Modelado de la infección del Virus Zika del desarrollo cerebro humano In Vitro usando células madre derivado Cerebral organitas

El objetivo general de este procedimiento es modelar la infección por el virus del Zika en el cerebro humano en desarrollo utilizando organoides cerebrales derivados de células madre. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología, como qué células son capaces de infectarse y qué proteínas están involucradas en la vía de infección. Las principales ventajas de esta técnica son que imita la infección humana temprana, se puede utilizar en ensayos de alto rendimiento y se puede combinar con técnicas genéticas focalizadas como CRISPR.

Este método puede proporcionar información sobre el mecanismo de la infección por el virus del Zika. También se puede aplicar a otros sistemas, como las pantallas de detección de drogas y la pseudotipificación de virus. Utilizando métodos regulares de mantenimiento de células madre, lleve los cultivos a una confluencia de entre el 50% y el 70%.

Inspeccione los cultivos utilizando microscopía de campo claro con un aumento de 10 a 20x y asegúrese de que la colonia tenga una morfología saludable sin diferenciación detectable. Lleve el medio de mantenimiento de células madre libres de xeno a 37 grados centígrados en un baño de agua caliente y descongele dos mililitros de reactivo de desprendimiento enzimático y un vial de 50 microlitros del inhibidor de roca madre a temperatura ambiente. A continuación, prepare una placa de 96 pocillos con fondo en U de fijación ultrabaja, una pipeta p200 multicanal y un depósito de reactivos de 25 mililitros.

A continuación, alícuota 45 mililitros del medio en un tubo cónico de 50 mililitros. Agregue 45 microlitros del inhibidor de roca y mezcle bien el inhibidor triterizando la mezcla, seguido de dos a cuatro en versiones. Aspire al vacío dos pocillos de una placa de seis pocillos que contenga células madre y agregue rápidamente un mililitro de reactivo de desprendimiento libre de enzimas a cada pocillo, luego, incube la placa a 37 grados centígrados durante cuatro minutos.

A continuación, aspire al vacío los pocillos tratados y agregue un mililitro de reactivo de desprendimiento enzimático a cada pocillo. Después de una incubación de cinco minutos a 37 grados centígrados, retire la placa de la incubadora. Golpee suavemente la placa para romper las células agregadas.

A continuación, inspeccione las células bajo el microscopio. Si aún se ven grandes grupos de células, incube la placa durante dos minutos adicionales a 37 grados centígrados. Repita el paso hasta que los grupos ya no sean visibles a simple vista.

Una vez que las células estén correctamente disociadas, agregue un mililitro de medio de mantenimiento de células madre libres de xeno a cada pocillo, para desactivar las enzimas de disociación. Coloque la suspensión de células en un tubo cónico de 50 mililitros y tome una pequeña alícuota para el recuento de células. Durante la centrifugación, cuente las celdas y determine el volumen de resuspensión necesario para lograr 60, 000 celdas por mililitro de suspensión.

Retire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender las células a 60.000 células por mililitro en medios que contengan el inhibidor de roca. Con una pipeta de cinco mililitros, mezcle las células suavemente de cinco a 10 veces para asegurar una suspensión celular uniforme. Agregue inmediatamente la suspensión celular en el depósito de reactivo y use una pipeta p200 multicanal para transferir 150 microlitros a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de conexión ultra baja.

A continuación, centrifuga la placa a 150 x G durante un minuto y luego coloca la placa en una incubadora a 37 grados centígrados. No altere la placa durante 48 horas. A partir del segundo día, prepare 17 mililitros de medio que contengan 17 microlitros del inhibidor de roca original en un tubo cónico de 50 mililitros.

Calienta la mezcla a 37 grados centígrados en un baño de agua caliente. Tome la placa organoide de la incubadora y, con una pipeta p200 multicanal, extraiga lentamente 75 microlitros de medio de los bordes de los pocillos de la primera fila. Luego, expúlsalo rápidamente de vuelta al pozo para eliminar las células sueltas y los organoides.

Repita este proceso de dispersión para cada fila. Espere 15 segundos para asegurarse de que los organoides se han hundido hasta el fondo de cada pocillo y, a continuación, aspire lenta y cuidadosamente 75 microlitros de medio de cada pocillo con la pipeta p200 multicanal y dispense en un depósito de residuos. A continuación, transfiera el medio que contiene el inhibidor de roca a un depósito de reactivo, dispense 150 microlitros de medio en cada pocillo de organoide y luego incube las células a 37 grados centígrados.

