Name: Tridimensional de la célula modelo de cultivo para medir los efectos del flujo del fluido intersticial en la invasión de células tumorales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Aprende a medir los efectos del flujo intersticial en la invasión de células tumorales mediante cultivos tridimensionales con colágeno tipo I y matrigel. Esta técnica reproducible permite cuantificar la migración celular sin equipos especializados.

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1. Ensayo de Set-up <ol><li> Descongelar una alícuota pequeña (&lt;500 l) de Matrigel en hielo a 4 ° C (aproximadamente 2 horas). </li><li> Prepare la receta de gel (véase el volumen de ejemplo en la tabla a continuación): 10x PBS (1x en el volumen total), hidróxido de sodio 1N (equivalente a 0.023 volúmenes de colágeno añadido, o por las recomendaciones del fabricante del colágeno, según corresponda), Matrigel y el colágeno de tipo I a la las concentraciones finales de 1 mg / ml y 1,3 mg / ml, respectivamente (otras formulaciones de la matriz pueden ser utilizados en función del tipo de célula y el experimento). </li></ol> Ejemplo de receta de gel de <table border="1"><tbody><tr><td> Componentes </td><td> Concentración de archivo </td><td> La concentración final </td><td> Añadir un volumen </td></tr><tr><td> PBS 10 veces </td><td> 10 veces </td><td> 1X </td><td> 0.090 ml </td></tr><tr><td> Agua estéril </td><td></td><td></td><td> 0.346 ml </td></tr><tr><td> NaOH 1N </td><td></td><td></td><td> 0,008 ml </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> 9,90 mg / ml </td><td> 1 mg / ml </td><td> 0.101 ml </td></tr><tr><td> Cola de rata colágeno tipo I </td><td> 3,66 mg / ml </td><td> 1,3 mg / ml </td><td> 0.355 ml </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Mezclar los componentes del gel sobre hielo en la misma secuencia que el anterior y solución final se incuba durante 1 hora a 4 ° C. En nuestra experiencia, una incubación de 1 hora antes de la siembra de células resultados en una gelificación más uniforme del colágeno. Asegúrese de mantener Matrigel y el colágeno en el hielo en todo momento y para trabajar lo más rápido posible para evitar la gelificación. </li><li> Colocar 12 mm de diámetro 8 micras de poro insertos de cultivo de células en una placa de 12 pocillos usando pinzas esterilizadas. </li><li> Contar las células y resuspender en medios libres de suero a 5 x 10 6 células / ml (volumen total debe ser de 10% de la solución de gel). </li><li> Añadir 100 l de Su celularspension a 900 l de solución de gel (concentración final de células de 5 x 10 5 células / ml) y mezclar bien con la pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo. </li><li> Añadir 150 ml de la mezcla final de cada inserto y la transferencia a un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante 30 minutos hasta que el gel se polimeriza. </li><li> Utilizando medios libres de suero, </li></ol><ul><li> Añadir 100 l en la parte superior del gel y l 1200 bajo el inserto para la condición estática. Los niveles de fluido en el interior del inserto y en el exterior, así debe ser aproximadamente igual, lo que resulta en la diferencia de presión mínima a través del gel y no hay flujo intersticial. </li><li> Añadir 100 l bajo el inserto y por encima de 650 l de gel para la condición de flujo. Tenga cuidado para evitar las burbujas de aire debajo de la inserción, ya que impiden que las células migren a través de la membrana en estos lugares. La diferencia de presión generada por estos volúmenes es de aproximadamente 1,3 cm de H 2 O (o 1 mm de Hg). </li></ul><ol start="9"><li> Coloque la placa en un 37° C, 5% de CO 2 incubadora durante 24 horas. </li></ol> 2. Tinción celular y recuento <ol><li> Añadir 500 l de 1X PBS por pocillo en la placa de nuevo 24-bien, lo que se utiliza para lavar los insertos. </li><li> Eliminar el medio restante en la porción superior de los transwells flujo y determinar el volumen. Calcular el volumen total de eluido restando el volumen restante del volumen total originalmente añadido, 650 l (esto se usa para los cálculos de velocidad de flujo, ver más abajo). Utilizar bastoncillos de algodón para quitar el gel de los insertos y para limpiar la superficie superior de la membrana para eliminar las células no invadidas. Coloque los insertos en la placa de 24 pocillos que contenía 1X PBS durante 15 s para lavar insertos. </li><li> Retire PBS y añadir 500 l de paraformaldehído al 4% (PFA) debajo de cada inserto y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente para fijar las células transmigrados. </li><li> Retire la PFA y enjuagar una vez con 500 l 1X PBS para eliminar el fijador residual. </li><li> Añadir 500 l of 0,5% Triton X-100 solución