Name: Métodos de estudio cambios de agregación inherente de proteína con la edad en Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Aprende a detectar cambios en la agregación de proteínas durante el envejecimiento en Caenorhabditis elegus. Este método permite evaluar el efecto del silenciamiento génico en la proteostasis y ofrece un marco robusto para investigar los mecanismos del envejecimiento celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabajo fue apoyado por fondos de la DZNE y una beca de reinserción Marie Curie Internacional (322120 a D.C.D.)

<ol><li>Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adapting+proteostasis+for+disease+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adapting proteostasis for disease intervention.</a> Science. 319, 916-919 (2008).</li>
<li>David, D. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23181070">Aging and the aggregating proteome.</a> Frontiers in genetics. 3, 247(2012).</li>
<li>Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+chaperones+in+protein+folding+and+proteostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular chaperones in protein folding and proteostasis.</a> Nature. 475, 324-332 (2011).</li>
<li>Ayyadevara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-+and+Hypertension-Associated+Protein+Aggregates+in+Mouse+Heart+Have+Similar+Proteomic+Profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Age- and Hypertension-Associated Protein Aggregates in Mouse Heart Have Similar Proteomic Profiles.</a> Hypertension. 67, 1006-1013 (2016).</li>
<li>David, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+protein+aggregation+as+an+inherent+part+of+aging+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans.</a> PLoS biology. 8, 1000450(2010).</li>
<li>Demontis, F., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXO%2F4E-BP+signaling+in+Drosophila+muscles+regulates+organism-wide+proteostasis+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FOXO/4E-BP signaling in Drosophila muscles regulates organism-wide proteostasis during aging.</a> Cell. 143, 813-825 (2010).</li>
<li>Lechler, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+Insulin%2FIGF-1+Signaling+Restores+the+Dynamic+Properties+of+Key+Stress+Granule+Proteins+during+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Reduced Insulin/IGF-1 Signaling Restores the Dynamic Properties of Key Stress Granule Proteins during Aging.</a> Cell reports. 18, 454-467 (2017).</li>
<li>Reis-Rodrigues, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+age-dependent+changes+in+protein+solubility+identifies+genes+that+modulate+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+cell%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of age-dependent changes in protein solubility identifies genes that modulate lifespan.</a> Aging cell. 11, 120-127 (2012).</li>
<li>Tanase, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Carbonyl+Modifications+on+Aging-Associated+Protein+Aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Role of Carbonyl Modifications on Aging-Associated Protein Aggregation.</a> Scientific reports. 6, 19311(2016).</li>
<li>Walther, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+Proteome+Remodeling+and+Aggregation+in+Aging+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans.</a> Cell. 161, 919-932 (2015).</li>
<li>Lee, V. M., Wang, J., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+paired+helical+filament+tau+and+normal+tau+from+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Purification of paired helical filament tau and normal tau from human brain tissue.</a> Methods in enzymology. 309, 81-89 (1999).</li>
<li>Goudeau, J., Aguilaniu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbonylated+proteins+are+eliminated+during+reproduction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+cell%22%5BJournal%5D)">Carbonylated proteins are eliminated during reproduction in C. elegans.</a> Aging cell. 9, 991-1003 (2010).</li>
<li>Zimmerman, S. M., Hinkson, I. V., Elias, J. E., Kim, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+Aging+Drives+Protein+Accumulation+in+the+Uterus+and+Limits+Lifespan+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Reproductive Aging Drives Protein Accumulation in the Uterus and Limits Lifespan in C. elegans.</a> PLoS genetics. 11, 1005725(2015).</li>
<li>Uno, M., Nishida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan-regulating+genes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Npj+Aging+And+Mechanisms+Of+Disease%22%5BJournal%5D)">Lifespan-regulating genes in C. elegans.</a> Npj Aging And Mechanisms Of Disease. 2, 16010(2016).</li>
