Name: Automatización de la cuantificación agregada en Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Aprende a automatizar la cuantificación de agregados de poliglutamina en Caenorhabditis elegans mediante imágenes de alta producción y CellProfiler. Este método elimina sesgos y aumenta la reproducibilidad en estudios de proteostasis.

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Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (1RO3AG069056-01) y la Sociedad de Enfermedades Infecciosas de América financiando a DMC. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. Agradecemos a los miembros del Laboratorio Czyz por revisar el manuscrito. Las figuras de dibujos animados se generaron utilizando la licencia pagada de BioRender.

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Los autores han declarado que no existen conflictos de intereses.

El protocolo descrito describe los procedimientos para el cultivo, la obtención de imágenes y el procesamiento de imágenes de C. elegans que incorpora CellProfiler, un software de análisis de imágenes de código abierto. Los resultados representativos demuestran reproducibilidad, reducción del sesgo y escalabilidad. Este procedimiento estandarizado mejorará las estrategias de detección empleadas con grandes bibliotecas bacterianas, genómicas o de medicamentos. Si bien existen otros métodos automatizados de detección de objetos de C. elegans , la técnica descrita ofrece una canalización estandarizada y de mayor rendimiento que integra el cultivo, la adquisición de imágenes y el análisis.
Varias variaciones del cultivo de gusanos tuvieron que ser probadas para optimizar el protocolo descrito en este documento. Inicialmente, los gusanos se transfirieron a las bacterias de muestra inmediatamente después de la sincronización de la edad (etapa L1). Sin embargo, tal enfoque resultó en una población de gusanos con tamaños variables, incluso entre gusanos dentro del mismo pozo. C. elegans es conocida por evitar patógenos19, lo que podría haber contribuido a la variabilidad observada en el tamaño y, en última instancia, afectar la detección de gusanos de imágenes aguas abajo, en particular. Para eliminar tal variabilidad, toda el área de NGM en cada pozo se cubrió con bacterias de prueba. Además, los gusanos fueron alimentados con E. coli OP50 y se les permitió desarrollarse completamente en adultos jóvenes durante 48 h a 25 ° C. Permitir que los gusanos alcancen la edad adulta en E. coli OP50 antes de transferirlos a las bacterias de prueba resultó en un tamaño corporal más consistente. Además, el hacinamiento y el rápido agotamiento de los alimentos por la progenie se eliminaron complementando el agar NGM con FUDR. La implementación de FUDR eliminó la progenie y mejoró la identificación automatizada de gusanos, que se vio oscurecida por la mezcla de la progenie con la población parental. Sin embargo, es importante ser cauteloso y utilizar los controles apropiados al utilizar FUDR, ya que se sabe que el compuesto afecta la proteostasis y la vida útil de C. elegans 20,21. En las condiciones descritas en este protocolo, el FUDR no afectó la agregación intestinal de polyQ (Figura suplementaria 5); por lo tanto, su utilización fue adecuada y beneficiosa para el método descrito.
La congelación de muestras antes de la toma de imágenes resultó ser un paso crítico en el empleo exitoso de la tubería. Los recuentos agregados antes de la congelación fueron significativamente más altos que los recuentos manuales (Figura 3B). Mantener los gusanos a -20 °C durante 18-48 h antes de la toma de imágenes redujo la fluorescencia de fondo y, en última instancia, mejoró la detección de agregados (Figura 3A). Los efectos de la congelación en la detección de agregados solo se han investigado para polyQ y no deben generalizarse a otros modelos sin una mayor investigación de dichos efectos.
A pesar de que todas las condiciones se mantuvieron iguales, se observó que el número promedio de agregados por gusano podría variar entre diferentes tiradas, mientras que la relación entre el número de agregados en animales colonizados con OP50 versus MPAO1 se mantuvo consistente (Figura 6, Figura suplementaria 2, Figura suplementaria 5). Por lo tanto, es esencial incluir siempre el control E. coli OP50, o cualquier control de referencia adicional adecuado, en cada ejecución. Tal variabilidad en los recuentos agregados entre experimentos podría estar influenciada por las condiciones ambientales (temperatura, humedad)22,23 o los antecedentes genéticos8. De hecho, se observó que después de un cultivo prolongado, la fluorescencia intestinal disminuyó drásticamente o se perdió por completo, lo que requirió la descongelación de una nueva cepa de stock congelado. La disminución observada en la fluorescencia podría ser el resultado de cambios genéticos que suprimen los transgenes tóxicos, como los que expresan poliQ. No obstante, la excepcional reproducibilidad de los resultados observados entre diferentes experimentadores (Figura suplementaria 2), entre réplicas biológicas (Figura 5) y dentro de la misma muestra (Figura suplementaria 3) enfatiza la fuerza de este enfoque.