por debajo de las inserciones y se incuban durante 10 minutos a temperatura ambiente para permeabilizar las células. </li><li> Cortar las membranas de la inserción utilizando una cuchilla de afeitar y el lugar en 100 l de 2 g / ml DAPI en 1X solución de PBS, teniendo cuidado de colocar la parte inferior de la cara membrana hacia abajo (células transmigrados boca abajo). </li><li> Envolver la placa en papel de aluminio y el lugar en un agitador a 150 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Lave las membranas en 500 l de PBS 1X en el agitador (repetir 3 veces durante 10 minutos cada uno) para eliminar DAPI libre. </li><li> Coloque las membranas en portaobjetos de vidrio con células transmigrados hacia arriba, agregar la solución de montaje y cubreobjetos. </li></ol> 3. Análisis de Datos <ol><li> Cuente con DAPI núcleos teñidos en 5 lugares seleccionados al azar de cada membrana (mantenerse alejado de los bordes y utilizar un 10X o 20X lente del objetivo). </li><li> Calcular el recuento promedio de células y obtener la invasión por ciento mediante la siguiente fórmula: Invasión Porcentaje = x 100% (recuento medio de células x membrana de superficie) / (área de superficie del número microscopio x imagen de células sembradas) La invasión por ciento puede ser normalizado en cierta condición de control (típicamente la condición estática) para permitir la comparación entre los experimentos independientes. </li><li> Calcular el caudal medio: dividir el volumen total eluida en la condición de flujo por el tiempo de incubación (por ejemplo, 24 h). </li><li> Calcular la velocidad de flujo media: dividir el caudal medio por el área transversal del gel / membrana (en este caso de 60 mm 2). </li></ol> 4. Los resultados representativos Para medir la invasión de células tumorales bajo flujo intersticial, hemos realizado nuestra 3-D ensayo de invasión de flujo utilizando MDA-MB-435S células de melanoma metastásico. Estas células han sido demostrado para invadir en respuesta al flujo de fluido intersticial 13-14. Las células fueron incorporados en una matriz compuesta de 1,3 mg / ml de rata taitendón l colágeno de tipo I y 1 mg / ml de matriz sótano Matrigel membrana celular a una concentración final de 5 x 10 5 células / ml. Dos condiciones se compararon diferentes: (1) el flujo intersticial media = 0,1 m s-1 y (2) condición estática = sin flujo mensurable (Figura 1). Después de 24 horas, las células que invaden a través de los poros de la membrana se tiñeron con DAPI para facilitar el recuento de células. La figura 2 muestra una imagen representativa de las células invadidas. Bajo claro, sólo los poros de la membrana son visibles. Uso de fluorescencia, los núcleos con DAPI-manchado fueron utilizados para el recuento de células y las estructuras manchadas de phalloidin F-actina se utiliza para visualizar el cuerpo celular (opcional). El uso de un de t de Student asumiendo varianzas iguales, se demostró que el flujo intersticial aumenta significativamente la MDA-MB-435S invasión de las células en 2,3 veces en condiciones estáticas (p = 0,003) (Figura 3). Esta corroboraciónTes resultados similares (pero con diferentes condiciones de la matriz y por lo tanto las velocidades de flujo) utilizando esta línea celular 13-14. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4159/4159fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemática del ensayo de 3-D invasión intersticial de flujo de fluido. En primer lugar preparar la solución en gel utilizando concentraciones apropiadas y volúmenes. Luego añadir las células a la solución de gel y transferir a los insertos de cultivo celular. Por último agregar el volumen adecuado de los medios de comunicación a cada condición y se incuba. El flujo de fluido intersticial es impulsado por una cabeza de presión de fluido. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4159/4159fig2.jpg" /> Figura 2. Transmigrado MDA-MB-435S celdas de membrana. Células invadidas fueron fijadas después de nuestra invasión de ensayo de flujo del líquido intersticial y se tiñeron con DAPI y Alexa Fluor 488-conjugado phalloidin para facilitar el recuento de las células invadidas, una imagen) de la membrana en campo claro; B) DAPI estaciónnúcleos INED (en azul), C) Alexa Fluor 488-phalloidin manchas F-actina (en verde). Barra de escala representa 50 micras. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4159/4159fig3.jpg" /> Figura 3. El aumento de la invasión de MDA-MB-435S células bajo flujo. Invasión de la célula después de 24 h mejorado significativamente por el flujo intersticial (p = 0,003). Los resultados se normalizan a la condición estática y el promedio de los valores representan la media ± SEM de 6 inserciones de cultivo celular.

