Fabricación y caracterización de andamios de fibra modificado Griffithsin para la prevención de infecciones de transmisión sexual

El objetivo general de este procedimiento es fabricar y modificar la superficie del ácido poliláctico, el ácido co-glicólico, las fibras electrohiladas, con cantidades variables de la proteína antiviral Griffithsina. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la administración de fármacos, como la forma de formular y caracterizar nuevos vehículos de administración que puedan prevenir las infecciones virales de transmisión sexual, como el VIH-1. La principal ventaja de la técnica es que la actividad antiviral de la Griffithsina se maximiza mediante el uso de fibras poliméricas-electrohiladas como andamio estacionario para la Griffithsina altamente localizada en la superficie de la fibra.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de otras infecciones virales y bacterianas, debido al potente potencial profiláctico y terapéutico de Griffithsin contra una variedad de tipos de infecciones. Aunque este método puede proporcionar información sobre la prevención de la infección por VIH-1, también se puede aplicar a otros sistemas, como otras infecciones virales o bacterianas en las que Griffithsin ha demostrado su potencia. Para comenzar este procedimiento, pese 720 miligramos de PLGA 50/50 en un centelleo de 10 mililitros.

Con una pipeta de vidrio serológico, agregue 3,0 mililitros de HFIP. Cubra el vil con una película de plástico. Luego, mide y registra la masa vil.

Incubar la suspensión de polímero a 37 grados centígrados durante la noche para asegurar la disolución completa del polímero. Después de esto, prepare el aparato de electrospinning como se describe en el protocolo de texto. Use una jeringa de tres mililitros para aspirar la solución de polímero.

A continuación, conecte una punta de aguja roma de calibre 18 de 0,5 pulgadas a la jeringa. Dispense el exceso de solución para eliminar el espacio vacío de la cabeza en la aguja. Coloque la jeringa en una bomba de jeringa y ajuste el caudal del instrumento a 2,0 mililitros por hora.

Conecte la fuente de alimentación a la aguja de la jeringa. Electrospin la solución de polímero utilizando un voltaje positivo de 27 kilovoltios. Después de que toda la solución esté electrohilada, apague la fuente de alimentación.

Deje que el mandril gire durante 30 minutos más, para evaporar completamente el solvente. Luego, apague el colector de mandril giratorio. Con una cuchilla de afeitar, pela suavemente la fibra del mandril.

Recoja la fibra de PLGA electrohilada en una placa de Petri etiquetada. Coloque el plato en un desecador durante la noche para eliminar cualquier solvente residual. Para comenzar, prepare las soluciones PBS y MES como se describe en el protocolo de texto.

A continuación, retire el EDC y el NHS del congelador. Déjalos reposar para que se equilibren a temperatura ambiente. Después de esto, pese cuatro miligramos de EDC en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Pese seis miligramos de NHS en un tubo de microcentrífuga diferente. Agregue un mililitro de tampón MES a cada tubo. Agite ambos tubos vigorosamente para asegurarse de que los reactivos se disuelvan por completo.

Luego, pese 70 miligramos de hidroxilamina en un tubo centrífugo cónico de 50 mililitros. Agregue 20 mililitros de PBS y vórtice. Coloque una cantidad adecuada de fibra PLGA en un tubo de centrífuga cónico de 15 mililitros.

Agregue ocho mililitros de tampón MES a la fibra. A continuación, agregue un mililitro de las soluciones EDC y NHS. Use una película de plástico para sellar el tubo de centrífuga cónico de 15 mililitros.

Coloque el tubo en un rotador para invertir suavemente la solución durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de esto, agregue 14 microlitros de beta-mercaptoetanol para apagar la reacción. Invierta el tubo varias veces para asegurar una mezcla completa.

Deseche el sobrenadante y enjuague la fibra PLGA dos veces usando 10 mililitros de PBS para cada lavado. Agregue una cantidad apropiada de solución madre GRFT al tubo, como se describe en el protocolo de texto. Luego, agregue suficiente PBS para llevar el volumen final a ocho mililitros.

Cierre e invierta el tubo para asegurar una mezcla completa. Selle el tubo con una película de plástico. Coloque el tubo en el rotador para invertir suavemente la solución durante dos horas.

