Microscopía óptica cuantitativa: Medición de Biofísica Celular Características con un microscopio óptico estándar

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar las características físicas básicas de las muestras celulares, incluyendo la masa y el volumen, con un microscopio óptico estándar y procesamiento de imágenes. Esto se logra montando primero especímenes celulares cultivados en cubreobjetos de vidrio en portaobjetos de microscopio. A continuación, se obtienen imágenes de contraste de campo claro e interferencia diferencial y de enfoque.

A continuación, cada pila Z de imágenes se introduce en programas de procesamiento de imágenes de MATLAB independientes que extraen los datos físicos. En última instancia, las propiedades físicas básicas de las muestras celulares se obtienen mediante mediciones de intensidad de foco, bajo contraste de campo claro y microscopía de contraste de interferencia diferencial. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la microscopía de fluorescencia, es que las muestras celulares no necesitan ser fijadas, permeadas o teñidas.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular, como por ejemplo, cómo se organiza la densidad subcelular durante el ciclo celular o entre las diferentes poblaciones celulares que contribuyen a un estado de enfermedad. A continuación, abra la ventana de enfoque y, en la sección del conjunto de filtros, seleccione DIC En la pestaña de alcance, en la sección del condensador, ajuste la barra deslizante de apertura a la posición más a la derecha. Esto proporciona una iluminación de alta apertura numérica y mejora el corte óptico de la muestra.

Después de capturar una pila DIC de la muestra, abra la ventana de enfoque y seleccione abrir. En la sección del conjunto de filtros, ajuste la barra deslizante de apertura a la posición más a la izquierda cerrada por completo para proporcionar una iluminación de NA baja. Después de ajustar la intensidad de la señal, abra la ventana de captura de imágenes.

La configuración de captura 3D de la adquisición de la pila DICZ se mostrará en la sección del conjunto de filtros de la ventana de captura de imágenes. Marque la casilla abierta y especifique el tiempo de exposición. En la sección de información de la imagen, asigne un nombre a la imagen y seleccione iniciar para iniciar la adquisición de imágenes de Zack.

A continuación, exporte las pilas Z de acuerdo con el protocolo de texto para realizar mediciones de volumen una vez en el programa H-T-D-I-C MATLAB titulado JoVE HT DCO V one M En la sección cero, actualice la variable de directorio de dependencias copiando y pegando el directorio que contiene el hilbert. Transforme los archivos DM y sobel edge Detect M desde el explorador. Entre las comillas simples que siguen el directorio de dependencias es igual a ejecutar la sección cero del programa joco HT DCO V one M.

En la sección uno, actualice el directorio de imágenes copiando y pegando el directorio que contiene las imágenes de enfoque directo en forma de punto TIF. Entre las comillas simples, ejecute esta sección solo una vez para alinear y rotar las imágenes. Para la sección dos de ejecución de transformación de Hilbert del código, aparecerá un cuadro de diálogo titulado Definir parámetros HT DIC.

A continuación, introduzca el número de plano focal en el que se enfoca la imagen DIC de la muestra, la resolución lateral, la resolución axial, el ángulo de rotación de la imagen DIC necesario para realizar la transformada de Hilbert y, por último, el tamaño de la región de interés. A continuación, haga clic en Aceptar. Aparecerá una imagen del plano focal DIC especificado por el número de plano focal con un cuadro azul.

Coloque el cuadro sobre la entidad de interés, como una celda. Una vez que el cuadro se haya colocado sobre la región deseada, haga doble clic dentro de la B. El contraste de la imagen debe ser tal que las características oscuras aparezcan a la izquierda mientras que las características brillantes aparecen a la derecha. Arrastre el cuadro azul sobre la región de interés y cambie la forma según sea necesario.

A continuación, en la sección tres, para generar una máscara rectangular, una línea de comentario 1 6 7 y la línea de comentario 1 7 0 ejecuten la sección tres del programa haciendo clic en la imagen y arrastrando el ratón para comenzar a definir la máscara rectangular. A continuación, haga doble clic en la casilla para aceptarlo. Para generar una máscara dibujada a mano, comente la línea 1 6 7 y un comentario línea 1 7 0 antes de ejecutar la sección tres Al hacer clic y dibujar la máscara deseada con el ratón, haga doble clic en la máscara para aceptarla después de ejecutar la sección cuatro, para construir pilas de imágenes transformadas de Hilbert de acuerdo con el protocolo de texto ejecuta la sección cinco.

Para optimizar la segmentación de imágenes de la sección transversal xz de la región de interés. La figura 500 producida por el programa aparece mostrando tres tipos diferentes de contraste. El éxito del algoritmo para encontrar los bordes de la celda depende de una combinación de la máscara utilizada y el valor del umbral en la línea 2, 2, 9 del programa comience con un valor de 0.5 y ajuste el valor del umbral y vuelva a ejecutar esta sección del programa hasta que se logre el delineado adecuado en una de las columnas.

