Microscopía óptica cuantitativa: Medición de Biofísica Celular Características con un microscopio óptico estándar

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar características físicas básicas de muestras celulares, incluyendo masa y volumen, mediante un microscopio óptico estándar y procesamiento de imágenes. Esto se logra primero montando muestras celulares cultivadas sobre cubreobjetos de vidrio en portaobjetos para microscopio. A continuación, se obtienen imágenes de campo brillante y de contraste de interferencia diferencial mediante enfoque progresivo.

Luego, cada pila Z de imágenes se introduce en programas separados de procesamiento de imágenes en MATLAB que extraen los datos físicos. En última instancia, se obtienen las propiedades físicas básicas de las muestras celulares mediante mediciones de intensidad a través del enfoque, utilizando contraste de campo claro y microscopía de contraste de interferencia diferencial. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la microscopía de fluorescencia es que las muestras celulares no necesitan ser fijadas, permeabilizadas ni teñidas.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular, como cómo se organiza la densidad subcelular durante el ciclo celular o entre diferentes poblaciones celulares que contribuyen a un estado de enfermedad. Utilizando un microscopio con capacidades de contraste de interferencia diferencial (DIC) y campo claro, además de especificaciones adicionales según el protocolo descrito en el texto, comience por abrir el software de libro de portaobjetos y crear un nuevo portaobjetos para la recopilación de imágenes. A continuación, abra la ventana de enfoque y, en la sección de conjunto de filtros, seleccione DIC. En la pestaña del microscopio, bajo la sección del condensador, ajuste la barra deslizante de la abertura a la posición más hacia la derecha. Esto proporciona una iluminación con alta apertura numérica y mejora el corte óptico del espécimen.

Después de capturar una serie DIC de la muestra, abra la ventana de enfoque y seleccione abrir. En la sección de conjunto de filtros, ajuste la barra deslizante de apertura a la posición más a la izquierda, cerrada completamente, para proporcionar iluminación con baja apertura numérica (NA). Después del ajuste de la intensidad de la señal, abra la ventana de captura de imagen.

Los ajustes de captura 3D de la adquisición de la pila DICZ se mostrarán en la sección de conjunto de filtros de la ventana de captura de imagen. Marque la casilla de apertura y especifique el tiempo de exposición. En la sección de información de la imagen, asigne un nombre a la imagen y seleccione iniciar para comenzar la adquisición de la imagen Zack.

Luego exporte las pilas Z según el protocolo de texto para realizar mediciones de volumen una vez en el programa MATLAB H-T-D-I-C titulado JoVE HT DCO V one M. En la sección cero, actualice la variable del directorio de dependencias copiando y pegando el directorio que contiene los archivos hilbert. Transform DM y sobel edge Detect M desde el explorador. Entre las comillas simples después de dependencies directory equals, ejecute la sección cero del programa joco HT DCO V one M.

En la sección uno, actualice el directorio de imágenes copiando y pegando el directorio que contiene las imágenes de enfoque múltiple en formato .TIF. Entre comillas simples, ejecute esta sección solo una vez para alinear y rotar las imágenes. Para la transformada de Hilbert, ejecute la sección dos del código. Aparecerá un cuadro de diálogo titulado Definir parámetros de DIC de HT.

Luego ingrese el número de plano focal donde la imagen DIC de la muestra está enfocada, la resolución lateral, la resolución axial, el ángulo de rotación de la imagen DIC necesario para realizar la transformada de Hilbert y, finalmente, el tamaño de la región de interés. A continuación, haga clic en Aceptar. Aparecerá una imagen del plano focal DIC especificado por el número de plano focal con un cuadro azul.

Coloque la caja sobre la característica de interés, como una célula. Una vez que la caja haya sido posicionada sobre la región deseada, haga doble clic dentro de la B. El contraste de la imagen debe ser tal que las características oscuras aparezcan a la izquierda mientras que las características brillantes aparezcan a la derecha. Arrastre la caja azul sobre la región de interés y redimensione según sea necesario.

A continuación, en la sección tres, para generar una máscara rectangular, descomente la línea 1 6 7 y comente la línea 1 7 0; ejecute la sección tres del programa haciendo clic sobre la imagen y arrastrando el ratón para comenzar a definir la máscara rectangular. Luego, haga doble clic sobre el cuadro para aceptarlo. Para generar una máscara dibujada a mano, comente la línea 1 6 7 y descomente la línea 1 7 0 antes de ejecutar la sección tres. Haciendo clic y dibujando la máscara deseada con el ratón, haga doble clic sobre la máscara para aceptarla. Tras ejecutar la sección cuatro, para construir pilas de imágenes transformadas mediante Hilbert según el protocolo descrito en el texto, ejecute la sección cinco.

Para optimizar la segmentación de imágenes de las imágenes transversales xz de la región de interés. La figura 500 generada por el programa aparece mostrando tres tipos diferentes de contraste. El éxito del algoritmo para encontrar los bordes de la célula depende de una combinación de la máscara utilizada y el valor del umbral en la línea 2, 2, 9 del programa; comience con un valor de 0,5 y ajuste el valor del umbral y vuelva a ejecutar esta sección del programa hasta que se logre un contorno adecuado en una de las columnas.