Numerosos informes han empleado polyQ intestinal para estudiar la proteostasis 9,11,12,13,24,25. Sin embargo, no se puede hacer una comparación directa entre los resultados debido a la variabilidad entre los enfoques experimentales y los métodos de lectura. No obstante, algunos resultados de datos publicados anteriormente son recapitulados por la cuantificación automatizada descrita en este documento, incluida la inducción bacteriana de la agregación 9,13 y un número comparable de agregados11. Colectivamente, la tubería descrita ofrece una herramienta valiosa para estudiar la proteostasis.
El método descrito en este documento tiene algunos desafíos inherentes. Por ejemplo, requiere tiempo suficiente para dominar todos los componentes de este protocolo, lo que es especialmente cierto para la sección 8 del protocolo, que requiere familiaridad con el ensayo para determinar si las imágenes adquiridas son apropiadas para el análisis de tuberías. Las desviaciones de la configuración de adquisición de imágenes utilizada en este protocolo son posibles; sin embargo, es probable que se requiera la modificación de la configuración y el conjunto de entrenamiento de gusanos. Esta tubería puede distinguir agregados de varios tamaños y aquellos que se tocan, lo que limita la "mezcla" de agregados y, en última instancia, aumenta la sensibilidad de detección. Sin embargo, pueden surgir problemas al intentar identificar agregados grandes que exceden el rango de tamaño aceptado, ya que la expansión del umbral de tamaño superior puede provocar errores causados por una identificación deficiente, como la incapacidad de diferenciar los agregados que se tocan. Se debe encontrar un equilibrio entre precisión, tamaño e intensidad antes del análisis de imágenes. La eficiencia de la identificación de agregados podría mejorarse aún más mediante la incorporación del aprendizaje automático para crear una red neuronal capaz de mejorar la detección de agregados. Tales mejoras se están explorando actualmente y ayudarán en gran medida a abordar los problemas actuales, como la detección de agregados que se encuentran en diferentes planos focales o que tienen formas anormales.
Una debilidad notable del método descrito es la variabilidad en los recuentos de agregados automatizados, ya que no siempre se recapitulan mediante recuentos manuales en gusanos alimentados con diferentes cepas bacterianas. Por ejemplo, según los recuentos automatizados, los gusanos alimentados con P. aeruginosa mutante 53 (M53) tenían significativamente menos agregados en comparación con la cepa de tipo salvaje (MPAO1) (Figura 7); sin embargo, la confirmación del acierto no mostró diferencias significativas (Figura suplementaria 4). En general, las pruebas de detección de drogas de alto rendimiento tienen una alta tasa de detección de golpes falsos positivos, y el método descrito no es una excepción26. Por lo tanto, es una parte crítica del protocolo para confirmar todos los posibles éxitos.
Si bien este protocolo se optimizó para adaptarse a una estrategia de detección para identificar las bacterias que afectan la proteostasis del huésped, cada paso se puede modificar aún más para probar el efecto de las bibliotecas de ARNi genómico, moléculas pequeñas u otras afecciones. Se pueden realizar modificaciones adicionales en cada paso para adaptarse a los requisitos de una estrategia de detección específica. Además, esta técnica proporciona un nivel de flexibilidad que permite la optimización de cada paso para adaptarse a un modelo específico. Por ejemplo, este enfoque puede extenderse a la agregación poliQ en otros tejidos o a la extracción de otras características detectadas en imágenes, como el monitoreo de la expresión génica utilizando reporteros fluorescentes inducibles (por ejemplo, genes de choque térmico), la evaluación de la localización subcelular de proteínas (por ejemplo, la localización nuclear de DAF-16), el estudio de la agregación en otros modelos de enfermedad (Aβ1-42, α-sinucleína, TDP-43, etc.) o la evaluación de fenotipos fisiológicos, como el tamaño del gusano.