<ol><li>Cichon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+influences+that+drive+progression+from+benign+breast+disease+to+invasive+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mammary+Gland.+Biol.+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental influences that drive progression from benign breast disease to invasive breast cancer.</a> J. Mammary Gland. Biol. Neoplasia. 15, 389-3897 (2010).</li>
<li>Proia, D. A., Kuperwasser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroma%3A+tumor+agonist+or+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Stroma: tumor agonist or antagonist.</a> Cell Cycle. 4, 1022-1025 (2005).</li>
<li>Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+.Surg.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment and progression.</a> J .Surg. Oncol. 103, 468-474 (2011).</li>
<li>Provenzano, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC Med. 6, 11(2008).</li>
<li>Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Paszek, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Levental, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139, 891-906 (2009).</li>
<li>Butler, T. P., Grantham, F. H., Gullino, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+transfer+of+fluid+in+the+interstitial+compartment+of+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Bulk transfer of fluid in the interstitial compartment of mammary tumors.</a> Cancer Res. 35, 3084-3088 (1975).</li>
<li>Dafni, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+vascular+endothelial+growth+factor+165+drives+peritumor+interstitial+convection+and+induces+lymphatic+drain%3A+magnetic+resonance+imaging%2C+confocal+microscopy%2C+and+histological+tracking+of+triple-labeled+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Overexpression of vascular endothelial growth factor 165 drives peritumor interstitial convection and induces lymphatic drain: magnetic resonance imaging, confocal microscopy, and histological tracking of triple-labeled albumin.</a> Cancer Res. 62, 6731-6739 (2002).</li>
<li>Chary, S. R., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+interstitial+convection+and+diffusion+of+albumin+in+normal+and+neoplastic+tissues+by+fluorescence+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of interstitial convection and diffusion of albumin in normal and neoplastic tissues by fluorescence photobleaching.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5385-5389 (1989).</li>
<li>Heldin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+interstitial+fluid+pressure+-+an+obstacle+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 4, 806-813 (2004).</li>
<li>Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microvasculature+and+microenvironment%3A+novel+insights+through+intravital+imaging+in+pre-clinical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models.</a> Microcirculation. 17, 206-225 (2010).</li>
<li>Shields, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+chemotaxis+as+a+mechanism+of+tumor+cell+homing+to+lymphatics+via+interstitial+flow+and+autocrine+CCR7+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Autologous chemotaxis as a mechanism of tumor cell homing to lymphatics via interstitial flow and autocrine CCR7 signaling.</a> Cancer Cell. 11, 526-538 (2007).</li>
<li>Shieh, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+invasion+is+promoted+by+interstitial+flow-induced+matrix+priming+by+stromal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor cell invasion is promoted by interstitial flow-induced matrix priming by stromal fibroblasts.</a> Cancer Res. 71, 790-800 (2011).</li>
<li>Shi, Z. D., Wang, H., Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+proteoglycans+mediate+interstitial+flow+mechanotransduction+regulating+MMP-13+expression+and+cell+motility+via+FAK-ERK+in+3D+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate proteoglycans mediate interstitial flow mechanotransduction regulating MMP-13 expression and cell motility via FAK-ERK in 3D collagen.</a> PLoS One. 6, e15956(2011).</li>
<li>Fleury, M. E., Boardman, K. C., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+morphogen+gradients+by+subtle+interstitial+flow+and+matrix+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Autologous morphogen gradients by subtle interstitial flow and matrix interactions.</a> Biophys J. 91, 113-121 (2006).</li>
<li>Miteva, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmural+flow+modulates+cell+and+fluid+transport+functions+of+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Transmural flow modulates cell and fluid transport functions of lymphatic endothelium.</a> Circ. Res. 106, 920-931 (2010).</li>
