Implementación de un Sistema de infección basada en la inserción de membrana permeable para estudiar los efectos de toxinas secretadas bacterianas en células huésped de mamífero

El objetivo general de este sistema de infección basado en insertos de membrana permeable es estudiar los efectos de las toxinas bacterianas secretadas en las células huésped durante la infección. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las interacciones huésped-patógeno, como la forma en que los componentes bacterianos específicos secretados contribuyen a las respuestas de las células huésped durante la infección bacteriana. La principal ventaja de esta técnica es que permite el estudio de los componentes bacterianos secretados y modela más de cerca un entorno huésped-patógeno fisiológicamente relevante en el contexto de la infección humana.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Rebecca Flaherty, una estudiante graduada de último año de mi laboratorio. Para preparar estreptococos isogénicos del grupo A de tipo salvaje, o GAS, y cepas mutantes de GAS M1T1 5448, comience los cultivos líquidos durante la noche inoculando de cinco a 10 mililitros de caldo Todd Hewitt e incubando a 37 grados centígrados durante 16 horas. Centrifugar los cultivos bacterianos durante la noche y utilizar el volumen original de medio bacteriano fresco para volver a suspender el pellet.

A continuación, normalice los cultivos bacterianos a concentraciones iniciales iguales diluyendo los cultivos resuspendidos en un medio adicional para llegar a la misma OD600. Para recolectar lisados para llevar a cabo análisis de señalización y ensayos de determinación de ATP, se coloquen células de HaCaT en placas de seis pocillos a una densidad de asiento de aproximadamente tres veces 10 por la quinta celda por pocillo, y se cultive hasta una confluencia del 90%. Para realizar ensayos de permeabilización de membrana de homodímero de etidio y liberación de lactato deshidrogenasa, coloque células de HaCaT en placas de 24 pocillos a una densidad de asiento de aproximadamente cinco veces 10 a la cuarta celda por pocillo, y crezca hasta una confluencia del 90%.

Inmediatamente antes del tratamiento, use 1x PBS para lavar las células. A continuación, aplique dos mililitros de medio de crecimiento fresco con o sin tratamiento farmacológico a las placas de seis pocillos, o 0,5 mililitros de medio a los pocillos de las placas de 24 pocillos. A continuación, debajo de una campana de flujo laminar, use pinzas estériles para colocar cuidadosamente un inserto de membrana permeable estéril de 0,4 micras en cada pocillo.

La manipulación suave y estéril de los insertos permeables durante la preparación de la infección es fundamental para evitar que la membrana se vea comprometida o se contamine durante este proceso. Aplique el medio de cultivo celular fresco a la cámara superior de cada pocillo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, aplique un volumen adecuado de los cultivos bacterianos normalizados a la cámara superior del sistema de inserto de membrana permeable y aplique el medio bacteriano a los pocillos de control.

La adición cuidadosa de las bacterias a la cámara superior, así como el transporte suave de las células infectadas a la incubadora, son críticos, porque es esencial que las bacterias no contaminen la cámara inferior durante la configuración experimental. Para evaluar la presencia de proteínas secretadas en el huésped, utilice pinzas estériles para extraer con cuidado el inserto permeable de la membrana. Luego, sin perturbar la monocapa de células, recoja el medio de la cámara inferior en tubos de 1,5 mililitros.

Centrifugar las muestras a 14.000 RCF y cuatro grados Celsius durante 10 minutos para granular los restos celulares. Luego, retire todos menos 50 microlitros del sobrenadante, transfiéralo a un tubo nuevo de 1,5 mililitros y guárdelo a menos 20 grados Celsius, o úselo inmediatamente. Para la evaluación de los lisados de células huésped, aspire suavemente el medio por encima de la monocapa sin alterar las células huésped.

Luego, use PBS para enjuagar las celdas una vez. Aspire suavemente el PBS e inmediatamente aplique un volumen de tampón de lisis helado para lograr, por ejemplo, una concentración de proteínas de 0,5 a 1,5 miligramos por mililitro. A continuación, incuba las muestras en hielo durante 15 minutos.

A continuación, utilice un raspador de células para separar las células de la superficie de la placa de cada pocillo y transfiera todo el contenido de cada pocillo a un tubo de 1,5 mililitros. A continuación, centrifugar las muestras a 14.000 RCF y cuatro grados Celsius durante 20 minutos. Para evaluar los componentes solubles del lystato, transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y guárdelo a menos 20 grados Celsius, o úselo inmediatamente.

Para evaluar los componentes nucleares u otros componentes de lisado insolubles, reserve el pellet y guárdelo a menos 20 grados centígrados, o utilícelo inmediatamente. Para la evaluación mediante imágenes de inmunofluorescencia, aspire el medio y use 1x PBS frío para lavar las células. Luego, con 4% de PFA y PBS, fije las celdas durante la noche.

Realice análisis adicionales de acuerdo con el protocolo de texto. Los datos de Western blot que se muestran aquí demuestran una activación significativamente mayor de la quinasa p38 MAP y los queratinocitos en presencia de estreptolisina S o cepas de gas productoras de SLS, lo que indica que este sistema puede usarse para evaluar los cambios en la activación de las proteínas de señalización del huésped independientes del contacto. En esta figura, se muestra la activación dependiente de SLS del factor nuclear mediador inflamatorio clave-kappa B, que se transloca del citoplasma al núcleo tras la activación, lo que indica que este sistema se puede utilizar para visualizar los efectos de los factores bacterianos secretados en las respuestas de las proteínas del huésped utilizando enfoques de microscopía de inmunofluorescencia.

Aquí, se demuestran aumentos significativos tanto en la permeabilización de la membrana como en la liberación de LDH de las células huésped después de la exposición a cepas de gas productoras de SLS, en comparación con las células no infectadas o las células expuestas a una cepa deficiente en SLS. Estos resultados indican que este sistema puede evaluar los cambios dependientes de la toxina en la citotoxicidad del huésped. En este experimento se determinaron los niveles de ATP en los queratinocitos y la respuesta a la infección por gases.

16 horas después de la infección, se observó una reducción significativa de ATP, y la pérdida de ATP fue más pronunciada en presencia de SLS, lo que es consistente con los aumentos dependientes de la toxina en la señalización y toxicidad de la respuesta al estrés del huésped. Una vez establecida, esta técnica se puede utilizar para estudiar las respuestas específicas de cualquier factor microbiano secretado en una variedad de tipos de células huésped. Al ejecutar este procedimiento, es importante practicar la técnica estéril a lo largo de los pasos de configuración experimental y mantener un manejo cuidadoso de los insertos de membrana permeable, tanto durante la configuración inicial como durante la recolección de muestras.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar métodos como el western blot, las imágenes de inmunofluorescencia y los ensayos de permeabilización de membrana, con el fin de determinar cómo el factor bacteriano de interés contribuye a los cambios en las cascadas de señalización e influye en la citotoxicidad general durante la infección. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar muestras de células huésped para la evaluación de una variedad de respuestas de células huésped después de la exposición a un factor bacteriano específico secretado de interés. No olvide que la manipulación de materiales biopeligrosos, como patógenos bacterianos, requiere ciertas consideraciones de seguridad.

El uso adecuado de gafas de seguridad, guantes y batas de laboratorio, junto con el uso adecuado de una capucha de bioseguridad, es necesario para realizar estos experimentos de manera segura.