Las enfermedades conformacionales de proteínas neurodegenerativas dependientes de la edad (PCD), como las enfermedades de Alzheimer, Parkinson y Huntington, o la esclerosis lateral amiotrófica, se caracterizan por un mal plegamiento de proteínas que conduce a la agregación, la muerte celular y la degeneración tisular1. Si bien el plegamiento incorrecto de proteínas se reconoce como el culpable, la etiología de estas enfermedades no está clara. Como tal, el desarrollo de terapias efectivas se ha visto obstaculizado por la falta de conocimiento sobre los factores y condiciones que contribuyen a la aparición y progresión de la enfermedad. Estudios recientes sugieren que los cambios en el microbioma influyen en el inicio, la progresión y la gravedad de las PCD 2,3,4. Sin embargo, la complejidad del microbioma humano, o incluso murino, dificulta la realización de estudios que revelen la influencia exacta de los microbios en su huésped. Por lo tanto, los organismos más simples, como Caenorhabditis elegans, se utilizan a menudo como una herramientade descubrimiento 5,6,7,8. Estudios recientes han empleado C. elegans para investigar el efecto de las bacterias sobre la proteostasis del huésped y la patogénesis de la enfermedad 9,10. La colonización bacteriana, la hormesis y los cambios genómicos se encuentran entre las condiciones ejemplares que afectan la agregación de los tractos de poliglutamina (polyQ) 9,11,12. Además, estos grupos de proteínas mal plegados exhiben una acumulación dependiente de la longitud y la edad de polyQ dentro del huésped y se asocian con una motilidad deteriorada 9,13. El enfoque relativamente simple de cuantificar los puntos marcados fluorescentemente puede generar datos importantes sobre condiciones, factores o medicamentos que afectan el plegamiento y la agregación de proteínas.
Aunque la cuantificación de la puntería fluorescente ha demostrado ser un procedimiento confiable y relativamente simple, el desafío sigue siendo desarrollar un protocolo que facilite la detección a gran escala de compuestos, bacterias o afecciones que afectan la agregación de proteínas. El concepto de procesamiento automatizado de imágenes de C. elegans y cuantificación de puntos no es del todo novedoso, ya que se han desarrollado una serie de herramientas prácticas de apoyo14,15. Sin embargo, la integración del cultivo, la adquisición de imágenes y una canalización de procesamiento son esenciales para eliminar la variabilidad en los resultados y permitir pantallas de mayor rendimiento.
Como tal, la intención de este manuscrito es estandarizar el procedimiento utilizado para cuantificar la agregación de polyQ en C. elegans como un proxy para detectar cambios en la proteostasis. Esta tarea se logró mediante el empleo de CellProfiler, un software de análisis de imágenes de código abierto16 capaz de automatizar la identificación de gusanos y agregados, y está integrado en un protocolo más amplio para cultivar gusanos, adquirir imágenes y procesar datos.

