Automatización de la cuantificación agregada en Caenorhabditis elegans
14 de octubre de 2021
El siguiente protocolo describe el desarrollo y la optimización de un flujo de trabajo de alto rendimiento para el cultivo de gusanos, imágenes de fluorescencia y procesamiento automatizado de imágenes para cuantificar los agregados de poliglutamina como una evaluación de los cambios en la proteostasis.
Se adoptó un enfoque simple para monitorear los cambios en la proteostasis mediante la evaluación de la agregación de poliglutamina y proporcionando un marco que se puede utilizar para aplicaciones de alto rendimiento. Puntuar un fenotipo como el número de agregados por I puede llegar a ser subjetivo. La automatización del conteo agregado nos permite eliminar dicho sesgo, aumentar el rendimiento y la reproducibilidad.
Este método ayuda a identificar los genes bacterianos que contribuyen a la interrupción de la proteostasis del huésped. Comprender la contribución de los genes bacterianos individuales nos ayudará a comprender su implicación en la patogénesis de enfermedades como el Alzheimer, el Parkinson y el Huntington. Comience retirando las placas que contienen gusanos del congelador y dejándolos descongelar a temperatura ambiente.
Luego limpie el exceso de condensación y retire la tapa antes de tomar imágenes. Utilice la configuración del microscopio con un tiempo de exposición de 500 milisegundos, un aumento de 40 X con un adaptador de cámara de 0,63 X y una intensidad de GFP establecida en el 100 % durante la captura de la imagen. Ahora ajuste los controles de luz transmitidos hasta que los gusanos aparezcan brillantemente iluminados en comparación con el fondo oscuro, evitando la sobreexposición.
Altere las posiciones de los gusanos dentro del pozo para evitar la aglomeración excesiva mediante el uso de una punta de pipeta de 10 microlitros para empujar suavemente a los gusanos a la posición deseada. Establezca el canal en el filtro GFP para establecer un plano focal para ambas imágenes. Captura una imagen de campo brillante.
Tome una imagen de fluorescencia correspondiente sin perturbar la placa ni cambiar el enfoque del microscopio. Ahora para evaluar las imágenes, primero descargue el CellProfiler. Abra el software y arrastre y suelte las imágenes de interés en el cuadro de imágenes.
Haga clic en las imágenes de la lista de archivos para abrirlas. Seleccione la lupa para resaltar una región de interés y el icono de flecha para medir la longitud de los gusanos y agregados. Coloque el cursor sobre el objeto deseado para determinar su valor de intensidad, que se puede ver en la parte inferior de la pantalla.
Para utilizar la canalización de análisis de imágenes de CellProfiler, asigne un nombre correcto a los pares de imágenes como se describe en el manuscrito de texto después de descargar CellProfiler del sitio web oficial. Descargue la canalización y cárguela en CellProfiler seleccionando archivo, importación y canalización desde el archivo. Seleccione el módulo de gusanos desenredados para abrir su configuración y cargar un conjunto de entrenamiento utilizado para identificar gusanos en el módulo de gusanos desenredados.
A continuación, identifique el nombre de archivo del conjunto de entrenamiento. Seleccione el icono de cargar archivo y cargue el archivo complementario también. Cargue imágenes seleccionando el módulo de imágenes en la esquina superior izquierda.
Y luego arrastre y suelte imágenes con el nombre correcto. Antes de analizar las imágenes, seleccione la carpeta de salida deseada que se utilizará para almacenar los resultados haciendo clic en el botón de configuración de salida ubicado cerca de la esquina inferior izquierda del programa. A continuación, seleccione el icono de carpeta a la derecha de la salida predeterminada para elegir la ubicación de salida deseada.
Seleccione el icono de análisis de imágenes para comenzar el análisis de imágenes. Si el análisis tarda demasiado en completarse y está atascado procesando una sola imagen, cancele la ejecución e identifique la imagen sin procesar ordenando a través de la carpeta de salida y anotando qué nombre de imagen no se encuentra. Después de un análisis completo, el software organizará los resultados en una hoja de cálculo de Excel que contiene gusanos individuales en la columna N y el número respectivo de agregados en la columna K.Descargue el organizador de metadatos para organizar convenientemente los datos del archivo CSV de salida de CellProfiler.
Para el sistema operativo Windows, localice el archivo descargado y extráigalo a la ubicación deseada. Busque y abra la carpeta extraída denominada gui_Windowsos_64x. E inicie la aplicación haciendo clic en el icono de la aplicación GUI.
Es posible que se abra un mensaje solicitando permiso para ejecutarse. Seleccione más información y luego haga clic en ejecutar de todos modos. El organizador de metadatos ahora está listo para arrastrar y soltar archivos CSV de salida de CellProfiler.
Para Mac OS, busque el archivo descargado y extraiga el archivo de la aplicación organizador de metadatos del archivo. Abra la carpeta extraída que se encuentra en las descargas. Haga clic derecho en la aplicación GUI y seleccione abrir.
Aparecerá un mensaje pidiendo permiso para abrir debido a la falta de una licencia oficial. Seleccione abrir. Una vez que su aplicación de organizador de metadatos esté abierta en el sistema operativo respectivo, haga clic en cargar sus archivos aquí, o arrastre y suelte los archivos CSV de CellProfiler deseados.
Haga clic en el botón organizar, que llevará al usuario a una nueva pantalla con un botón de descarga de archivos. Haga clic en el botón y seleccione la ubicación deseada para guardar el archivo de salida. El archivo de salida aparecerá como el nombre de archivo original con _organized extensión agregada al nombre de archivo.
