Un método para la determinación y simulación de permeabilidad y difusión en un modelo de tejido 3D en una membrana Introduzca el sistema de placas de varios pocillos

El objetivo general de este protocolo es determinar los coeficientes de permeabilidad y difusión de modelos de piel en 3D en un pequeño sistema de inserción de membrana. Estos asuntos pueden ayudar a responder preguntas clave sobre la ingeniería de tejidos de piel en 3D para aplicaciones farmacéuticas y cosméticas en las que la permeabilidad y el coeficiente de difusión son factores de calidad esenciales. La principal ventaja de esta técnica es que permite la medición directa de estos coeficientes dentro de un pequeño inserto multipocillo.

El pequeño sistema de inserto de membrana en la simulación se puede modificar aún más para su uso en órganos en los dispositivos de barco y otras aplicaciones que utilizan sistemas de inserto de membrana. Para preparar un gel de agarosa, comience aplicando 28,6 microlitros de gel de agarosa líquido recién preparado a 80 grados Celsius en cada membrana de un sistema de inserción de membrana de 96 pocillos. Después de 10 minutos, el gel se habrá solidificado y se puede utilizar para un ensayo de permeabilidad.

Para preparar un modelo de células de colágeno, primero mezcle 125 microlitros de HBSS y un mililitro de solución de colágeno R en hielo, seguido de neutralización con hidróxido de sodio. A continuación, añada a la mezcla 125 microlitros de fibroblastos primarios suspendidos en medio completo. Y agregue 28,6 microlitros de la solución celular resultante a cada pocillo de un nuevo sistema de inserción de membrana de 96 pocillos.

Después de 30 minutos en una incubadora de cultivo celular, agregue 75 microlitros de medio completo a la superficie del gel y 300 microlitros de medio completo al fondo de cada pocillo para una incubación nocturna en la incubadora de cultivo celular. Al día siguiente, reemplace el medio con 75 microlitros de queratinocitos adultos humanos de baja temperatura y bajo en calcio a cada modelo de célula de colágeno y devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular durante otros tres días. Al cuarto día, aspire el medio de la superficie del modelo de célula y devuelva la placa a la incubadora durante otros siete días.

Para realizar un ensayo de permeabilidad, dispense 75 microlitros de sustancia donante en un sistema modelo de inserto de pocillo pequeño de interés y agregue 300 microlitros de sustancia aceptora en el fondo de cada pocillo. Coloque la placa en un agitador a 37 grados Celsius, 95 por ciento de humedad y aproximadamente 480 RPM durante cinco horas, transfiriendo el sistema de inserción de membrana una vez por hora a una placa vacía de 96 pocillos y midiendo la fluorescencia difusa dentro de los pocillos inferiores de la placa experimental en un lector de placas. Al final del experimento de permeabilidad, abra el software de modelado adecuado e inicie un nuevo modelo.

Seleccione Asistente de modelo y Modelo 3D. Agregue Transporte de Especies Diluidas y haga clic en estudiar. A continuación, seleccione Dependiente del tiempo y haga clic en Listo.

En Definiciones globales, haga clic con el botón derecho para agregar parámetros e introducir los parámetros geométricos y físicos en la cuadrícula. Configure la geometría del sistema de inserción de membrana de los experimentos y haga clic con el botón derecho en Definiciones para agregar dos sondas de dominio, seleccionando una sonda como dominio aceptor y la otra como dominio donante. Establezca ambos dominios en un promedio con una expresión C y una unidad de moles por metro al cubo.

Y establecer el coeficiente de difusión bajo las propiedades de transporte uno y el transporte de especies diluidas. Haga clic con el botón derecho en transporte de especies diluidas para agregar una segunda propiedad de transporte dos y seleccione la segunda barrera en la selección de dominio. En el transporte de especies diluidas, para los valores iniciales uno, defina la concentración como cero.

Haga clic con el botón derecho en transporte de especies diluidas para agregar un segundo valor inicial dos y seleccione el donante como tercer dominio. Establezca la concentración como la concentración inicial de la sustancia donante fluorescente. Haga clic con el botón derecho del ratón en transporte de especies diluidas para añadir simetría uno y seleccionar todas las superficies de la selección de límites que reflejen toda la geometría.