<li>Ng, C. P., Hinz, B., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+fluid+flow+induces+myofibroblast+differentiation+and+collagen+alignment+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Interstitial fluid flow induces myofibroblast differentiation and collagen alignment in vitro.</a> J. Cell. Sci. 118, 4731-4739 (2005).</li>
<li>Kunder, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell-derived+particles+deliver+peripheral+signals+to+remote+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Mast cell-derived particles deliver peripheral signals to remote lymph nodes.</a> J. Exp. Med. 206, 2455-2467 (2009).</li>
<li>Helm, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+between+interstitial+flow+and+VEGF+directs+capillary+morphogenesis+in+vitro+through+a+gradient+amplification+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synergy between interstitial flow and VEGF directs capillary morphogenesis in vitro through a gradient amplification mechanism.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15779-15784 (2005).</li>
<li>McGuire, P. G., Seeds, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+plasminogen+activator+with+a+reconstituted+basement+membrane+matrix+and+extracellular+macromolecules+produced+by+cultured+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">The interaction of plasminogen activator with a reconstituted basement membrane matrix and extracellular macromolecules produced by cultured epithelial cells.</a> J Cell Biochem. 40, 215-227 (1989).</li>
<li>Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+type+IV+procollagen%2C+laminin%2C+and+heparan+sulfate+proteoglycan+from+the+EHS+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma.</a> Biochemistry. 21, 6188-6193 (1982).</li>
<li>Haessler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+dynamics+of+breast+cancer+cells+in+a+tunable+3D+interstitial+flow+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber.</a> Integr. Biol. (Camb). , (2011).</li>
<li>Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+flow+influences+direction+of+tumor+cell+migration+through+competing+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11115-11120 (2011).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Aquí hemos descrito una metodología para cuantificar el efecto del flujo intersticial en la invasión de células tumorales, utilizando células embebidas en una matriz de 3-D dentro de un inserto de cultivo celular. Este y otros métodos se han utilizado para estudiar el efecto del flujo intersticial en una variedad de tipos celulares 13-15, 17. Nuestro enfoque parte imita la matriz de microambiente del tumor mediante el uso de colágeno tipo I y Matrigel que contienen proteínas que se encuentran en la membrana b...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Colágeno (cola de rata) </td><td> BD </td><td> 354236 </td><td> Mantener estériles </td></tr><tr><td> Celular Millicell la cultura de inserción </td><td> Millipore </td><td> PI8P01250 </td><td> 8 micras de diámetro de poro, policarbonato membrana </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD </td><td> 354234 </td><td> Mantener estériles </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 100M-8202 </td><td> 10 veces para preparar solución de gel, 1x para el lavado de los pasos </td></tr><tr><td> Hidróxido de sodio, solución 1,0 N </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S2770 </td><td> Mantener estériles </td></tr><tr><td> DMEM 1X </td><td> CellGro </td><td> 10 a 013 CV </td><td> Mantener estériles </td></tr><tr><td> Suero Bovino Fetal </td><td> Atlanta Productos Biológicos </td><td> 511150 </td><td> Mantener estériles </td></tr><tr><td> La penicilina estreptomicina </td><td> CellGro </td><td> 30002CI </td><td> Mantener estériles </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> X100-500 ml </td><td> 0,5% en PBS </td></tr><tr><td> Paraformaldehído </td><td> Fisher Scientific </td><td> 04042-500 </td><td> 4% en PBS </td></tr><tr><td> Agua desionizada </td><td></td><td></td><td> Mantener estériles </td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0215757401 </td><td> 1 mg / ml de solución de stock </td></tr><tr><td> Solución de montaje </td><td> Thermo Scientific </td><td> TA-030-FM </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> CellGro </td><td> 25 a 052-CI </td><td> Mantener estériles </td></tr></tbody> &lt;/ Table&gt;