Si el esquema fue mejor en la columna uno, en la segmentación DIC, use la sección seis para determinar el volumen. Si la columna dos dio resultados óptimos, ejecute la sección siete para determinar el volumen de celda de Hilbert, transforme las imágenes DIC SI la columna tres dio los resultados óptimos, use imágenes DIC de transformación de Hilbert filtradas por Forer mientras ejecuta la sección ocho para determinar el volumen para tomar mediciones de masa en el programa NIQ PM MATLAB y tituladas JO VCO NI qpm V1 M Bajo la sección cero. Actualice la ubicación de las tres dependencias de directorios, el directorio BRIGHTFIELD y DIC después de ejecutar la sección uno, ejecute la sección dos en el cuadro de diálogo titulado Definir parámetros N-I-Q-P-M, ingrese el número de plano focal donde está enfocada la imagen de campo claro de la muestra, la resolución lateral, la resolución axial y el tamaño de la región de interés.

A continuación, haga clic en Aceptar. Aparecerá una imagen del plano focal de campo claro especificado por el número de plano focal con un cuadro azul. Después de ajustar el enfoque si es necesario volviendo a ejecutar la sección dos, arrastre el cuadro alrededor de la imagen y seleccione los nodos del cuadro y arrástrelo para cambiar su tamaño antes de hacer doble clic dentro del cuadro para aceptarlo.

Una vez que se haya construido una pila de imágenes de campo claro ejecutando la sección tres, ejecute la sección cuatro para generar el mapa de fase, las imágenes pseudo DIC y las comparaciones con las imágenes de campo claro y la imagen DIC verdadera cuando las imágenes pseudo DIC y DIC verdaderas sean lo más similares posible, ejecute la sección cinco A o cinco B que permite al usuario delinear la celda para generar el mapa de densidad de masa, La masa total y el histograma de la densidad celular son correctos. La iluminación de la muestra durante la adquisición de imágenes a través del enfoque es fundamental para la implementación exitosa del algoritmo N-I-Q-P-M y H-T-D-I-C. Esta figura ilustra la iluminación de NA baja y alta bajo contraste DIC y de campo claro para una esfera de poliestireno y la línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano SW six 20.

Estos paneles muestran imágenes óptimas para N-I-Q-P-M y estos muestran imágenes óptimas para HT DIC. Estas imágenes demuestran la dependencia de los parámetros del algoritmo NIQ PM, destacando tanto las implementaciones correctas como las incorrectas. Aquí exploramos el perfil de fase de una esfera de poliestireno de 4,8 micrómetros de diámetro.

El perfil esperado se conoce teóricamente y, por lo tanto, se puede comparar directamente con la reconstrucción de NIQ PM. Estos paneles presentan la mejor reconstrucción que se puede obtener para los efectos de difracción de la esfera, tanto en los límites de la esfera como en el interior, lo que impide una reconstrucción estable en todos los puntos de la esfera. La región central de la esfera se puede capturar con N-I-Q-P-M con un error porcentual de uno a 5%, como se ve en los especímenes celulares del Panel L cuyas propiedades de fase no se conocen.

A priori se puede reconstruir usando NIQ PMM junto con un procedimiento para comparar una imagen pseudo DIC con una imagen DIC real. N-I-Q-P-M tiene un parámetro libre. El plano de la pila de imágenes de campo derecho en el que se centra el cálculo.

Este plano focal central debe ajustarse hasta que las imágenes pseudo DIC y DIC verdaderas se vean lo más similares posible. Aquí se presenta una imagen pseudo DIC desenfocada, una imagen pseudo DIC óptima y la imagen DIC correspondiente de la célula tomada con una iluminación NA de 0,9. Curiosamente, el mejor mapa de fase y la imagen pseudo DIC correspondiente no corresponden necesariamente a una imagen de campo claro enfocada como se muestra en estos paneles.

Por último, aquí se muestran los pasos involucrados en el algoritmo de procesamiento de imágenes H-T-D-I-C desde el DIC a través de imágenes de enfoque bajo NA igual a 0.9 de iluminación, la transformada de Hilbert se realiza para eliminar el relieve base de las imágenes DIC. Esto viene con algo de desenfoque a lo largo del eje óptico que se puede eliminar del filtrado de paso alto. Estas imágenes finales se segmentan fácilmente para determinar el área en cada plano de la sección transversal de la muestra para inferir el volumen celular total.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar la iluminación correcta para las imágenes de contraste diferencial de mineral de campo claro después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la microscopía de fluorescencia, para responder a preguntas adicionales utilizando la colocalización de la fuerza del suelo con mapas de densidad de la muestra.