Tridimensional de la célula modelo de cultivo para medir los efectos del flujo del fluido intersticial en la invasión de células tumorales

El objetivo de este procedimiento es exponer células cultivadas en 3D a un flujo de fluido intersticial y cuantificar los efectos mediados por el flujo sobre la invasión celular. Esto se logra primero preparando una solución de gel compuesta por colágeno tipo I y matrigel. El segundo paso consiste en añadir una concentración determinada de células a la solución de gel.

A continuación, se agrega la suspensión celular a un transbien de 12 milímetros de diámetro y 8 micrómetros de tamaño de poro, y se incuba a 37 grados Celsius hasta que la matriz forme un gel. El paso final en la preparación del ensayo consiste en agregar cantidades específicas de medio a los transbien para crear condiciones estáticas y de flujo. Veinticuatro horas después, las membranas de los transbien se fijan, tiñen y visualizan para la cuantificación del número de células invadidas.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como las cámaras de flujo intersticial microfluídicas, es que no requiere bombas ni equipos especializados, y permite a los investigadores probar múltiples condiciones o tratamientos de forma fácil y rápida. Aunque este método puede proporcionar información sobre la migración e invasión celulares, también puede utilizarse o aplicarse para estudiar el efecto del flujo de líquido intersticial sobre otros comportamientos celulares relevantes, como la expresión de proteínas, la proliferación celular y las alteraciones en la señalización celular. Quien demostrará este procedimiento será un LIMA two chaa.

Un estudiante de posgrado en mi laboratorio comience este procedimiento colocando un pequeño alícuota de matrigel sobre hielo a cuatro grados Celsius. A continuación, prepare la mezcla del gel con agua estéril de PBS, hidróxido de sodio, matrigel y colágeno de tipo uno de cola de rata. Luego mezcle los componentes del gel sobre hielo en la misma secuencia e incube la solución final durante una hora a cuatro grados Celsius.

Ahora coloque insertos para cultivo celular de ocho micrópocillos con un diámetro de 12 milímetros en una placa de 12 pocillos utilizando un par de pinzas esterilizadas. Luego cuente las células y resuspenda en medio libre de suero a cinco veces 10 a la seis células por mililitro; agregue 100 microlitros de suspensión celular a 900 microlitros de solución de gel. Después, mézclelos completamente pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.

Posteriormente, agregue 150 microlitros de la mezcla final a cada inserto. Luego, transfiera los insertos a un incubador con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante 30 minutos, hasta que el gel polimerice. Para la condición estática, agregue 100 microlitros del medio sin suero encima del gel y 1.200 microlitros debajo del inserto.

Los niveles de líquido dentro y fuera del inserto en el pocillo deben ser aproximadamente iguales, lo que resulta en una diferencia de presión mínima a través del gel y en ausencia de flujo intersticial. Para la condición de flujo, agregue 100 microlitros de medio sin suero debajo del inserto y 650 microlitros encima del gel. Al mismo tiempo, trate de evitar la formación de burbujas de aire debajo del inserto, ya que impedirán que las células migren a través de la membrana en esos lugares.

Luego, coloque la placa en un incubador con 5 % de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante 24 horas. En este paso, agregue 500 microlitros de PBS al 1× por pocillo en una nueva placa de 24 pocillos para lavar los insertos. A continuación, retire el medio que queda en la porción superior de los pocillos de flujo.

A continuación, utilice hisopos de algodón para eliminar el gel de los insertos. Pase un hisopo por la superficie superior de la membrana para eliminar las células no VA. Luego lave los insertos colocándolos en la placa de 24 pocillos que contiene PBS al uno por uno durante 15 segundos.

A continuación, retire el PBS y agregue 500 microlitros de paraformaldehído al 4 % debajo de cada inserto. Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente para fijar las células transmigradas. Luego, retire el PFA y enjuague una vez con 500 microlitros de PBS para eliminar el fijador residual.

A continuación, agregue 500 microlitros de solución de Triton X-100 al 0,5% debajo de los insertos e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Para permeabilizar las células, corte las membranas del inserto usando una hoja de afeitar. Luego, colóquelas en 100 microlitros de DPI a dos microgramos por mililitro en solución de PBS 1X.

Teniendo cuidado de colocar la cara inferior de la membrana hacia abajo. La solución de DPI debe prepararse unos minutos antes de su uso y mantenerse en la oscuridad. Ahora envuelva la placa con papel de aluminio.

Colóquelo en un agitador a 150 RPM durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, lave las membranas con 500 microlitros de PBS una vez y colóquelas nuevamente en el agitador durante 10 minutos. Para eliminar el jy libre, repita el lavado otras dos veces.

El siguiente paso consiste en colocar las membranas sobre portaobjetos con las células transmigradas orientadas hacia arriba. Añada solución de montaje a las membranas. A continuación, cúbralas con cubreobjetos.

Posteriormente, cuente la tinción de dappy respecto a los núcleos y calcule el número de células invadidas según el manuscrito adjunto. Esta figura muestra las células MDA MB 4 35 s transmigradas sobre la membrana. Las células invadidas se fijaron tras el ensayo de invasión por flujo de líquido intersticial y se tiñeron con DPI y foid conjugado con Alexa Fluor 4 88 para facilitar el conteo de las células invadidas.

Esta es la membrana en campo claro y aquí se observan los núcleos teñidos con DAPI. Aquí se muestran los filamentos de F-actina marcados con Alexa Fluor 488. Este gráfico muestra que la invasión de células de melanoma metastásico MDA MB 435s se vio significativamente potenciada por el flujo intersticial.

Después de 24 horas, los resultados se normalizan respecto al promedio de la condición de invasión estática y se presenta la media de seis insertos de cultivo celular. La diferencia entre las condiciones es estadísticamente significativa con un valor de P de 0,003. Una vez dominado, el ensayo de flujo de líquido intersticial puede prepararse en dos horas, seguido de una incubación de 24 horas y luego dos horas para la fijación y tinción de las membranas transversales.

Tras seguir este procedimiento, se pueden extraer fácilmente células, proteínas o ácidos nucleicos para responder preguntas adicionales, como cómo cambia la expresión génica y proteica en respuesta al flujo de líquido intersticial. Desde su desarrollo, este se ha convertido en un ensayo esencial para investigadores que estudian los efectos del flujo intersticial sobre células cancerosas.