Haga clic con el botón derecho en malla para agregar dos tetraedros libres y establecer la segunda barrera como dominio. Haga clic con el botón derecho del ratón en el tetraédrico libre para añadir el tamaño de la malla predefinida a extrafina. En el segundo tetraedro libre, establezca el aceptor y el donante como dominios y la malla predefinida como más fina.

A continuación, en el estudio uno, haga clic en calcular para iniciar la simulación. Para ajustar el coeficiente de difusión a los datos generados por la simulación de difusión, abra el menú agregar psíquico y seleccione matemáticas. Optimización y sensibilidad de localización.

Seleccione optimización y haga clic en agregar al componente. A continuación, haga clic con el botón derecho del ratón en las definiciones para añadir variables e introduzca manualmente las variables de la tabla tres. A continuación, en el menú de acoplamiento de componentes, haga clic con el botón derecho en definiciones, agregue el promedio uno seguido de la adición manual del aceptador como nombre de operador y seleccione el dominio uno.

Exporte los datos experimentales a un nuevo documento de texto. Utilice un punto y coma para separar los datos en columnas y un salto de línea para separar los datos en filas. Haga clic con el botón derecho en optimización para agregar el objetivo de mínimos cuadrados globales y adjuntar el documento de texto a los datos experimentales.

Haga clic en el objetivo de mínimos cuadrados globales para definir la primera columna como columna de tiempo uno y la segunda columna como columna de valor uno. En la columna de expresión de valor, ingrese la variable C.Haga clic con el botón derecho en optimización para agregar una variable de control global. Y declare la búsqueda de subrayado D como una variable con un valor inicial de uno, un límite inferior de cero y un límite superior de 1.000.

Haga clic con el botón derecho en el estudio uno para agregar optimización. Y seleccione SNOPT como método de resolución de optimización. Establezca la tolerancia de optimalidad en uno elevado a menos ocho.

A continuación, establezca el coeficiente de difusión en la barrera en D.Establezca el tiempo de simulación en estudio de cero segundos a 22.000 segundos con un intervalo de 100 segundos y haga clic en calcular para comenzar la optimización de parámetros. El análisis histológico de un modelo de células de colágeno revela una ligera tinción de los fibroblastos dentro de la matriz central. En la parte superior de la matriz de colágeno, se puede observar una capa que contiene muchos núcleos que probablemente consisten en queratinocitos adultos humanos de baja calidad en calcio y alta temperatura.

El uso de sal sódica de fluoresceína e isotiocianato de fluoresceína dextrano verifica el impacto del tamaño molecular de la sustancia difusora y revela que para tamaños moleculares pequeños, la simulación y los datos experimentales concuerdan bien para ambas moléculas. Sin embargo, los tamaños moleculares más grandes generan mayores desviaciones en las progresiones de las curvas en las simulaciones, lo que demuestra un retraso en el comienzo y un aumento más fuerte en el curso posterior de los gráficos. De hecho, el coeficiente de permeación disminuye a medida que aumenta el tamaño molecular y los coeficientes simulados se comportan de manera similar a los coeficientes de permeabilidad experimentales.

Cabe destacar que la mayoría de los modelos que utilizan queratinocitos adultos humanos bajos en calcio y alta temperatura tienen coeficientes de permeación y difusión más bajos en comparación con los modelos sin queratinocitos adultos humanos bajos en calcio y alta temperatura. El modelo sim de colágeno se puede establecer en 11 a 12 días y la medición de permeabilidad se puede completar en seis horas si se realiza correctamente. Al realizar el procedimiento, es importante mantener constantes las condiciones límite como la temperatura, el volumen de llenado, la concentración de la sustancia aplicada, la humedad y el proceso de membrana para reducir la variación del coeficiente de permeación.

Con la ayuda de este módulo de simulación, se puede reducir el esfuerzo experimental y predecir el rendimiento a largo plazo. También se puede adaptar a otros dispositivos de permeación o sistemas de propiedad de órganos. Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de las aplicaciones farmacéuticas y cosméticas, así como en el desarrollo de la ingeniería de tejidos, exploren los procesos de permeación por difusión en tejidos artificiales.