Tridimensional de la célula modelo de cultivo para medir los efectos del flujo del fluido intersticial en la invasión de células tumorales

El objetivo de este procedimiento es exponer células cultivadas en 3D al flujo de fluido intersticial y cuantificar los efectos mediados por el flujo sobre la invasión celular. Esto se logra preparando primero una solución de gel que consta de colágeno tipo uno y matrigel. El segundo paso es agregar una concentración específica de células a la solución de gel.

A continuación, la suspensión celular se añade a un transpocillo de 12 milímetros de diámetro y ocho micras de tamaño de poro, y se incuba a 37 grados centígrados hasta que la matriz se gelifica. El paso final en la configuración del ensayo es agregar cantidades específicas de medios a los pozos transversales para crear condiciones estáticas y de flujo. 24 horas después, las membranas transwell se fijan, tiñen y visualizan para la cuantificación del número de células invadidas.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como las cámaras de flujo intersticial microfluídicas, es que no requiere bombas ni equipos especializados, y permite a los investigadores probar múltiples condiciones o tratamientos de manera fácil y rápida. Aunque este método puede proporcionar información sobre la migración e invasión celular, también se puede utilizar o aplicar para estudiar el efecto del flujo de fluido intersticial en otros comportamientos celulares relevantes, como la expresión de proteínas, la proliferación celular y las alteraciones en la señalización celular. La demostración de este procedimiento será un LIMA dos chaa.

Un estudiante de posgrado en mi laboratorio Comience este procedimiento arrojando una pequeña alícuota de gel de matri sobre hielo a cuatro grados centígrados. A continuación, prepare la receta de gel con agua estéril PBS, hidróxido de sodio, matrigel y colágeno tipo uno de cola de rata. A continuación, mezcle los componentes del gel en hielo en la misma secuencia e incube la solución final durante una hora a cuatro grados centígrados.

Ahora coloque un 12 milímetro de diámetro y ocho insertos de cultivo de células micro po en una placa de 12 pocillos usando un par de pinzas esterilizadas. Luego cuente las células y vuelva a suspenderlas en medios libres de suero a cinco veces 10 a las seis células por mililitro, agregue 100 microlitros de suspensión celular a 900 microlitros de solución de gel. Después de eso, mézclelos bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.

Posteriormente, agregue 150 microlitros de la mezcla final a cada inserto. Luego, transfiera los insertos a una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius durante 30 minutos hasta que el gel se polimerice. Para la condición estática, agregue 100 microlitros de medio libre de suero encima del gel y 1.200 microlitros microlitros debajo del inserto.

Los niveles de fluido dentro y fuera del inserto en el pocillo deben ser aproximadamente iguales, lo que resulta en una diferencia de presión mínima a través del gel y sin flujo intersticial. Para la condición de flujo, agregue 100 microlitros de medio libre de suero debajo del inserto y 650 microlitros sobre el gel. Al mismo tiempo, trate de evitar crear burbujas de aire debajo del inserto, ya que evitarán que las células migren a través de la membrana en estos lugares.

Luego coloque la placa en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados durante 24 horas. En este paso, agregue 500 microlitros de una vez PBS por pocillo en una nueva placa de 24 pocillos para lavar los insertos. A continuación, retire el medio que queda en la parte superior de los pozos de tendencias de flujo.

A continuación, utilice bastoncillos de algodón para eliminar el gel de las inserciones. Limpie la parte superior de la superficie de la membrana para eliminar las células que no son VA. A continuación, lave los insertos colocándolos en la placa de 24 pocillos que contiene una vez PBS durante 15 segundos.

Después de eso, retire el PBS y agregue 500 microlitros de 4% para formaldehído debajo de cada inserto. Incubarlas durante 30 minutos a temperatura ambiente para fijar las células transmigradas. A continuación, retire el PFA y enjuáguelos una vez con 500 microlitros una vez PBS para eliminar el fijador residual.

A continuación, agregue 500 microlitros de solución Triton X 100 al 0,5% debajo de los insertos e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Para perme las células, corta las membranas del inserto con una cuchilla de afeitar. Luego colóquelos en 100 microlitros de dos microgramos por mililitro DPI en una solución de PBS de una vez.

Tenga cuidado de colocar la parte inferior de la membrana hacia abajo. La solución DPI debe prepararse unos minutos antes de su uso y mantenerse en la oscuridad. Ahora envuelva el plato en papel de aluminio.

Colóquelo en una coctelera a 150 RPM durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, lave las membranas en 500 microlitros una vez PBS y vuelva a colocarlas en la coctelera durante 10 minutos. Para eliminar el jy libre, repita el lavado otras dos veces.

El siguiente paso es colocar las membranas en portaobjetos de vidrio con las células transmigradas hacia arriba. Agregue solución de montaje a las membranas. A continuación, cúbralos con cubreobjetos.

A continuación, cuente la tinción hasta el núcleo y calcule el número de células invadidas de acuerdo con el manuscrito adjunto. Esta figura muestra las células MDA MB 4 35 s transmigradas en la membrana. Las células invadidas se fijaron después del ensayo de invasión de flujo de fluido intersticial y se tiñeron con DPI y foid conjugado con Alexa Fluor 4 88 para facilitar el recuento de las células invadidas.

Esta es la membrana bajo el campo claro y aquí están los núcleos de tinción moteados. Aquí se muestra el foid Alexa Fluor 4 88 teñido con actina F. Este gráfico muestra que la invasión de las células de melanoma metastásico MDA MB 4 35 s fue significativamente mayor por el flujo intersticial.

Después de 24 horas, los resultados se normalizan al promedio de la condición de invasión estática y se presenta la media de seis insertos de cultivo celular. La diferencia entre condiciones es estadísticamente significativa con un valor de P de 0,003. Una vez dominado, el ensayo de flujo de fluido intersticial se puede configurar en dos horas, seguido de una incubación de 24 horas y luego dos horas para fijar y teñir las membranas transformadas.

Siguiendo este procedimiento, las células, proteínas o ácidos nucleicos se pueden extraer fácilmente para responder preguntas adicionales, como cómo cambia la expresión de genes y proteínas en respuesta al flujo de líquido intersticial. Desde su desarrollo, se ha convertido en un ensayo esencial para los investigadores que estudian los efectos del flujo intersticial en las células cancerosas.