<table><tbody><tr><td>Microtubos de 1,7 mL Olympus</td><td>Plastics</td><td>Cat#24-282 Tubos de</td><td>microcentrífuga</td></tr><tr><td>10 mL Pipetas serológicas</td><td>GenClone</td><td>Cat#12-104</td><td>Pipetas de plástico</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 mL, con bastidores</td><td>Olympus Plastics</td><td>Cat#28-101</td><td>Tubos cónicos</td></tr><tr><td>5-Fluoro-2&prime;-deoxyuridine</td><td>Fisher Scientific</td><td>D2235100MG</td><td>FUDR</td></tr><tr><td>Accu-jet Pro Pipeta Controller</td><td>Genesee Scientific</td><td>91-600RB Pistola de</td><td>pipetas</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#BP1423-2</td><td>Agar granulado</td></tr><tr><td>BioRender BioRender</td><td></td><td></td><td>Generador de figuras gráficas</td></tr><tr><td>Lejía (Regular)</td><td>Clorox</td><td>Bar# 044600324111, Lejía sin salpicaduras 4,5</td><td>% de hipoclorito</td></tr> <tr><td>de sodioC. elegans: AM140: rmIs132 [unc-54p::q35::yfp]</td><td>Morimoto Lab (Northwestern University)</td><td>AM140, Q35::YFP</td><td>Muscle polyQ</td></tr><tr><td>C. elegans: AM738: rmIs297[vha-6p:: q44::yfp; rol-6(su1006)]</td><td>Morimoto Lab (Northwestern University)</td><td>AM738, Q44::YFP</td><td>Intestinal polyQ</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#C79-500</td><td>Cloruro de calcio dihidratado</td></tr><tr><td>CellProfiler Broad</td><td>Institute</td><td></td><td>Software de análisis de imágenes</td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Fisher</td><td>Scientific Cat#ICN10138201</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol Circulante Baño de agua</td><td>Cabezal Lauda</td><td>26LE</td><td>Lauda E 100</td></tr><tr><td>CoolLED pE300lite 365 montura dir STEREO</td><td>CoolLED</td><td>8114931</td><td>Control y emisor de luz fluorescente</td></tr><tr><td>16 mL Tubos de cultivo</td><td>Olympus Plastics</td><td>21-129 Tubos de</td><td>cultivo, 17 mm x 100 mm</td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td>E. coli cepa de control</td></tr><tr><td>Etanol, 200 pruebas</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Ocular 10x/23B, ajustable, 3d gen</td><td>Leica Microsystems</td><td>10450910</td><td>Juego de oculares</td></tr><tr><td>Juego de filtros ET GFP - MZ10F</td><td>Leica Microsystems</td><td>10450588</td><td>Cubo de filtro</td></tr><tr><td>GraphPad Prism v9.2.0</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td>Herramienta de análisis estadístico</td></tr><tr><td>Heratherm Incubadora IMP180</td><td>Thermo</td><td>51031562</td><td>Incubadora refrigerada</td></tr><tr><td>Innova 4000</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1192-0000</td><td>Incubadora agitadora</td></tr><tr><td>K5 Cámara</td><td>Leica Microsystems</td><td>11547112</td><td>Cámara de microscopio estereoscópico</td></tr><tr><td>KH2P04</td><td>Fisher Scientific Cat</td><td>#P285-3</td><td>Fosfato de potasio monobásico</td></tr><tr><td>LAS X Software de imagen</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Software de imagen para microscopio</td></tr><tr><td>Leica MZ10 F Portador óptico</td><td>Leica Microsystems</td><td>10450103</td><td>Microscopio estereoscópico</td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#0215522805</td><td>Clorhidrato de levamisol</td></tr><tr><td>Caldo Luria (Lennox)</td><td>Productos de Apex Bioresearch</td><td>Cat#11-125</td><td>LB</td></tr><tr><td>Placa de agitación magnética</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-100-49S</td><td>Placa de agitación</td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Alfa Aesar</td><td>A14491</td><td>Sulfato de magnesio heptahidratado</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Premiere</td><td>8205</td><td>Portaobjetos de microscopio esmerilados simples</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#S373-500</td><td>Fosfato de sodio dibásico heptahidratado</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#S671-500</td><td>Cloruro de sodio</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#S318-3</td><td>Pellets de hidróxido de sodio</td></tr><tr><td>Objetivo Acromático, f = 100 mm</td><td>Leica Microsystems</td><td>10411597</td><td>Lente</td></tr> <tr>de microscopio objetivo<td>Placas de Petri</td><td>Genesee Scientific</td><td>Cat#32-107G</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa Biblioteca de Mutantes</td><td>Manoil Lab (Universidad de Washington)</td><td></td><td>P. aeruginosa Biblioteca de mutantes</td></tr><tr><td>Placa de cultivo en suspensión de 24 pocillos, fondo plano</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-102</td><td>Se utiliza para el crecimiento de gusanos y la obtención de imágenes</td></tr><tr><td>Tubo trinocular 100% serie M Leica</td><td> Microsistemas</td><td>10450043</td><td></td></tr><tr><td>Tripticasa Peptona</td><td>ThermoFisher, Difco</td><td>Cat#211921</td><td></td></tr><tr><td>Rotor TX-400</td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat#75003181</td><td>Rotor de cubeta oscilante</td></tr><tr><td>Sistema de filtro accionado por vacío</td><td>GenClone</td><td>Cat#25-227</td><td>500 mL, MEMBRANA PES, .22 &micro; m</td></tr><tr><td>Objetivo de vídeo con montura C Leica</td><td>Microsystems</td><td>10447367</td><td>tubo adaptador de cámara de 0,63x</td></tr></tbody></table>

