Microscopía Episcopal de Alta Resolución (HREM) - Protocolos simples y robustos para procesar y visualizar materiales orgánicos

El objetivo general de este procedimiento es generar datos digitales de volumen de materiales orgánicos. Algunos ejemplos son los embriones y los tejidos embrionarios de organismos modelo biomédico, los bloques de tejido extraídos de animales adultos y humanos, incluidas las biopsias de piel o músculo y materiales como el papel sin recubrimiento y los sustitutos de la piel. HREM ayuda a responder preguntas fundamentales en los campos de la medicina y la investigación biomédica.

Permite el análisis tridimensional y la visualización de órganos y tejidos de, por ejemplo, embriones de ratón modificados genéticamente o embriones de pollo manipulados. También permite el análisis de modelos de cáncer, así como biopsias tomadas de tejidos humanos o animales. La principal ventaja de HREM es que proporciona una forma sencilla de generar pilas de imágenes de calidad casi histológica.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la investigación de la cicatrización de heridas mediante el uso de modelos animales, así como la hilatura y reparación de patologías tisulares en humanos. Los responsables de la demostración del procedimiento correrán a cargo de la BMR Marlene Rodler y Johannes Gunther. Ambos de la Universidad Médica de Viena, División de Anatomía.

Comience con embriones fijos o tejido embrionario de no más de 5 x 5 x 5 mililitros cúbicos. Retire el fijador. Y agregue PBS.

Lavar a cuatro grados centígrados con balanceo constante durante 24 horas. Agregue etanol al 70% a los tubos que contienen el tejido y coloque las muestras en un rotador a cuatro grados centígrados. Después de dos o tres horas, continúe deshidratando las muestras en soluciones de etanol de concentración creciente durante dos o tres horas cada vez.

Mientras las muestras se deshidratan, prepare la solución de infiltración añadiendo 0,3125 gramos de peróxido de benzoilo y 0,1 gramos de ESN a 25 mililitros de solución A en un vaso de precipitados. Agite en una placa de agitación magnética a cuatro grados centígrados durante dos o tres horas hasta que el ESN y el catalizador se disuelvan por completo. Coloque las muestras en una solución de infiltración.

Y meca o rote las muestras durante 12 a 24 horas a cuatro grados centígrados. Comience por preparar la solución de incrustación. Agregue un mililitro o solución B a 25 mililitros de solución de infiltración fresca.

Después de preparar las bandejas de vasos de moldeo, llene la cavidad profunda de los moldes con solución de incrustación. Transfiera las muestras a los moldes con una cuchara. Asegúrese de que la muestra esté completamente cubierta con solución de inclusión para evitar que el aire quede atrapado.

Oriente la muestra dentro del molde con agujas o pinzas. Es fundamental optimizar la orientación de la muestra durante la inclusión y marcar su posición precisa en la superficie del bloque. De esta manera, la región de interés se puede mantener pequeña y se puede utilizar el objetivo con el mayor aumento posible.

Tan pronto como la solución de inclusión comience a volverse viscosa, coloque un soporte de bloques en la parte superior del molde y agregue solución de inclusión a través del orificio central del soporte de bloques hasta que la solución de inclusión se eleve a uno o dos milímetros por encima de la base del soporte de bloques. Selle la bandeja de la taza de moldeo cubriéndola con cera de parafina líquida y espere hasta que se endurezca antes de moverla. Deje que los bloques terminen de polimerizarse almacenando las bandejas de tazas de moldeo selladas durante uno o dos días a temperatura ambiente.

Para el procesamiento posterior a la polimerización, coloque las bandejas de tazas de moldeo con los bloques polimerizados en un horno de laboratorio estándar y hornee a 70 a 80 grados centígrados durante un mínimo de uno o dos días. Retira los bloques de los moldes. A continuación, identifique el campo de visión dirigiendo la luz blanca de forma oblicua a la superficie del bloque.

Traza la sombra de la muestra con el marcador negro en la superficie del bloque. Monte el bloque de resina con el campo de visión indicado en el micrótomo y mueva el soporte del bloque a su posición de parada. Inicie la cámara digital y el software de generación de datos y adquiera una imagen en vivo.

Elija un objetivo con la ampliación adecuada para cubrir la región de interés. Mueva la óptica hacia arriba y hacia abajo y el micrótomo lateralmente hasta que la región de interés coincida con el campo de visión que se muestra en la pantalla de la computadora. Seccione el bloque hasta que las primeras estructuras de la muestra se hagan visibles.

Mueva el micrótomo para organizar la superficie del bloque en el plano focal de la óptica. Elija un grosor de sección entre 0,5 y cinco micras. Luego, después de configurar el software según las instrucciones del fabricante, inicie el software y comience la captura de datos.

Esta imagen de sección HREM muestra una sección sagital a través de un embrión de ratón recolectado en el día embrionario 9.5. Este modelo 3D renderizado por volumen muestra la superficie de este embrión. Esta imagen muestra una sección sagital virtual a través de un modelo renderizado por volumen del cuello del embrión de ratón recolectado en el día embrionario 15.5.

El modelo de superficie resalta la lumina del sistema cardiovascular en una representación volumétrica de todos los tejidos de un embrión de pollo, una hamburguesa de Hamilton en desarrollo Etapa 18. Esta imagen muestra una sección HREM a través de un nervio humano. La incrustación amplía la sección de esta imagen.

Esta imagen muestra parte de una imagen de sección HREM a través del hígado porcino. Esta imagen muestra un modelo 3D renderizado por volumen de una biopsia tomada de una almohadilla de pulgar humano. Esta imagen muestra los modelos renderizados de la superficie de las arterias dérmicas, las venas y los nervios frente a una resección virtual a través de los datos de HREM.

Esta animación muestra un modelo renderizado por volumen de la piel gruesa de una almohadilla de pulgar humana. Diferentes umbrales y, por lo tanto, diferentes estructuras dérmicas, como los vasos sanguíneos, las fibras nerviosas, las glándulas sudoríparas y los conductos de las glándulas sudoríparas. HREM permite una visualización rápida de la arquitectura del material fibroso.

Esta imagen muestra un modelo renderizado por volumen de material sustituto dérmico nativo. Esta animación muestra el modelo renderizado por volumen del material sustituto dérmico. Fíjate en la diferente forma y el calibre de las fibras.

Las muestras deben deshidratarse, infiltrarse e incrustarse en resina, por lo que todo el procedimiento puede durar varios días, pero solo incluye dos o tres horas de trabajo operativo para preparar soluciones, cambiar soluciones, etc. La generación de datos en sí está totalmente automatizada en el aparato HREM y se pueden producir 1000 imágenes en dos o tres horas. Después de su desarrollo, HREM allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del desarrollo calificaran con precisión el fenotipo de los embriones de ratón mutantes.

Un ejemplo es el proyecto de desciframiento de mecanismos de trastornos del desarrollo o DMDD donde se utiliza HREM fenotipando, embriones de ratón embrionariamente letales en un detalle aún desconocido. Resultó que la HREM también es una excelente alternativa a la microscopía óptica posicional para examinar la arquitectura de los vasos sanguíneos, los nervios o las fibras en muestras de tejido humano.