En presencia de FUDR, los gusanos que fueron alimentados con varias bacterias tenían un tamaño corporal más consistente que permitía una detección de gusanos más uniforme y precisa, resolviendo así el problema del hacinamiento. La congelación de los gusanos mejoró la detección de agregados polyQ al eliminar la fluorescencia de fondo, así como la precisión del conteo automatizado comparable al conteo manual. Se utilizó iluminación de campo brillante invertido para detectar todo el canal C.elegans y GFP para obtener imágenes de agregados YFP poliQ.
La detección de gusanos, el desenredo y la cuantificación de agregados para cada gusano se realizaron mediante la aplicación de una canalización de procesamiento de imágenes CellProfiler optimizada, que permite obtener el número de agregados por gusano individual. La diferencia entre la eficacia de la cuantificación automatizada de agregados y mediante el uso de la canalización CellProfiler fue mínima, lo que indica que el método automatizado se puede aplicar a pantallas a gran escala. De las 90 cepas bacterianas analizadas, la colonización del intestino de C.elegans con un candidato mostró una disminución significativa en el número de agregados.
Los experimentos de confirmación mediante conteo manual revelaron que ninguno de los mutantes, incluido el que disminuyó significativamente el número de agregados, afectó la agregación polyQ. Los investigadores que deciden utilizar este marco deben entender que los pasos descritos no son absolutos. La modificación y una comprensión fundamental de cómo manipular CellProfiler son esenciales para el éxito.
Se pueden utilizar enfoques bioquímicos adicionales, como el western blotting, para confirmar la agregación de polyQ.
Visión general
Este estudio desarrolla un flujo de trabajo de alto rendimiento para el cultivo de gusanos, imágenes de fluorescencia y procesamiento automático de imágenes para cuantificar agregados de poliglutamina como medida de cambios en la proteostasis. El método mejora la evaluación de estos agregados, particularmente en la exploración de su papel en enfermedades neurodegenerativas.
Componentes clave del estudio
Área de investigación
- Proteostasis
- Enfermedades neurodegenerativas
- Pantalla de alto rendimiento
Antecedentes
- La agregación de poliglutamina está vinculada a enfermedades como Alzheimer, Parkinson y Huntington.
- Entender las contribuciones de los genes bacterianos a la disrupción de la proteostasis es esencial.
- Los métodos de puntuación tradicionales para los agregados pueden ser subjetivos.
Métodos utilizados
- Imágenes y análisis de alto rendimiento usando CellProfiler
- C. elegans como modelo biológico
- Cuantificación automatizada de agregados de poliglutamina
Resultados principales
- El procesamiento automático de imágenes permite eliminar sesgos y aumentar la reproducibilidad en el conteo de agregados.
- Se identificaron genes bacterianos que afectan la proteostasis del huésped con hallazgos significativos en los números de agregados de gusanos.
- Los resultados validados indican que la automatización es comparable al conteo manual, apoyando pantallas a gran escala.
Conclusiones
- Este estudio proporciona un marco confiable para estudiar la proteostasis a través de la agregación de poliglutamina.
- Las ideas obtenidas de este método son relevantes para entender los mecanismos en enfermedades neurodegenerativas.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Automating aggregate quantification in C. elegans addresses the need for high-throughput, bias-free assessment of proteostasis in neurodegenerative disease models. By standardizing image acquisition and CellProfiler-based analysis, the method enables reproducible screening of large compound or genetic libraries. This supports early target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines for protein conformational diseases.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying polyglutamine aggregation as a proxy for proteostasis disruption.
- Operational Value: Reduces subjectivity in phenotypic scoring, improving data reliability for target validation campaigns.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing quantitative, reproducible readouts for mechanism-based compound prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative aggregate counts per worm, enabling robust assay readouts for screening campaigns.
- Operational Value: Increases throughput and reproducibility through automation, reducing manual labor and inter-operator variability.
- Assay Readiness: Produces structured output (Excel spreadsheet with worm and aggregate counts) compatible with downstream data analysis workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links C. elegans proteostasis models to human neurodegenerative disease mechanisms via conserved polyQ aggregation pathways.
- Mechanistic De-risking: Facilitates identification of bacterial or genetic modifiers of aggregation, supporting target validation in disease-relevant systems.
- Predictive Confidence: Enables cross-functional teams to compare conditions using normalized, automated aggregate quantification.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing quantitative proteostasis readouts that inform go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on proteostasis mechanisms by enabling objective, high-content aggregation phenotyping.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized worm imaging and analysis compatible with 96-well or larger format screens.
- Analytics: Produces quantifiable dependent variable measurements (aggregates per worm) that allow statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects invertebrate model findings to human disease pathways through conserved aggregation biology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis pipeline adaptable to multiple proteostasis targets and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by eliminating bias from manual aggregate counting.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized image processing and automated data output.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling large-scale screens with reduced hands-on time and higher data quality.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions through reliable, quantitative proteostasis biomarkers.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with fluorescence microscopy and GFP/YFP imaging parameters for polyQ detection.
- Depends on CellProfiler software and associated pipeline configuration for automated worm and aggregate segmentation.
- Necessitates standardized image naming and folder organization for successful batch processing.
- Benefits from FUDR treatment to reduce worm size variability and improve detection accuracy in high-density wells.
- Relies on user training to adapt the pipeline for different worm strains, expression patterns, or imaging setups.