automatización de la cuantificación agregada en caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Un aumento en la prevalencia de enfermedades conformacionales de proteínas neurodegenerativas (PCD) ha fomentado un gran interés en este tema a lo largo de los años. Esta mayor atención ha requerido la diversificación y mejora de modelos animales capaces de reproducir fenotipos de enfermedades observados en humanos con PCD. Aunque los modelos murinos han demostrado ser invaluables, son caros y están asociados con métodos laboriosos y de bajo rendimiento. El uso del modelo de nematodo Caenorhabditis elegans para estudiar PCD se ha justificado por su relativa facilidad de mantenimiento, bajo costo y rápido tiempo de generación, que permiten aplicaciones de alto rendimiento. Además, la alta conservación entre los genomas de C. elegans y humanos hace de este modelo una herramienta de descubrimiento invaluable. Los nematodos que expresan tractos de poliglutamina (polyQ) específicos de tejido marcados fluorescentemente exhiben una agregación dependiente de la edad y la longitud de polyQ caracterizada por focos fluorescentes. Tales reporteros a menudo se emplean como proxies para monitorear los cambios en la proteostasis a través de los tejidos. La cuantificación manual de agregados requiere mucho tiempo, lo que limita el rendimiento experimental. Además, la cuantificación manual de focos puede introducir sesgos, ya que la identificación agregada puede ser altamente subjetiva. Aquí, se estandarizó un protocolo que consiste en el cultivo de gusanos, la adquisición de imágenes y el procesamiento de datos para admitir la cuantificación agregada de alto rendimiento utilizando C. elegans que expresan polyQ específico del intestino. Al implementar una canalización de procesamiento de imágenes basada en C. elegans utilizando CellProfiler, un software de análisis de imágenes, este método se ha optimizado para separar e identificar gusanos individuales y enumerar sus respectivos agregados. Aunque el concepto de automatización no es del todo único, la necesidad de estandarizar tales procedimientos para la reproducibilidad, la eliminación del sesgo del conteo manual y el aumento del rendimiento es alta. Se anticipa que estos métodos pueden simplificar drásticamente el proceso de detección de grandes bibliotecas bacterianas, genómicas o de medicamentos utilizando el modelo de C. elegans .

El siguiente protocolo describe el desarrollo y la optimización de un flujo de trabajo de alto rendimiento para el cultivo de gusanos, imágenes de fluorescencia y procesamiento automatizado de imágenes para cuantificar los agregados de poliglutamina como una evaluación de los cambios en la proteostasis.