tridimensional de la célula modelo de cultivo para medir los efectos del flujo del fluido intersticial en la invasión de células tumorales

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

El crecimiento y la progresión de la mayoría de los tumores sólidos depende de la transformación inicial de las células cancerosas y su respuesta a estroma asociada a la señalización en el microambiente del tumor 1. Anteriormente, la investigación sobre el microambiente del tumor se ha centrado principalmente en tumores del estroma interacciones 1-2. Sin embargo, el microambiente del tumor también incluye una variedad de fuerzas biofísicas, cuyos efectos siguen siendo poco conocidos. Estas fuerzas son las consecuencias biomecánicas de crecimiento de los tumores que conducen a cambios en la expresión génica, la división celular, la diferenciación y la invasión 3. Densidad de matriz 4, rigidez 5-6, 6-7 y la estructura, la presión del fluido intersticial 8, y el flujo de fluido intersticial 8 están alterados durante la progresión del cáncer. El flujo de fluido intersticial en particular es mayor en los tumores en comparación con 8-10 tejidos normales. La baja estima que el líquido intersticialvelocidades ow se midieron y se encontró que en el intervalo de 0,1-3 micras s -1, dependiendo del tamaño del tumor y la diferenciación 9, 11. Esto es debido a la presión elevada del líquido intersticial causada por el tumor angiogénesis inducida por aumento de la permeabilidad vascular y 12. El flujo de fluido intersticial se ha demostrado que aumenta la invasión de las células cancerosas 13-14, fibroblastos vasculares y células musculares lisas 15. Esta invasión puede ser debido a los gradientes quimiotácticos autólogas creadas en torno a las células en 3-D de 16 o mayor metaloproteinasas de matriz (MMP) la expresión 15, la secreción de quimioquinas y la adhesión celular expresión de la molécula 17. Sin embargo, el mecanismo por el cual las células detectar el flujo de fluido no se entiende bien. Además de alterar el comportamiento de las células tumorales, el flujo de líquido intersticial modula la actividad de otras células en el microambiente tumoral. Está asociada con la diferenciación de conducción (a) de fibroblastos en promotor de tumores myofibroblasts 18, (b) al transporte de los antígenos y otros factores solubles a los ganglios linfáticos 19, y (c) modulación de morfogénesis linfático de células endoteliales 20. La técnica que aquí se presenta impone el flujo de fluido intersticial en células in vitro y cuantifica sus efectos sobre la invasión (Figura 1). Este método ha sido publicada en múltiples estudios para medir los efectos de flujo de fluido en estroma y la invasión de las células cancerosas 13-15, 17. Al cambiar la composición de la matriz, el tipo de célula, y la concentración celular, este método puede ser aplicado a otras enfermedades y sistemas fisiológicos para estudiar los efectos del flujo intersticial en los procesos celulares tales como la invasión, la diferenciación, proliferación y la expresión génica.

El flujo de fluido intersticial es elevada en los tumores sólidos y puede modular la invasión de células tumorales. Aquí se describe una técnica para aplicar el flujo de fluido intersticial a las células embebidas en una matriz y luego medir sus efectos sobre la invasión de células. Esta técnica se puede adaptar fácilmente para estudiar otros sistemas.

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El objetivo de este procedimiento es exponer células cultivadas en 3D a flujo de fluido intersticial y cuantificar los efectos del flujo sobre la invasión celular. Esto se logra primero preparando una solución de gel que consiste en colágeno tipo I y matrigel. El segundo paso es añadir una concentración especificada de células a la solución de gel.A continuación, se añade la suspensión celular a un transbienal de 12 milímetros de diámetro con poros de ocho micrómetros de tamaño, y se incuba a 37 grados Celsius hasta que la matriz se gelifique. El último paso en el montaje del ensayo consiste en añadir cantidades específicas de medio a los transbienales para crear condiciones estáticas y de flujo. Veinticuatro horas después, las membranas de los transbienales se fijan, tiñen y visualizan para la cuantificación del número de células invadidas.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como las cámaras de flujo intersticial microfluídicas, es que no requiere bombas ni equipos especializados, y permite a los investigadores probar múltiples condiciones o tratamientos de forma fácil y rápida. Aunque este método puede proporcionar información sobre la migración

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Este artículo proporciona metodologías detalladas para el uso de ensayos (3D) en tres dimensiones para cuantificar la invasión de células de cáncer de mama. En concreto, se discuten los procedimientos necesarios para configurar este tipo de ensayos, la cuantificación y el análisis de datos, así como los métodos para examinar la pérdida de integridad de la membrana que se produce cuando las células invaden.

