Métodos de estudio cambios de agregación inherente de proteína con la edad en Caenorhabditis elegans

El objetivo general de este experimento es detectar cambios en la insolubilidad de proteínas con la edad en C. elegans y evaluar cómo la eliminación de genes dirigidos influye en este marcador de envejecimiento. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del envejecimiento y la proteostasis, como por qué los organismos no logran mantener un proteoma saludable con la edad. La principal ventaja de esta técnica es la posibilidad de estudiar la agregación de proteínas durante el envejecimiento normal en ausencia de procesos patológicos.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la agregación de proteínas en C. elegans, también se puede adaptar a otros organismos modelo, por ejemplo, para estudiar la insolubilidad de proteínas relacionada con la edad en ratones. Para comenzar el tratamiento, agregue 207,45 mililitros de medio basal S con reactivos adicionales como se describe en el protocolo de texto adjunto a un matraz de cultivo de Fernbach de 2,800 mililitros. Añadir una concentración final de 50 microgramos por mililitro de carbenicilina y un milimolar de IPTG y cerrar el matraz con un tapón de rosca de membrana.

Saque los L1 de la incubadora a 25 grados centígrados y transfiéralos a tubos de 15 mililitros. Centrifugar los L1 a 1.900 veces g durante tres minutos. Después de girar, retire el sobrenadante.

Bajo un microscopio, cuente los L1 por dos microlitros y promedie los números obtenidos de al menos nueve gotas. A continuación, agregue 50.000 gusanos para la colección de gusanos jóvenes y 100.000 gusanos para la colección de gusanos envejecidos en cuatro matraces de cultivo de Fernbach preparados en el paso anterior. A continuación, añada las bacterias de ARNi de control y las bacterias de ARNi para el gen de interés proporcionalmente al número de gusanos.

Después de agregar bacterias, complete el cultivo de lombrices con S Basal para llevar el volumen total a 300 mililitros. Incubar el cultivo de lombrices a 25 grados centígrados en una incubadora agitadora a 150 rpm hasta la recolección. Recoja gusanos jóvenes al segundo o tercer día para medir los niveles basales de solubilidad de proteínas.

Vierta las lombrices de un matraz en un embudo de separación y deje que las lombrices se sedimenten durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de que las lombrices se sedimenten, abra la llave de parada y gotee las lombrices en un tubo de 50 mililitros. A continuación, divida el gránulo de gusano en dos tubos de 15 mililitros.

Llene los tubos hasta 15 mililitros con M9 y centrifugue los gusanos. Para lavar las lombrices, retire el sobrenadante y llene el tubo hasta 15 mililitros con M9. Repita la centrifugación. Una vez que se complete el lavado, transfiera las lombrices a dos tubos de 50 mililitros y use M9 helado para llenar el volumen total a 20 mililitros.

Para eliminar las bacterias y los gusanos muertos, agregue los dos gránulos de gusano diluidos de 20 mililitros a dos tubos de 50 mililitros llenos de 20 mililitros de sacarosa helada al 60%. Centrifugar rápidamente los tubos. Con una pipeta de 25 mililitros, retire con cuidado hasta 15 mililitros de la capa superior de gusanos.

Coloque la capa superior de gusano directamente en 37 mililitros de M9 más octoxynol-9 preparado en hielo. A continuación, centrifugar los tubos a 2.700 veces g durante tres minutos a cuatro grados centígrados, aceleración nueve y deceleración siete. Después de desechar el sobrenadante, transfiera el pellet a cuatro tubos de 15 mililitros y lávelos dos veces con M9 helado más octoxinol-9.

Luego, centrifuga los tubos. Retire el sobrenadante y llene los tubos hasta la marca de 15 mililitros con M9 más octoxynol-9 helado. Lave los gusanos con M9 helado y combine los cuatro tubos en dos tubos.

Llene los tubos hasta 15 mililitros y centrifuga. Retire el sobrenadante, llene los dos tubos con M9 a temperatura ambiente hasta un volumen total de cuatro mililitros y gírelos en una batidora de nutas a 25 grados centígrados durante 40 minutos. Después de nutar, lave los gusanos dos veces con M9 helado más octoxynol-9.

Luego, lávelos dos veces con M9 y transfiera los gusanos a un tubo. Lave las lombrices en el tampón de reensamblaje o de extracción con alta sal RAB sin inhibidores antes de la recolección. Retire el sobrenadante hasta que no quede líquido en la parte superior de la bolita de gusano.