<li>Sulston, J. H. <a target="_blank" href="NULL">The Nematode Caenorhabditis elegans</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).</li>
<li>Maine, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+As+a+tool+for+understanding+germline+development+in+Caenorhabditis+elegans%3A+uses+and+cautions%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">RNAi As a tool for understanding germline development in Caenorhabditis elegans: uses and cautions.</a> Developmental biology. 239, 177-189 (2001).</li>
<li>Rauniyar, N., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isobaric+labeling-based+relative+quantification+in+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+proteome+research%22%5BJournal%5D)">Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics.</a> Journal of proteome research. 13, 5293-5309 (2014).</li>
<li>Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+polyglutamine+pathogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans.</a> Methods in enzymology. 412, 256-282 (2006).</li>
<li>Fay, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+genetic+methods%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Classical genetic methods.</a> WormBook. , 1-58 (2013).</li>
<li>Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+enhances+the+heat+shock+response+and+decreases+polyglutamine+aggregation+in+an+HSF-1-dependent+manner+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 141, 1-4 (2014).</li>
<li>Angeli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+synthesis+inhibitor+is+protective+against+proteotoxic+stressors+via+modulation+of+fertility+pathways+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Aging (Albany NY). 5, 759-769 (2013).</li>
<li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PLoS One. 9, 85964(2014).</li>
<li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).</li>
<li>Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+and+insulin+signaling+regulate+reproductive+aging+via+oocyte+and+germline+quality+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TGF-beta and insulin signaling regulate reproductive aging via oocyte and germline quality maintenance.</a> Cell. 143, 299-312 (2010).</li>
<li>Andux, S., Ellis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+maintains+oocyte+quality+in+aging+Caenorhabditis+elegans+females%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Apoptosis maintains oocyte quality in aging Caenorhabditis elegans females.</a> PLoS genetics. 4, 1000295(2008).</li>
<li>Vilchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPN-6+determines+C.+elegans+longevity+under+proteotoxic+stress+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions.</a> Nature. 489, 263-268 (2012).</li>
<li>Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcription+elongation+factor+that+links+signals+from+the+reproductive+system+to+lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS genetics. 5, 1000639(2009).</li>
<li>Shemesh, N., Shai, N., Meshnik, L., Katalan, R., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+the+Trade-Off+between+Somatic+Proteostasis+and+Reproduction+in+Caenorhabditis+elegans+Models+of+Polyglutamine+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Uncoupling the Trade-Off between Somatic Proteostasis and Reproduction in Caenorhabditis elegans Models of Polyglutamine Diseases.</a> Front Mol Neurosci. 10, 101(2017).</li>
<li>Kaletsky, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+adult+neuronal+IIS%2FFOXO+transcriptome+reveals+adult+phenotype+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators.</a> Nature. 529, 92-96 (2016).</li>
<li>Kawarabayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+changes+in+brain%2C+CSF%2C+and+plasma+amyloid+%28beta%29+protein+in+the+Tg2576+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Age-dependent changes in brain, CSF, and plasma amyloid (beta) protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 372-381 (2001).</li>
<li>Kraemer, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+and+defective+neurotransmission+in+a+Caenorhabditis+elegans+model+of+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 9980-9985 (2003).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí se presenta una metodología para aislar a agregados de proteína altamente insoluble de envejecimiento C. elegans sometidos a ARNi para análisis por espectrometría de masas y Western blotting. Mostramos que mejorar proteostasis reduciendo grandemente IIS previene la agregación de proteínas dependientes de la edad. Por selección de proteínas específicas propensas a la agregación que sobreexpresan en C. elegans, es posible disecar más los mecanismos de modulación de agregación de la proteína inherente...