Calentar 17 mililitros de medio de cultivo fresco a 37 grados centígrados, esta vez sin ningún inhibidor de rocas. Utilizando una pipeta p200 multicanal ajustada a 100 microlitros, repita el proceso de dispersión mostrado anteriormente y espere 15 segundos para asegurarse de que los organoides se han hundido hasta el fondo de sus pocillos. Luego, aspire cuidadosamente 125 microlitros de medio de cada pocillo y reemplácelos con 150 microlitros de medio calentado.

Coloque la placa en la incubadora a 37 grados centígrados. Prepare el medio de acuerdo con la receta que se muestra aquí y luego filtre estérilmente la solución mezclada en un filtro de 500 mililitros. Desde el cuarto día hasta que las células se infectan aproximadamente el día 24, realice un mantenimiento regular cada dos días utilizando un medio de inducción neuronal.

Una vez filtrado, caliente 17 mililitros del medio de inducción neural a 37 grados centígrados y almacene el resto a cuatro grados centígrados. Utilizando una pipeta p200 multicanal, ajustada a 100 microlitros, disperse todos los pocillos de la placa organoide que se ha mostrado anteriormente. Espere 15 segundos para asegurarse de que los organoides se hayan hundido hasta el fondo de sus pozos.

Aspire cuidadosamente 125 microlitros de medio de cada pocillo y reemplácelo con 125 microlitros de medio de inducción neural fresco. Repita esta hazaña de inducción neral cada dos días hasta que los organoides estén listos para la infección por el virus del Zika. Lleve la solución salina equilibrada 1x, 1x PBS y el medio de inducción neuronal de earle a 37 grados centígrados en un baño de agua caliente.

A continuación, diluya el virus del Zika de una concentración conocida en 1 solución de Earle para la multiplicidad objetivo de infección, que suele estar entre 0,1 y 10. Con una pipeta p200, retire con cuidado todo el medio de cada pocillo de organoide. Luego, lave rápidamente los organoides con 200 microlitros de PBS 1x calentado.

Al retirar el medio de cada pocillo, es fundamental que no se toque el organoide ni se aspire en la pipeta. Esto puede causar daños irreparables al organoide. Si esto sucede, lo mejor es desechar el organoide.

A continuación, retire con cuidado todo el líquido restante de cada pocillo de organoide con una pipeta p200 de un solo canal. Luego, agregue rápidamente 50 microlitros de 1x solución de Earle para una infección simulada o solución para el virus del Zika a cada pocillo. Asegúrese de que cada organoide esté completamente sumergido cuando termine, vuelva a colocar la placa en una incubadora a 37 grados centígrados durante dos horas.

Una vez completada la exposición viral, lave cada pocillo de los organoides con 200 microlitros de PBS. Deje que los organoides se asienten durante 15 segundos y luego retire el PBS con una pipeta p200 de un solo canal. Finalmente, agregue 200 microlitros de medio de inducción neural fresco a cada pocillo y vuelva a colocar la placa en la incubadora.

La tinción con DAPI, fosfovimentina, TBR2 y MAP2 se puede combinar para mostrar las estructuras corticales que se forman dentro de los organoides. Estas estructuras incluyen la zona ventricular, la zona subventricular, la zona intermedia y la placa cortical dentro de cada roseta. El cultivo de los organoides hasta el día 108, permite observar las últimas etapas del desarrollo.

Si bien las capas corticales no son tan prominentes en este tipo de organoide, el cambio natural a la gliogénesis ocurre de manera muy similar a lo hace in vivo. Tres días después de la infección por el virus del Zika, se hace visible una diferencia en el tamaño de los organoides. La magnitud de esta diferencia depende de la multiplicidad viral de infección que se aplique a los organoides.

Esta diferencia en el tamaño del organoide aumentará durante la semana siguiente hasta que los organoides infectados comiencen a romperse. Después de tres días, también habrá un aumento en los desechos celulares en los pozos infectados en comparación con los pozos simulados. Al intentar este procedimiento, es importante seguir prácticas de laboratorio seguras, ya que se utilizan materiales infecciosos viables.

Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la inmunohistoquímica o el ARN, para responder preguntas adicionales sobre la biología involucrada en la infección por el virus del Zika, en el desarrollo neural.