La cuantificación de la invasividad de las células del cáncer de mama El uso de un modelo (3D) Tres Dimensiones

Aquí presentamos un protocolo para el cocultivo en tres dimensiones, que es útil para investigar las interacciones multicelulares y la modulación dependiente de la matriz extracelular del comportamiento de las células cancerosas. En este modelo experimental, las células cancerosas se cultivan en geles de colágeno incrustados con fibroblastos asociados al cáncer humano.

Tridimensional Modelo Co-cultura para la interacción tumor estromal

La invasión de los tejidos normales circundantes es una característica definitoria de los tumores malignos. Proporcionamos aquí un ensayo de microplaca simple y semiautomatizado de invasión en una biomatriz 3D natural que se ha ejemplificado con una serie de modelos de cánceres humanos avanzados.

Tumor Ensayo tridimensional (3D) esferoide Invasion

Este método evalúa la invasión de células cancerosas desde esferoides a una matriz 3D circundante.  Los esferoides se generan mediante el método de cultivo de gota colgante y luego se incrustan en una matriz compuesta por materiales de membrana basal y colágeno tipo I.  Posteriormente, se monitorea la invasión de los esferoides.

Un Cancer Cell esferoide Ensayo para evaluar la invasión en un entorno 3D

Las células cancerosas se incrustan en un gel de colágeno y luego se intercalan en un gel de fibrina acelular para generar un sistema de cultivo 3D en el que se puede monitorear la invasividad y la formación de tumores satélite.

Tridimensional Ensayo de Cultivo para explorar invasividad de las células del cáncer y la formación de tumores satélite

Los procesos de invasión del cáncer de vejiga representan oportunidades para el desarrollo terapéutica y biomarcadores. Aquí presentamos un modelo de invasión de cáncer de vejiga que incorpora 3D cultura de esferoides tumorales, proyección de imagen de Time-lapse y microscopía confocal. Esta técnica es útil para definir las características del proceso invasivo y para la detección de agentes terapéuticos.

Sistema del cultivo celular 3-d para invasión de estudiar y evaluar la terapéutica en el cáncer de vejiga

El objetivo de este protocolo es establecer un modelo 3D in vitro para estudiar la diferenciación de los fibroblastos asociados al cáncer (CAC) en un entorno tumoral a granel, que puede abordarse en diferentes sistemas de análisis, como la inmunofluorescencia, la transcripción análisis e imágenes de células salvavidas.

Un modelo de esferoides 3D como un sistema más fisiológico para la diferenciación de fibroblastos asociados al cáncer y estudios de invasión in Vitro

El enfoque presentado evalúa simultáneamente la invasión de células cancerosas en ensayos esferoides 3D y citotoxicidad de células T. Los esferoides se generan en un molde multimicropopo sin andamios. El cocultivo y la incrustación en la matriz de colágeno tipo I se realizan dentro del mismo dispositivo que permite monitorear la invasión de células cancerosas y la citotoxicidad mediada de las células T.

Monitoreo de la invasión de células cancerosas y la citotoxicidad de células T en el cultivo 3D

La invasión es un fenómeno biológico importante en el desarrollo y la progresión del cáncer. Este proceso está influenciado por las células no neoplásicas y los componentes del microambiente tumoral. El propósito de este estudio es describir un método alternativo para analizar la invasión de células tumorales in vitro utilizando cultivos tridimensionales (3D).

Estrategia alternativa para analizar la invasión celular in vitro de cultivos 3D

Aprende a medir los efectos del flujo intersticial en la invasión de células tumorales mediante cultivos tridimensionales con colágeno tipo I y matrigel. Esta técnica reproducible permite cuantificar la migración celular sin equipos especializados.

Tridimensional de la célula modelo de cultivo para medir los efectos del flujo del fluido intersticial en la invasión de células tumorales (Video) | JoVE Journal

Tridimensional de la célula modelo de cultivo para medir los efectos del flujo del fluido intersticial en la invasión de células tumorales

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