Agregación y mal plegamiento de proteínas son reconocidas como una seña de identidad de varias enfermedades neurodegenerativas tales como AD, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la demencia frontotemporal (FTD) y muchos otros. Por ejemplo, asambleas de α-sinucleína en fibrillas amiloides que se acumulan como los cuerpos de Lewy particularmente en el nigra del substantia de los pacientes con EP, mientras que en misfold de TDP-43 o FUS de pacientes ALS para formar agregados citoplasmáticos en degeneración de las neuronas motoras. En cada uno de estos trastornos neurodegenerativos, mecanismos de mantenimiento de la homeostasis de proteínas o proteostasis no evitar la acumulación de proteínas mal plegadas, por lo tanto conduce a la enfermedad.
Proteostasis es crucial para las funciones celulares y bajo condiciones normales estos mecanismos controlan firmemente la tasa de síntesis de proteínas, plegamiento y degradación. Varios estudios demuestran que con el envejecimiento, la capacidad de muchas células y órganos para mantener la homeostasis de proteínas poco a poco se ve comprometida y el deterioro fisiológico de las redes proteostasis con la edad es un factor agravante importante para enfermedades neurodegenerativas (revisadas en las referencias1,2,3). El hecho de que el control de calidad de la proteína y la respuesta celular al estrés proteínas desplegadas se comprometen con la edad sugiere que el mal plegamiento de proteínas y agregación podrían ser una general consecuencia del envejecimiento. De hecho, nosotros y otros hemos demostrado que la agregación de la proteína no se limita a la enfermedad y en cambio parte del proteoma se convierte en altamente insoluble en detergente en animales envejecidos4,5,6,7 ,8,9,10. Análisis computacional e in vivo revelaron que estos agregados relacionados con la edad fisiológicos se asemejan a agregados de la enfermedad en varios aspectos5. El descubrimiento de la agregación de proteína endógena, dependiente de la edad nos da la oportunidad de diseccionar los mecanismos moleculares y celulares que regulan la agregación de proteínas, sin utilizar ectopically expresadas proteínas humanas asociadas a la enfermedad. En la actualidad, solamente poca información existe sobre la regulación de la insolubilidad de la proteína generalizada y sobre los efectos de esta disregulación en la salud del organismo.
El nematodo C. elegans es uno de los organismos modelo más extensamente estudiados en la investigación del envejecimiento ya que estos animales tienen una vida útil relativamente corta y muestran muchas características de envejecimiento característico observados en organismos superiores. Los efectos del envejecimiento en la insolubilidad de la proteína han sido estudiados en C. elegans por fraccionamiento bioquímico secuencial basado en la solubilidad diferencial, que es ampliamente utilizado para extraer áridos de la enfermedad en el campo de la investigación neurodegeneración11 . Por espectrometría de masa cuantitativa, varias cientos proteínas fueron demostradas para ser agregación-propensa en C. elegans en la ausencia de enfermedad5. Aquí describimos en detalle el protocolo para cultivar grandes cantidades de gusanos en cultivo líquido y la extracción secuencial para aislar proteínas agregadas para la cuantificación por espectrometría de masas y el análisis por Western blot. Porque las proteínas mal plegadas y propensas a la agregación se acumulan en mayores cambios de gónadas y máscaras de C. elegans en otros tejidos somáticos5,12,13, utilizamos un mutante de la gónada menos centrarse el análisis de proteínas insolubilidad en los tejidos no reproductivos. El método permite el análisis de los agregados altamente insoluble, grandes que son insolubles en 0,5% SDS y sedimentados por la relativamente baja velocidad centrífuga. Por otra parte, un protocolo de extracción menos riguroso para recoger también agregados más pequeños y más solubles ha sido publicado en otra parte10. Además, se describe el método utilizado para evaluar la agregación en vivo en C. elegans.
En general, estos métodos en combinación con el ARN de interferencia (ARNi) pueden evaluar la función de un gen de interés en la modulación de agregación de la proteína depende de la edad. Para ello se describe el análisis de extractos de gusanos jóvenes y mayores con y sin precipitación de una proteína específica de interés utilizando RNAi. Estos métodos deben ser una herramienta poderosa para determinar que los componentes de la red proteostasis regulan insolubilidad de la proteína. Varias intervenciones tales como reducción la insulina/insulina-like growth factor (IGF) 1 señalización (IIS) se ha demostrado que retrasar dramáticamente C. elegans envejecimiento14. Vías de longevidad a menudo inducen mecanismos de control de calidad de la proteína y así estas vías podrían ser activamente influir en la tasa de agregación de la proteína. Por ejemplo, nos demuestran agregación reducida proteína inherente en animales de larga vida sobre la inhibición de la vía IIS7.

