recuento post-DHM de UFC en placas de medios de caldo de lisoggenia. Diluya las bacterias en 25 mililitros de un medio mínimo que fomente la motilidad pero inhiba la división celular para que la concentración de células no cambie apreciablemente durante el experimento. Para grabar videos DHM, usando una jeringa estéril, extraiga aproximadamente 10 mililitros de la dilución de interés.

A continuación, conecte la jeringa a la cámara de muestras de DHM utilizando accesorios y tubos estériles. Haga fluir la muestra desde la jeringa a través de la cámara de muestras de forma continua utilizando una bomba de jeringa. A medida que la muestra fluye a través de la cámara de muestra, adquiera hologramas consecutivamente a una velocidad de fotogramas adecuada.

Deje tiempo suficiente para que los 10 mililitros completos de muestra fluyan a través del DHM. Para asegurarse de que las bacterias no crezcan ni mueran durante los experimentos, inocule las placas de medios enriquecidos con 100 microlitros de los medios gastados después de la captura de imágenes DHM extendiéndolas con un esparcidor estéril. Luego incubarlas a la temperatura adecuada durante 24 horas antes de contar las colonias.

Disponer de recuentos celulares precisos es esencial para determinar cuantitativamente los límites de detección. Es importante realizar todas las diluciones con mucho cuidado utilizando micropipetas calibradas y confirmar todos los recuentos mediante densidad óptica, recubrimiento y recuento directo en la cámara Petroff-Hausser. Para analizar los datos de presencia bacteriana en los vídeos de hologramas adquiridos, realice un filtrado de medio sustraído convirtiendo primero las imágenes a un formato de 32 bits.

A continuación, calcule el valor medio de píxeles. Por último, reste este valor mediano de cada píxel respectivo para eliminar los artefactos estacionarios en el holograma. Después de eso, cuente manualmente el número de anillos de área visible y celdas enfocadas.

Cada serie de hologramas irá acompañada de un archivo de marca de tiempo. Utilice el archivo de marca de tiempo para calcular la cantidad total de muestra bombeada en el momento en que se capturó la imagen. Posteriormente, calcule la densidad de células dividiendo el número total de células detectadas por el volumen total de la muestra de la que se han obtenido imágenes.

Promedio de cinco a 10 fotogramas para estadísticas precisas. Este gráfico muestra las celdas predichas por campo de visión en función de un volumen de muestra de 365 micrómetros por 365 micrómetros por un milímetro. Para concentraciones en las que el número de células por campo de visión es inferior a uno, se requieren varias imágenes para lograr la detección.

Se trata de una secuencia de hologramas DHM de un cultivo de Serratia marcescens a 2.100 células por mililitro medido por el recuento de placas. La secuencia muestra una celda aproximadamente cada uno o dos segundos, lo que es un excelente ajuste para la predicción. Y esta es otra secuencia de hologramas DHM de un cultivo de Serratia marcescens a 620 células por mililitro medido por el recuento de placas.

Esta secuencia muestra una celda aproximadamente cada seis o siete segundos. Cuando utilice la microscopía holográfica digital para obtener imágenes de las células, recuerde utilizar técnicas de esterilización con filtros en la preparación de todas las soluciones. Esto evitará la introducción de material particulado en el instrumento.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar preparar cultivos celulares sanos y tener a mano medio de crecimiento, placas y medio de motilidad adicionales. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la tinción fluorescente, para responder a preguntas adicionales, como el porcentaje de células vivas frente a las muertas. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la microbiología exploraran la motilidad tridimensional en células cultivadas y muestras ambientales.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo enumerar bacterias usando microscopía holográfica y validar los resultados usando otras técnicas de conteo. No olvide que trabajar con cultivos bacterianos puede ser extremadamente peligroso. Siempre se deben tomar las precauciones de bioseguridad adecuadas al cultivar y manipular organismos vivos.