Si el contorneado fue mejor en la columna uno, en la segmentación DIC, utilice la sección seis para determinar el volumen. Si la columna dos dio resultados óptimos, ejecute la sección siete para determinar el volumen celular a partir de la transformada de Hilbert de imágenes DIC. Si la columna tres dio los resultados óptimos, utilice la imagen DIC de la transformada de Hilbert con filtro forer mientras ejecuta la sección ocho para determinar el volumen con fines de medición de masa en el programa NIQ PM MATLAB titulado JO VCO NI qpm V1 M bajo la sección cero. Actualice la ubicación de los tres directorios de dependencias, BRIGHTFIELD y el directorio DIC; después de ejecutar la sección uno, ejecute la sección dos en el cuadro de diálogo titulado definir parámetros N-I-Q-P-M e ingrese el número de plano focal donde la imagen de campo claro de la muestra está enfocada, la resolución lateral, la resolución axial y el tamaño de la región de interés.

Luego, haga clic en Aceptar. Aparecerá una imagen del plano focal de campo brillante especificado por el número de plano focal con un cuadro azul. Después de ajustar el enfoque si es necesario volviendo a ejecutar la sección dos, arrastre el cuadro alrededor de la imagen y seleccione los nodos del cuadro y arrástrelos para cambiar su tamaño antes de hacer doble clic dentro del cuadro para aceptarlo.

Una vez que se haya construido una pila de imágenes de campo brillante ejecutando la sección tres, ejecute la sección cuatro para generar el mapa de fase, las imágenes pseudo DIC y las comparaciones con las imágenes de campo brillante y la imagen DIC real. Cuando las imágenes pseudo DIC y DIC real sean tan similares como sea posible, ejecute la sección cinco A o cinco B, que permite al usuario delinear la célula para generar el mapa de densidad de masa, la masa total y el histograma de la densidad celular correcto. La iluminación de la muestra durante la adquisición de imágenes a través del enfoque es fundamental para la implementación exitosa del algoritmo N-I-Q-P-M y H-T-D-I-C. Esta figura ilustra la iluminación con baja y alta NA bajo contraste DIC y de campo brillante para una esfera de poliestireno y la línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano SW seis 20.

Estos paneles muestran la imagen óptima para N-I-Q-P-M y estos muestran la imagen óptima para HT DIC. Estas imágenes demuestran la dependencia de los parámetros del algoritmo NIQ PM, destacando implementaciones exitosas y no exitosas. Aquí exploramos el perfil de fase de una esfera de poliestireno con un diámetro de 4,8 micrómetros.

El perfil esperado es conocido teóricamente y por tanto puede compararse directamente con la reconstrucción PM de NIQ. Estos paneles muestran la mejor reconstrucción obtenible para los efectos de difracción de la esfera; sin embargo, en ambos bordes de la esfera y en su interior, los efectos de difracción impiden una reconstrucción estable en todos los puntos de la esfera. La región central de la esfera puede capturarse mediante N-I-Q-P-M con un error porcentual del uno al 5 %, como se observa en el panel L, en especímenes celulares cuyas propiedades de fase no se conocen.

Una imagen a priori puede reconstruirse utilizando el PMM de NIQ en conjunto con un procedimiento para comparar una imagen DIC pseudo con una imagen DIC real. N-I-Q-P-M tiene un parámetro libre: el plano en el conjunto de imágenes del campo derecho en el que se centra el cálculo.

Este plano focal central debe ajustarse hasta que las imágenes de DIC pseudo y DIC verdadero se vean lo más similares posible. Aquí se presentan una imagen de DIC pseudo desenfocada, una imagen de DIC pseudo óptima y la imagen de DIC correspondiente de la célula tomada con una apertura numérica de iluminación de 0,9. Curiosamente, el mejor mapa de fase y la imagen de DIC pseudo correspondiente no necesariamente coinciden con una imagen de campo brillante enfocada, como se muestra en estos paneles.

Por último, aquí se muestran los pasos implicados en el algoritmo de procesamiento de imágenes H-T-D-I-C a partir de las imágenes de contraste de interferencia diferencial (DIC) bajo iluminación con una apertura numérica (NA) igual a 0,9; se realiza la transformada de Hilbert para eliminar el relieve base de las imágenes DIC. Este proceso conlleva cierto desenfoque a lo largo del eje óptico, que puede eliminarse mediante un filtrado paso alto. Estas imágenes finales se segmentan fácilmente para determinar el área en cada plano transversal del espécimen y así inferir el volumen celular total.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar la iluminación correcta para la imagenología de campo brillante o contraste diferencial tras seguir este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la microscopía de fluorescencia, para responder preguntas adicionales mediante la colocalización de la fuerza del piso con mapas de densidad del espécimen.