<table><tbody><tr><td>Matraz de cultivo de Fernbach&nbsp;</td><td>Corning</td><td>4425-2XL</td><td>Pyrex, Capacidad 2.800 ml, con 3 muescas deflectoras</td></tr><tr><td>Tapón de rosca de membrana&nbsp;</td><td>Schott</td><td>1088655</td><td>GL45</td></tr><tr><td>Mezclador nutante</td><td>VWR</td><td>444-0148</td><td></td></tr><tr><td>Embudo separador</td><td>Nalgene</td><td>4300-1000</td><td>Capacidad 1.000 ml</td></tr><tr><td>Jeringa de 1 ml&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Aguja gris, 27 G x &frac12; ", 0.4 mm x 13 mm</td><td>BD Microlance 3</td><td>300635</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de membrana 0.025 &micro; M</td><td>Millipore</td><td>VSWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Tira de pH</td><td>Machery-Nagel</td><td>92110</td><td>pH-Fix 0-14</td></tr><tr><td>Cóctel Inhibidor de la Proteasa Roche</td><td></td><td>4693132001</td><td>Mini Comprimidos Completos sin EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>Octoxinol-9&nbsp;</td><td>Aplicativo</td><td>A1388</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>4-Morfolineetanosulfónico ácido (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1317</td><td></td></tr><tr><td>Nonilfenilpolietilenglicol</td><td>Applichem</td><td>A1694</td><td>Nonidet P40 (NP40)</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Roche</td><td>04716728001</td><td>solución recombinante, sin RNasaA</td></tr><tr><td></td><td>Promega</td><td>A7973</td><td>Tinción</td></tr> total <tr><td>de transferencia de proteínas</td><td>Thermofisher</td><td>S11791</td><td>Sypro Ruby tinción</td></tr> de transferencia de proteínas <tr><td>Tinción total de gel de proteínas</td><td>Thermofisher</td><td>S12001</td><td>Sypro Ruby tinción de gel de proteínas</td></tr><tr><td>TCEP (clorhidrato de tris (2-carboxietil)</td><td>Serva</td><td>36970</td><td></td></tr><tr><td>Yodoacetamida</td><td>Serva</td><td>26710</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Grado de secuenciación Tripsina modificada</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Marcadores isobáricos para cuantificación relativa y absoluta</td><td>Reactivos Sciex</td><td>4352135</td><td>iTRAQ</td></tr><tr><td>Kit Centrífuga Avanti J-26XP</td><td>Ultracentrífuga Beckmann Coulter</td><td>393126</td><td></td></tr><tr><td>Optima Max-XP</td><td>Centrífuga 393315</td><td></td><td></td>Beckmann Coulter</tr><tr><td>5424R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5404000413 5702</td><td></td><td>Centrífuga 5702000329</td><td></td>Eppendorf</tr><tr><td>Megafuge 40R</td><td>Concentrador</td> de <td>75004518</td><td></td>Thermo Scientific</tr><tr><td>Plus</td><td>Evaporador centrífugo</td><td>Eppendorf</td><td>5305000304</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico fluorescente M165 FC&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>con objetivo Planapo 2.0x</td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td> Microscopio de alto aumento <td>Leica S6E</td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td>con objetivo PlanAPOCHROMAT 20x y Zeiss Axio Cam MRm</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image software de análisis</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Análisis de datos de espectrometría de masas</td><td>Protein Prospector</td><td></td><td>http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm</td></tr><tr><td><fuerte>Cepa de E.coli</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>bacterias ARNi</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L4440</td><td>Julie Ahringer Biblioteca</td><td></td><td></td> de ARNi</tr><tr><td>C. elegans mutantes</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CF2253</td><td>CGC, nombre de la cepa: EJ1158&nbsp;</td><td></td><td>Genotipo: gon-2(q388)</td></tr><tr><td>C. elegans transgénicos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DCD214</td><td>Laboratorio de Della David en DZNE T&uuml; bingen</td><td></td><td>Genotipo: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]</td></tr><tr><td>DCD215</td><td>Della David's lab at DZNE T&uuml; bingen</td><td></td><td>Genotipo: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]</td></tr></tbody></table>

