Automatización de la cuantificación agregada en Caenorhabditis elegans

El siguiente protocolo describe el desarrollo y la optimización de un flujo de trabajo de alto rendimiento para el cultivo de gusanos, imágenes de fluorescencia y procesamiento automatizado de imágenes para cuantificar los agregados de poliglutamina como una evaluación de los cambios en la proteostasis.

Se adoptó un enfoque simple para monitorear los cambios en la proteostasis mediante la evaluación de la agregación de poliglutamina y proporcionando un marco que se puede utilizar para aplicaciones de alto rendimiento. Puntuar un fenotipo como el número de agregados por I puede llegar a ser subjetivo. La automatización del conteo agregado nos permite eliminar dicho sesgo, aumentar el rendimiento y la reproducibilidad.

Este método ayuda a identificar los genes bacterianos que contribuyen a la interrupción de la proteostasis del huésped. Comprender la contribución de los genes bacterianos individuales nos ayudará a comprender su implicación en la patogénesis de enfermedades como el Alzheimer, el Parkinson y el Huntington. Comience retirando las placas que contienen gusanos del congelador y dejándolos descongelar a temperatura ambiente.

Luego limpie el exceso de condensación y retire la tapa antes de tomar imágenes. Utilice la configuración del microscopio con un tiempo de exposición de 500 milisegundos, un aumento de 40 X con un adaptador de cámara de 0,63 X y una intensidad de GFP establecida en el 100 % durante la captura de la imagen. Ahora ajuste los controles de luz transmitidos hasta que los gusanos aparezcan brillantemente iluminados en comparación con el fondo oscuro, evitando la sobreexposición.

Altere las posiciones de los gusanos dentro del pozo para evitar la aglomeración excesiva mediante el uso de una punta de pipeta de 10 microlitros para empujar suavemente a los gusanos a la posición deseada. Establezca el canal en el filtro GFP para establecer un plano focal para ambas imágenes. Captura una imagen de campo brillante.

Tome una imagen de fluorescencia correspondiente sin perturbar la placa ni cambiar el enfoque del microscopio. Ahora para evaluar las imágenes, primero descargue el CellProfiler. Abra el software y arrastre y suelte las imágenes de interés en el cuadro de imágenes.

Haga clic en las imágenes de la lista de archivos para abrirlas. Seleccione la lupa para resaltar una región de interés y el icono de flecha para medir la longitud de los gusanos y agregados. Coloque el cursor sobre el objeto deseado para determinar su valor de intensidad, que se puede ver en la parte inferior de la pantalla.

Para utilizar la canalización de análisis de imágenes de CellProfiler, asigne un nombre correcto a los pares de imágenes como se describe en el manuscrito de texto después de descargar CellProfiler del sitio web oficial. Descargue la canalización y cárguela en CellProfiler seleccionando archivo, importación y canalización desde el archivo. Seleccione el módulo de gusanos desenredados para abrir su configuración y cargar un conjunto de entrenamiento utilizado para identificar gusanos en el módulo de gusanos desenredados.

A continuación, identifique el nombre de archivo del conjunto de entrenamiento. Seleccione el icono de cargar archivo y cargue el archivo complementario también. Cargue imágenes seleccionando el módulo de imágenes en la esquina superior izquierda.

Y luego arrastre y suelte imágenes con el nombre correcto. Antes de analizar las imágenes, seleccione la carpeta de salida deseada que se utilizará para almacenar los resultados haciendo clic en el botón de configuración de salida ubicado cerca de la esquina inferior izquierda del programa. A continuación, seleccione el icono de carpeta a la derecha de la salida predeterminada para elegir la ubicación de salida deseada.

Seleccione el icono de análisis de imágenes para comenzar el análisis de imágenes. Si el análisis tarda demasiado en completarse y está atascado procesando una sola imagen, cancele la ejecución e identifique la imagen sin procesar ordenando a través de la carpeta de salida y anotando qué nombre de imagen no se encuentra. Después de un análisis completo, el software organizará los resultados en una hoja de cálculo de Excel que contiene gusanos individuales en la columna N y el número respectivo de agregados en la columna K.Descargue el organizador de metadatos para organizar convenientemente los datos del archivo CSV de salida de CellProfiler.

Para el sistema operativo Windows, localice el archivo descargado y extráigalo a la ubicación deseada. Busque y abra la carpeta extraída denominada gui_Windowsos_64x. E inicie la aplicación haciendo clic en el icono de la aplicación GUI.

Es posible que se abra un mensaje solicitando permiso para ejecutarse. Seleccione más información y luego haga clic en ejecutar de todos modos. El organizador de metadatos ahora está listo para arrastrar y soltar archivos CSV de salida de CellProfiler.

Para Mac OS, busque el archivo descargado y extraiga el archivo de la aplicación organizador de metadatos del archivo. Abra la carpeta extraída que se encuentra en las descargas. Haga clic derecho en la aplicación GUI y seleccione abrir.

Aparecerá un mensaje pidiendo permiso para abrir debido a la falta de una licencia oficial. Seleccione abrir. Una vez que su aplicación de organizador de metadatos esté abierta en el sistema operativo respectivo, haga clic en cargar sus archivos aquí, o arrastre y suelte los archivos CSV de CellProfiler deseados.

Haga clic en el botón organizar, que llevará al usuario a una nueva pantalla con un botón de descarga de archivos. Haga clic en el botón y seleccione la ubicación deseada para guardar el archivo de salida. El archivo de salida aparecerá como el nombre de archivo original con _organized extensión agregada al nombre de archivo.

En presencia de FUDR, los gusanos que fueron alimentados con varias bacterias tenían un tamaño corporal más consistente que permitía una detección de gusanos más uniforme y precisa, resolviendo así el problema del hacinamiento. La congelación de los gusanos mejoró la detección de agregados polyQ al eliminar la fluorescencia de fondo, así como la precisión del conteo automatizado comparable al conteo manual. Se utilizó iluminación de campo brillante invertido para detectar todo el canal C.elegans y GFP para obtener imágenes de agregados YFP poliQ.

La detección de gusanos, el desenredo y la cuantificación de agregados para cada gusano se realizaron mediante la aplicación de una canalización de procesamiento de imágenes CellProfiler optimizada, que permite obtener el número de agregados por gusano individual. La diferencia entre la eficacia de la cuantificación automatizada de agregados y mediante el uso de la canalización CellProfiler fue mínima, lo que indica que el método automatizado se puede aplicar a pantallas a gran escala. De las 90 cepas bacterianas analizadas, la colonización del intestino de C.elegans con un candidato mostró una disminución significativa en el número de agregados.

Los experimentos de confirmación mediante conteo manual revelaron que ninguno de los mutantes, incluido el que disminuyó significativamente el número de agregados, afectó la agregación polyQ. Los investigadores que deciden utilizar este marco deben entender que los pasos descritos no son absolutos. La modificación y una comprensión fundamental de cómo manipular CellProfiler son esenciales para el éxito.

Se pueden utilizar enfoques bioquímicos adicionales, como el western blotting, para confirmar la agregación de polyQ.