Automatización de la cuantificación agregada en Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Se adoptó un enfoque simple para monitorear los cambios en la proteostasis mediante la evaluación de la agregación de poliglutamina y proporcionando un marco que se puede utilizar para aplicaciones de alto rendimiento. Puntuar un fenotipo como el número de agregados por I puede llegar a ser subjetivo. La automatización del conteo agregado nos permite eliminar dicho sesgo, aumentar el rendimiento y la reproducibilidad.Este método ayuda a identificar los genes bacterianos que contribuyen a la interrupción de la proteostasis del huésped. Comprender la contribución de los genes bacterianos individuales nos ayudará a comprender su implicación en la patogénesis de enfermedades como el Alzheimer, el Parkinson y el Huntington. Comience retirando las placas que contienen gusanos del congelador y dejándolos descongelar a temperatura ambiente.Luego limpie el exceso de condensación y retire la tapa antes de tomar imágenes. Utilice la configuración del microscopio con un tiempo de exposición de 500 milisegundos, un aumento de 40 X con un adaptador de cámara de 0,63 X y una intensidad de GFP establecida en el 100 % durante la captura de la imagen. Ahora ajuste los controles de luz transmitidos hasta que los gusanos aparezcan brillantemente iluminados en comparación con el fondo oscuro, evitando la sobreexposición.Altere las posiciones de los gusanos dentro del pozo para evitar la aglomeración excesiva mediante el uso de una punta de pipeta de 10 microlitros para empujar suavemente a los gusanos a la posición deseada. Establezca el canal en el filtro GFP para establecer un plano focal para ambas imágenes. Captura una imagen de campo brillante.Tome una imagen de fluorescencia correspondiente sin perturbar la placa ni cambiar el enfoque del microscopio. Ahora para evaluar las imágenes, primero descargue el CellProfiler. Abra el software y arrastre y suelte las imágenes de interés en el cuadro de imágenes.Haga clic en las imágenes de la lista de archivos para abrirlas. Seleccione la lupa para resaltar una región de interés y el icono de flecha para medir la longitud de los gusanos y agregados. Coloque el cursor sobre el objeto deseado para determinar su valor de intensidad, que se puede ver en la parte inferior de la pantalla.Para utilizar la canalización de análisis de imágenes de CellProfiler, asigne un nombre correcto a los pares de imágenes como se describe en el manuscrito de texto después de descargar CellProfiler del sitio web oficial. Descargue la canalización y cárguela en CellProfiler seleccionando archivo, importación y canalización desde el archivo. Seleccione el módulo de gusanos desenredados para abrir su configuración y cargar un conjunto de entrenamiento utilizado para identificar gusanos en el módulo de gusanos desenredados.A continuación, identifique el nombre de archivo del conjunto de entrenamiento. Seleccione el icono de cargar archivo y cargue el archivo complementario también. Cargue imágenes seleccionando el módulo de imágenes en la esquina superior izquierda.Y luego arrastre y suelte imágenes con el nombre correcto. Antes de analizar las imágenes, seleccione la carpeta de salida deseada que se utilizará para almacenar los resultados haciendo clic en el botón de configuración de salida ubicado cerca de la esquina inferior izquierda del programa. A continuación, seleccione el icono de carpeta a la derecha de la salida predeterminada para elegir la ubicación de salida deseada.Seleccione el icono de análisis de imágenes para comenzar el análisis de imágenes. Si el análisis tarda demasiado en completarse y está atascado procesando una sola imagen, cancele la ejecución e identifique la imagen sin procesar ordenando a través de la carpeta de salida y anotando qué nombre de imagen no se encuentra. Después de un análisis completo, el software organizará los resultados en una hoja de cálculo de Excel que contiene gusanos individuales en la columna N y el número respectivo de agregados en la columna K.Descargue el organizador de metadatos para organizar convenientemente los datos del archivo CSV de salida de CellProfiler.Para el sistema operativo Windows, localice el archivo descargado y extráigalo a la ubicación deseada. Busque y abra la carpeta extraída denominada gui_Windowsos_64x. E inicie la aplicación haciendo clic en el icono de la aplicación GUI.Es posible que se abra un mensaje solicitando permiso para ejecutarse. Seleccione más información y luego haga clic en ejecutar de todos modos. El organizador de metadatos ahora está listo para arrastrar y soltar archivos CSV de salida de CellProfiler.Para Mac OS, busque el archivo descargado y extraiga el archivo de la aplicación organizador de metadatos del archivo. Abra la carpeta extraída que se encuentra en las descargas. Haga clic derecho en la aplicación GUI y seleccione abrir.Aparecerá un mensaje pidiendo permiso para abrir debido a la falta de una licencia oficial. Seleccione abrir. Una vez que su aplicación de organizador de metadatos esté abierta en el sistema operativo respectivo, haga clic en cargar sus archivos aquí, o arrastre y suelte los archivos CSV de CellProfiler deseados.Haga clic en el botón organizar, que llevará al usuario a una nueva pantalla con un botón de descarga de archivos. Haga clic en el botón y seleccione la ubicación deseada para guardar el archivo de salida. El archivo de salida aparecerá como el nombre de archivo original con _organized extensión agregada al nombre de archivo.En presencia de FUDR, los gusanos que fueron alimentados con varias bacterias tenían un tamaño corporal más consistente que permitía una detección de gusanos más uniforme y precisa, resolviendo así el problema del hacinamiento. La congelación de los gusanos mejoró la detección de agregados polyQ al eliminar la fluorescencia de fondo, así como la precisión del conteo automatizado comparable al conteo manual. Se utilizó iluminación de campo brillante invertido para detectar todo el canal C.elegans y GFP para obtener imágenes de agregados YFP poliQ.La detección de gusanos, el desenredo y la cuantificación de agregados para cada gusano se realizaron mediante la aplicación de una canalización de procesamiento de imágenes CellProfiler optimizada, que permite obtener el número de agregados por gusano individual. La diferencia entre la eficacia de la cuantificación automatizada de agregados y mediante el uso de la canalización CellProfiler fue mínima, lo que indica que el método automatizado se puede aplicar a pantallas a gran escala. De las 90 cepas bacterianas analizadas, la colonización del intestino de C.elegans con un candidato mostró una disminución significativa en el número de agregados.Los experimentos de confirmación mediante conteo manual revelaron que ninguno de los mutantes, incluido el que disminuyó significativamente el número de agregados, afectó la agregación polyQ. Los investigadores que deciden utilizar este marco deben entender que los pasos descritos no son absolutos. La modificación y una comprensión fundamental de cómo manipular CellProfiler son esenciales para el éxito.Se pueden utilizar enfoques bioquímicos adicionales, como el western blotting, para confirmar la agregación de polyQ.