Después de esto, apague la reacción agregando dos mililitros de la solución de hidroxilamina preparada y agite el vórtice durante 30 segundos. Deseche el sobrenadante. Enjuague la fibra PLGA modificada en la superficie dos veces, usando 10 mililitros de agua ultrapura y vórtice para cada lavado.

A continuación, transfiera la fibra lavada a una placa de Petri. Coloque la placa de Petri dentro de un desecador, hasta que la fibra esté completamente seca. A continuación, guarde la placa de Petri a cuatro grados centígrados.

Para empezar, coloque tres tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Masa dos miligramos de fibra en cada uno. Luego, agregue un mililitro de DMSO a cada tubo.

Vórtice durante un minuto a temperatura ambiente para disolver completamente la fibra. Después de esto, diluya una alícuota de 10 microlitros al menos 100 veces, en tampón TE. Almacenar a menos 20 grados centígrados, hasta cargar la caracterización con Eliza.

Pese entre 5 y 10 miligramos de fibra modificada en la superficie y transfiérala a un tubo de microcentrífuga. Registre la masa de fibra colocada en cada tubo. A continuación, agregue un mililitro de una solución que imite el entorno fisiológico de cada muestra.

Incubar las muestras en un agitador giratorio a 200 RPM y 37 grados Celsius durante una hora. Después de esto, retire aproximadamente un mililitro de la solución que contiene el GRFT desorbido y alícuota en tubos de racimo. Almacene a menos 20 grados centígrados hasta que esté listo para realizar la cuantificación de proteínas.

A continuación, transfiera la muestra a un nuevo tubo de microcentrífuga. Agregue un mililitro de solución tampón fresca e incube hasta el próximo punto de tiempo, como se describe en el protocolo de texto. En este estudio, se examinan las condiciones para la fabricación de fibras electrohiladas PLGA.

El análisis SEM de fibras GRFT en blanco, 0,05 nanomoles, 0,5 nanomoles y 5 nanomoles indica que la modificación GRFT no tiene ningún efecto sobre la morfología de las fibras. Se observa que todas las formaciones tienen diámetros promedio similares, alrededor de 1,9 micras, lo que demuestra la consistencia del proceso de fabricación modificado en todos los lotes. A continuación, se determina la cantidad de GRFT conjugado en las fibras electrohiladas.

La modificación de 5 nanomoles contiene 373 nanogramos de GRFT, mientras que las modificaciones de 0,5 y 0,05 contienen 165 y 42, respectivamente. Esto demuestra que las fibras conjugadas con una mayor densidad teórica de modificación de la superficie dan como resultado más GRFT conjugado con la fibra. Sin embargo, se puede ver una correlación inversa en la eficiencia de conjugación resultante.

A continuación, se evalúa la cantidad de GRFT conjugado covalentemente con la fibra. Dentro de las primeras cuatro horas, se detectan 113 nanogramos, 25 nanogramos y 10 nanogramos de GRFT por miligramo de fibra electrohilada en las concentraciones de modificación teórica de 5 nanomoles, 0,5 nanomoles y 0,05 nanomoles, respectivamente. Después de cuatro horas, se detecta GRFT insignificante en el eluido de liberación para las tres formulaciones.

Estos datos indican que la mayor parte del GRFT se une covalentemente a las fibras electrohiladas y que el GRFT absorbido en la superficie se libera dentro de las primeras cuatro horas. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente cuatro días. El electrohilado del andamio de fibra polimérica requiere dos días para preparar la solución polimérica y electrospinar.

Mientras que la modificación de la superficie, el secado posterior y la caracterización de las fibras requirieron al menos dos días adicionales. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las proporciones adecuadas de reactivos para garantizar una modificación óptima. Además, también es importante verificar que los parámetros de electospinning sean correctos para garantizar una morfología de fibra adecuada.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la administración de fármacos fabricaran fibras electrohiladas, que no solo encapsulan agentes antivirales dentro de la fibra, sino que tienen la capacidad de conjugar agentes activos a través de la superficie de la fibra. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo electroespender la fibra polimérica, realizar la modificación de la superficie de la fibra con la proteína antiviral Griffithsin, y la Griffithsina cualitativa conjugada con la fibra. No olvide que trabajar con reactivos como HFIP, beta-mercaptoetanol, EDC y NHS puede ser extremadamente peligroso.

Siempre se deben tomar precauciones, como la aplicación adecuada de EPP y el uso de campanas extractoras químicas, al realizar este procedimiento.