métodos de estudio cambios de agregación inherente de proteína con la edad en caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

En las últimas décadas, la prevalencia de trastornos neurodegenerativos, como la enfermedad de Alzheimer (EA) y enfermedad de Parkinson (EP), ha crecido. Estos trastornos asociados con la edad se caracterizan por la aparición de agregados de proteínas de estructura fibrilar en los cerebros de estos pacientes. Exactamente por qué proteínas solubles normalmente se someten a un proceso de agregación sigue siendo mal entendido. El descubrimiento que la agregación de la proteína no se limita a procesos de la enfermedad y en su lugar parte del proceso normal de envejecimiento permite el estudio de los mecanismos moleculares y celulares que regulan la agregación de proteínas, sin utilizar ectopically expresado humana proteínas asociadas a la enfermedad. Aquí se describen metodologías para examinar la agregación de proteínas inherentes en elegans de Caenorhabditis a través de enfoques complementarios. En primer lugar, examinamos cómo cultivar grandes cantidades de edad-que sincronizados C. elegans para la obtención de animales y presentamos los procedimientos bioquímicos para aislar altamente insoluble en grandes agregados. En combinación con una caída genética dirigida, es posible diseccionar el papel de un gen de interés en la promoción o prevención de la agregación de proteínas dependientes de la edad usando ya sea un análisis exhaustivo con espectrometría de masas cuantitativo o una Análisis basado en el candidato con los anticuerpos. Estos resultados son luego confirmados por análisis en vivo con animales transgénicos expresando con etiquetas fluorescentes propensas a la agregación de proteínas. Estos métodos deberían ayudar a aclarar por qué ciertas proteínas son propensos a agregado con la edad y, en definitiva, cómo mantener estas proteínas completamente funcional.

Utilizamos los métodos aquí presentados para evaluar cómo longevos animales con menor IIS modulan la agregación de proteínas dependientes de la edad. Por Western blot (vea el paso 2.2, rápida extracción de la proteína insoluble para el análisis de Western blot), analizamos el total y el contenido de proteína insoluble de jóvenes (día 3 de la edad adulta) y de gusanos (día 18 de la edad adulta) control de RNAi y de ARNi a la insulina / Receptor de IGF-1-como daf-2. Observamos que ...

El método presentado aquí pretende explorar la agregación de proteínas durante el envejecimiento normal en el organismo modelo Caenorhabditis elegans. El protocolo representa una poderosa herramienta para el estudio de los agregados grandes altamente insolubles que se forman con la edad y determinar cómo cambios en proteostasis impactan de agregación de la proteína.

Métodos de estudio cambios de agregación inherente de proteína con la edad en Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

El objetivo general de este experimento es detectar cambios en la insolubilidad de proteínas con la edad en C. elegans y evaluar cómo la eliminación de genes dirigidos influye en este marcador de envejecimiento. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del envejecimiento y la proteostasis, como por qué los organismos no logran mantener un proteoma saludable con la edad. La principal ventaja de esta técnica es la posibilidad de estudiar la agregación de proteínas durante el envejecimiento normal en ausencia de procesos patológicos.Aunque este método puede proporcionar información sobre la agregación de proteínas en C. elegans, también se puede adaptar a otros organismos modelo, por ejemplo, para estudiar la insolubilidad de proteínas relacionada con la edad en ratones. Para comenzar el tratamiento, agregue 207,45 mililitros de medio basal S con reactivos adicionales como se describe en el protocolo de texto adjunto a un matraz de cultivo de Fernbach de 2,800 mililitros. Añadir una concentración final de 50 microgramos por mililitro de carbenicilina y un milimolar de IPTG y cerrar el matraz con un tapón de rosca de membrana.Saque los L1 de la incubadora a 25 g

methods-to-study-changes-inherent-protein-aggregation-with-age

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra un ensayo basado en imágenes in vivo para determinar la disminución de la proteostasis debido al envejecimiento. El ensayo utiliza Caenorhabditis elegans que expresa la proteína de fusión de poliglutamina YFP en los músculos de la pared corporal para medir la agregación de poliglutamina asociada a la edad y la inducción de proteotoxicidad, lo que conduce a la parálisis.