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Análisis comparativo de métodos experimentales para cuantificar la actividad animal en modelos de enfermedad mitocondrial de Caenorhabditis elegans

Aquí, se presenta un método para el análisis de la cinética de agregación de proteínas en el nematodo Caenorhabditis elegans. Los animales de una población sincronizada por edad se visualizan en diferentes puntos de tiempo, seguidos de un recuento de inclusión semiautomatizado en CellProfiler y se ajustan a un modelo matemático en AmyloFit.

Monitoreo de la cinética de agregación de proteínas in vivo mediante el conteo automatizado de inclusión en Caenorhabditis elegans

Este protocolo se puede utilizar para realizar estudios ecológicos a gran escala de los nematodos Caenorhabditis . La principal ventaja de este método es la organización y el análisis eficientes de los datos ecológicos y moleculares asociados con los nematodos recogidos de la naturaleza.

Un enfoque altamente escalable para realizar estudios ecológicos de los nematodos de Caenorhabditis Selfing

Aprende a automatizar la cuantificación de agregados de poliglutamina en Caenorhabditis elegans mediante imágenes de alta producción y CellProfiler. Este método elimina sesgos y aumenta la reproducibilidad en estudios de proteostasis.

Automatización de la cuantificación agregada en Caenorhabditis elegans

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