Luego, estime el volumen del gránulo de gusano y agregue un volumen idéntico de RAB con inhibidores. Prepare un tubo de 50 mililitros medio lleno de nitrógeno líquido sobre hielo seco y, con una pipeta Pasteur, extraiga las lombrices y gotee lentamente en el tubo. Deje que el nitrógeno líquido se evapore y almacene los gusanos congelados a menos 80 grados centígrados hasta su posterior procesamiento.

Enfriar el mortero con nitrógeno líquido y realizar la desturación animal en hielo seco. Transfiera los gusanos congelados al mortero preenfriado y muélalos durante 2,5 minutos. Agregue 100 mililitros de nitrógeno líquido al polvo y muela durante otros 2,5 minutos.

Use un microscopio para verificar que los cuerpos de los gusanos estén rotos en pedazos pequeños. Luego, transfiera el polvo a tubos de dos mililitros y guárdelos a menos 80 grados centígrados. En hielo seco, pese dos veces 350 miligramos de lombrices molidas por punto de tiempo y por bacteria ARNi en tubos de dos mililitros.

Para eliminar las proteínas solubles con alto contenido de sal, agregue dos volúmenes por peso de RAB ya preparado con inhibidores, un PMSF milimolar, 200 unidades por mililitro de DNasa I y 100 microgramos por mililitro de RNasa A a cada tubo y solubilice el polvo en hielo. Extrae la suspensión en una jeringa de un mililitro 15 veces y revuélvela en hielo durante 10 minutos. Centrifugar a 18.400 veces g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados.

Atraviesa la capa de grasa y recoge el sobrenadante que contiene proteínas solubles con alto contenido de sal en un tubo de dos mililitros por condición. Retira la grasa y deséchala. Alícuota de proteínas solubles con alto contenido de sal para congelar a menos 80 grados centígrados.

Para desechar los lípidos, solubilizar el pellet con 700 microlitros de RAB con inhibidores que contengan un molar de sacarosa sin DNasa I y RNasa A. Extraer la suspensión en una jeringa 10 veces e incubarla en hielo durante cinco minutos. Asegúrese de eliminar todo el sobrenadante y los lípidos y desecharlos. Para eliminar las proteínas solubles en SDS, solubilice el pellet con 700 microlitros de tampón RIPA.

Enrolle la suspensión en una jeringa 10 veces y cogélela durante 10 minutos en hielo. Centrifugar a 18.400 g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Recoja el sobrenadante que contiene proteínas solubles en SDS y alícuota para congelar a menos 80 grados Celsius.

Agrupe dos muestras de cada condición juntas después de solubilizar cada pellet con 500 microlitros de tampón RIPA y extraiga la suspensión en una jeringa 10 veces. Tenga cuidado de eliminar todo el sobrenadante y deséchelo. Solubilizar el pellet final que contiene proteínas altamente insolubles con 400 microlitros de ácido fórmico al 70% y extraer la suspensión en una jeringa 20 veces.

Incubar la suspensión durante 20 minutos en hielo. Centrifugar la suspensión en tubos de ultracentrífuga para eliminar los restos de cutícula de gusano. Recoja el sobrenadante que contiene proteínas altamente insolubles y congélelo a menos 80 grados centígrados.

La tinción de proteínas totales del contenido de proteínas insolubles de gusanos jóvenes y envejecidos reveló un fuerte aumento relacionado con la edad en los niveles de proteínas altamente insolubles en los animales de control y no en los animales longevos. La tinción de anticuerpos de PAB-1, una proteína de unión al ARN con un dominio similar a un prión predicho, confirmó los datos de espectrometría de masas de que los animales longevos mantuvieron el PAB-1 soluble con la edad. Se realizó un análisis in vivo de animales transgénicos que expresan tagRFP PAB-1 en los músculos faríngeos.

En animales jóvenes, el tagRFP PAB-1 se localizó principalmente de forma difusa en toda la faringe. Con la edad, una acumulación progresiva en puntos brillantes que comienza en el bulbo faríngeo posterior. Durante la crianza, también observamos agregación en el bulbo faríngeo anterior en un número creciente de animales.

La cuantificación de los diferentes niveles de agregación de tagRFP PAB-1 con la edad en el tipo salvaje y el fondo del mutante daf-2 revela un fuerte retraso en la agregación de tagRFP PAB-1 con la edad en animales longevos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo recolectar una gran cantidad de gusanos para la extracción de proteínas y cómo aislar agregados grandes altamente insolubles para su posterior análisis mediante espectrometría de masas o página SDS.