Ensayo de parálisis fluorescente basado en reporteros: una técnica para evaluar la formación progresiva asociada a la edad de poliglutamina fluorescente reportera y la parálisis asociada en Caenorhabditis elegans

Para estudiar la relación entre la homeostasis de las proteínas, el estrés y el envejecimiento, monitoreamos los cambios en el plegamiento de las proteínas siguiendo la disfunción de las proteínas, la localización de las proteínas en la célula y la estabilidad de las proteínas a nivel de organismo, celular y proteína, utilizando el metazoo genéticamente tratable Caenorhabditis elegans como sistema modelo.

Uso de Caenorhabditis elegans como sistema modelo para estudiar la homeostasis de proteínas en un organismo multicelular

La fluorescencia de por vida de los monitores de imágenes, cuantifica y distingue las tendencias de agregación de las proteínas en los modelos de enfermedad de C. elegans, vivos, envejecidos y estresados.

Caracterización de estructuras amiloideas en el envejecimiento C. Elegans usando imágenes de por vida de fluorescencia

El deterioro proteostático es un sello distintivo del envejecimiento, que facilita la aparición de enfermedades neurodegenerativas. Esbozamos un protocolo para medir cuantificablemente la proteostasis en dos tejidos diferentes de Caenorhabditis elegans a través de la expresión heteróloga de repeticiones de poliglutamina fusionadas a un reportero fluorescente. Este modelo permite un rápido análisis genético in vivo de la proteostasis.

Cuantificación de la disminución proteostática específica del tejido en Caenorhabditis elegans

Aquí, introducimos y describimos metodologías ampliamente accesibles que utilizan algunos modelos versátiles de nematodos, incluyendo necrosis inducida por canales de iones hiperactivados y neurotoxicidad inducida por agregados de proteínas, para monitorear y diseccionar los fundamentos celulares y moleculares de las enfermedades neurodegenerativas asociadas a la edad.

Modelar enfermedades neurodegenerativas asociadas a la edad en Caenorhabditis elegans

El siguiente protocolo describe el desarrollo y la optimización de un flujo de trabajo de alto rendimiento para el cultivo de gusanos, imágenes de fluorescencia y procesamiento automatizado de imágenes para cuantificar los agregados de poliglutamina como una evaluación de los cambios en la proteostasis.

Automatización de la cuantificación agregada en Caenorhabditis elegans

Aquí, se presenta un método para el análisis de la cinética de agregación de proteínas en el nematodo Caenorhabditis elegans. Los animales de una población sincronizada por edad se visualizan en diferentes puntos de tiempo, seguidos de un recuento de inclusión semiautomatizado en CellProfiler y se ajustan a un modelo matemático en AmyloFit.

Monitoreo de la cinética de agregación de proteínas in vivo mediante el conteo automatizado de inclusión en Caenorhabditis elegans

Aquí se presenta un protocolo para la realización de placa sólida basada en la restricción dietética...

Placa Sólida basado en la restricción dietética Caenorhabditis elegans</em

En este artículo se describe una técnica para la visualización de los primeros eventos de la embriogénesis en el...

Time-lapse microscopía de embriogénesis temprana en Caenorhabditis elegans

La facilidad de mantenimiento y propagación del...

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos de sincronización y de observación

Aprende a detectar cambios en la agregación de proteínas durante el envejecimiento en Caenorhabditis elegus. Este método permite evaluar el efecto del silenciamiento génico en la proteostasis y ofrece un marco robusto para investigar los mecanismos del envejecimiento celular.

Métodos de estudio cambios de agregación inherente de proteína con la edad en Caenorhabditis elegans

Explorar más videos