Péptidos de penetración celular biotinilado para estudiar interacciones de proteínas intracelulares

El objetivo general de este procedimiento es estudiar las interacciones proteína-proteína en un contexto intracelular. Esto se logra a través de un sistema de extracción de biotina-avidina combinado con secuencias autopenetrantes, lo que permite la incubación en la secuencia objetivo con células vivas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la señalización celular, como las interacciones rápidas y dinámicas entre biomoléculas para obtener señales específicas.

La principal ventaja de esta técnica es que las interacciones moleculares tienen lugar en un contexto intracelular. En este estudio, se colocaron placas de células madre de glioma humano G166 o GSC en cuatro frascos de 150 centímetros cuadrados, tal y como se describe en el protocolo de texto. Procese las celdas cuando se alcance la confluencia.

Cuando cinco millones de células G166 se siembran en un matraz de 150 centímetros cuadrados, se procesan dos días después de la siembra. Haga girar los viales que contienen los péptidos biotinilados liofilizados que penetran en las células a 8.200 veces g durante 30 segundos para evitar que quede parte del polvo en la tapa. Incluya un BCPP controlado para asegurarse de que las interacciones encontradas son específicas para la secuencia objetivo.

A continuación, disuelva los BCPP en el medio de cultivo correspondiente a la solución madre indicada por el fabricante. Para obtener una solución madre de dos miligramos por mililitro de BCPP para tratar las GSC, agregue 0,5 mililitros de medio de cultivo de GSC a un vial que contenga un miligramo de BCPP. Agite los viales y asegúrese de que el péptido esté bien disuelto.

Prepare al menos 12 tubos de 1,5 mililitros por condición en el ensayo desplegable que se va a realizar. Marque los primeros tres tubos por condición. Tendrán el volumen total de lisados celulares.

A continuación, marque una A en tres tubos por condición. Estos tubos tendrán los primeros sobrenadantes obtenidos después de lisar e hilar los lisados celulares. Luego, marque una B en tres tubos por condición.

Estos tubos tendrán una pequeña alícuota de los primeros sobrenadantes para las muestras de Western blot. Finalmente, marque una C en tres tubos por condición. Estos tubos tendrán los sobrenadantes obtenidos después del pull-down con NeutrAvidin.

Después de aspirar el medio de cultivo de las células, reemplácelo con el volumen correspondiente de medio fresco requerido para incubar los BCPP en el menor volumen posible de medio de acuerdo con los tiempos de incubación. Es muy importante que, en cualquier caso, el medio cubra completamente toda la superficie del matraz. Añada el volumen de la solución madre de BCPP a los cultivos celulares para alcanzar la concentración que ha demostrado ser eficaz.

Por lo tanto, agregue 92,8 microlitros de dos miligramos por mililitro de TAT-connexin 43 266-283 biotina por mililitro de medio de cultivo. Coloque las células en la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos para asegurarse de que se produzcan las interacciones entre el BCPP y sus socios intracelulares. Para realizar la extracción de proteínas, primero aspire el medio de cultivo por completo, luego lave las células con 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato helado por 150 centímetros con mucho cuidado para evitar el autodesprendimiento.

Para obtener el lisado celular, agregue tres mililitros de tampón de lisis por matraz de 150 centímetros cuadrados y raspe completamente la superficie con un raspador de celdas. Inclinar el matraz a unos 45 grados facilitará la recolección de los lisados celulares en sus tubos correspondientes. Vierta un mililitro del lisado celular por tubo en tres tubos de 1,5 mililitros marcados por condición.

Para el despliegue, centrifugar los tubos de 1,5 mililitros a 11.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos etiquetados como A. Transfiera una alícuota del sobrenadante por condición a diferentes tubos etiquetados como B. Luego, agregue 16.6 microlitros de tampón Laemmli 4x para 50 microlitros de lisado y congele a menos 20 grados Celsius. A continuación, homogeneizar muy bien la agarosa NeutrAvidin agitándola suavemente.

Corte las puntas de las pipetas para aumentar su diámetro y mejorar el pipeteo de las perlas. A continuación, añadir 50 microlitros de agarosa NeutrAvidin por mililitro de lisado celular en los tubos A. Incubar los lisados celulares a cuatro grados centígrados durante la noche con una agitación muy suave para permitir que NeutrAvidin interactúe con los BCPP unidos a sus socios intracelulares.

A continuación, centrifugar a 3.000 veces g durante un minuto a cuatro grados centígrados para recoger el complejo de NeutrAvidin con proteínas. Retire con cuidado los sobrenadantes y transfiéralos a tubos limpios etiquetados como C. Guárdelos para usarlos en caso de que el desmontaje no tenga éxito. Para lavar el complejo de NeutrAvidin con proteínas, agregue tampón de lisis fresco a los gránulos de los tubos A.

Vuelva a suspender el pellet por inversión y repita la centrifugación. Repite este lavado cinco veces más. Todos estos sobrenadantes se pueden descartar.

A continuación, agregue 40 microlitros de 2x tampón Laemmli por tubo de 1,5 mililitros para pellets obtenidos de matraces de 150 centímetros cuadrados de celdas confluentes. A continuación, eluir a 100 grados centígrados durante cinco minutos para disociar las interacciones entre las proteínas. Después de la elución, centrifugar durante 30 segundos a 8, 200 veces g para pellet perlas de NeutrAvidin.

Transfiera los sobrenadantes que contienen las proteínas disociadas con puntas capilares a nuevos tubos etiquetados como D. Estos sobrenadantes ahora están listos para ser cargados en un Western blot como se describe en el protocolo de texto o se pueden congelar a menos 20 grados Celsius. Aquí se muestran imágenes de inmunocitoquímica que muestran que la fusión de biotina con TAT-connexin 43 266-283 no modifica los efectos del péptido que penetra en las células sobre la morfología de las células madre del glioma. El análisis MTT de GSC tratado con BCPP o CPP muestra que la fusión de biotina a TAT-connexina 43 266-283 no modifica el efecto antiproliferativo de TAT-connexin 43 266-283 sobre GSC.

Aquí se muestran los resultados representativos de un pull-down del BCPP seguido de Western blot. El Western blot muestra que las proteínas descritas para interactuar con el TAT, por ejemplo, Cav-1, aparecen en ambas condiciones. Las proteínas descritas para interactuar con Cx43, por ejemplo, c-Src y PTEN, aparecen justo después de la reducción de TAT-conexina 43 266-283, mientras que las proteínas que no interactúan directamente con Cx43 o TAT no están presentes, por ejemplo, FAK.

Las imágenes de microscopía confocal confirman las interacciones intracelulares encontradas con los BCPP. Las imágenes muestran la colocalización intracelular de TAT-conexina 43 266-283 con c-Src cerca de la membrana plasmática en GSCs G166. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos días si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante confirmar la temperatura de los reactivos y la centrífuga, así como la confluencia de las celdas antes de agregar los péptidos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar las interacciones intracelulares proteína-proteína utilizando péptidos biotinilados que penetran en las células. Tras su desarrollo, esta técnica abre el camino a las investigaciones en el campo de la señalización celular para explorar los mecanismos moleculares intracelulares y sus vías específicas de línea en células de cultivo, cultivos organotípicos e incluso modelos in vivo.

Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otras cargas bioactivas como secuencias de ARN, nanopartículas, virus u otras moléculas que pueden transfundirse con péptidos que penetran en las células y fusionarse para reducir los TAT para estudiar su mecanismo de acción intracelular. Aunque no se incluyen materiales extremadamente peligrosos en este protocolo, no olvide usar guantes y bata de laboratorio mientras realiza este procedimiento.