Name: Fabricación y caracterización de andamios de fibra modificado Griffithsin para la prevención de infecciones de transmisión sexual (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Aprende a fabricar y modificar fibras electrohiladas de PLGA con Griffithsin para sistemas de liberación de fármacos antivirales contra VIH-1. Este método maximiza la actividad antiviral mediante la conjugación superficial de la proteína.

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Agradecemos al fondo de la judíos patrimonio por excelencia para la financiación de esta investigación. Agradecemos al Dr. Stuart Williams II para ofrecer generosamente el uso del sistema de centrifugado eléctrico. También agradecemos el Dr. Kenneth Palmer nos proporciona Griffithsin. Además agradecemos a Dr. Nobuyuki Matoba y su laboratorio para el entrenamiento en el ELISA GRFT trabajar.

1. preparación y fabricación de andamio de fibra Electrospun PRECAUCIÓN: todo el trabajo con solventes o soluciones de polímeros debe realizarse en una campana de humos químicos . Consulte la hoja de datos material de seguridad de cada reactivo antes de iniciar el protocolo de.
<ol><li>Para electrospin una solución de polímero del EGLP 3 mL de 15% w/w, peso 720 mg de 50: 50 poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA; 0.55 a 0.75 dL/g, 31-57 kDa) en un vial de centelleo de 10 mL. El volumen de la solución se basa en el tamaño de lote típico utilizado en los estudios actuales. 
	Nota: Debe calcularse la masa de polímero para agregar a un volumen dado de solvente en la primera determinación de la densidad del solvente utilizado para disolver el polímero. La densidad del solvente Hexafluoro-2-propanol (HFIP) es de 1,59 g/mL. Así, el peso del solvente, basado en un volumen de 3.0 mL HFIP necesitada, es 4,8 g (3,0 mL x 1,59 g / mL). Para una fracción 15% w/w de PLGA a HFIP 720 mg EGLP debe agregarse a 3.0 mL HFIP (0.15 x 4.800 mg = 720 mg). La ventaja de usar un % w/w/solución de polímero, en lugar de % w/v, es que proporciona un peso definido de la solución final. Este peso definido permite reemplazo de solvente más precisa, en el caso de evaporación de solvente durante el paso 1.3.</li>
	<li>Agregar 3.0 mL HFIP al vial de centelleo de vidrio que contiene PLGA (del paso 1.1) con una pipeta serológica de vidrio. Cubrir el frasco con la película plástica, a continuación, mida y registre el frasco Massachusetts</li>
	<li>Incubar la suspensión del polímero durante la noche a 37 ° C para asegurar la completa disolución del polímero. Si ningún tipo de disolvente se evapora, disminuyendo la masa de la cubeta, añadir HFIP hasta que el frasco alcanza su masa original en el paso 1.2.</li>
	<li>Después de la incubación, preparar el aparato de electrospinning ( figura 2 A). Aunque puede utilizar un mandril de cualquier tamaño, aquí un mandril giratorio de acero inoxidable de diámetro exterior 25 mm fue utilizado como el colector de. 
	Nota: Un diámetro de mandril disminuirá el grosor de la fibra, dado el mismo volumen de solución de electrospinning.</li>
	<li>Aspirar la solución de polímero en una jeringa de 3 mL.</li>
	<li>Conectar una punta de aguja Roma de calibre 18, 1/2 pulgada a la jeringuilla y dispense el exceso (típicamente de 0.25 mL) de solución para eliminar el espacio vacío en la punta de la aguja.</li>
	<li>Coloque la jeringa en una bomba de jeringa y fijar el caudal de instrumento a 2,0 mL/h. 
	Nota: Este flujo se optimizó anteriormente basado en la viscosidad del polímero para la formulación de esta.</li>
	<li>Conectar la fuente de alimentación a la aguja de la jeringuilla y electrospin la solución de polímero con una tensión de + 27 kV. La distancia entre la aguja y el colector debe ser establecida en aproximadamente 25 cm ( figura 2 B). 
	PRECAUCIÓN: El proceso de centrifugado eléctrico crea un vapor de solvente. Utilice una campana de humos o un aparato cerrado ( figura 2) para eliminar el vapor perjudicial .</li>
	<li>Una vez que la solución entera electrospun, apague la fuente de energía y permitir que el mandril gire un adicional 30 minutos evaporar totalmente el disolvente.</li>
	<li>Vuelta apagado el colector rotativo de mandril y utilice una cuchilla para cortar la fibra del mandril. Utilice la cuchilla para pelar suavemente la fibra de la mandril.</li>
	<li>Recoger la fibra PLGA electrospun en una placa Petri marcada y en un desiccatorovernight para quitar el solvente residual.</li>
</ol> 2. Modificación de la superficie de las fibras con GRFT <ol><li>Prepare soluciones de tampón fosfato salino (PBS) y 2-(N-morfolino) (n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido ácido (tampón de MES). Preparar PBS disolviendo 8 g NaCl 0,2 g KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4 y 0.24 g KH 2 PO 4 en 1 L de agua ultrapura. De manera similar, disolver 19,52 g MES (libre de ácido, 195.2 MW) y 29,22 g NaCl en 1 L de agua ultrapura, para preparar el buffer MES. Asegurar que el pH final de cada solución es entre 7.2-7.5 y 5.0-6.0, respectivamente, usando un medidor de pH.</li>
	<li>Preparar soluciones de trabajo individuales de EDC (2 mM) y NHS (5 mM).
	<ol><li>Quite la EDC y NHS del congelador y permitirles que alcancen la temperatura ambiente antes de pesar.</li>
		<li>Pesar de 4 mg de EDC en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL.</li>
		<li>Pesar de 6 mg de NHS en otro tubo de microcentrífuga.</li>
		<li>ML agregue 1 MES buffer a cada tubo. Vórtex los tubos vigorosamente para los reactivos se disuelven completamente.</li>
	</ol></li> <li>Preparar una solución de hidroxilamina pesando 70 mg en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL.</li>
	<li>Añadir a la hidroxilamina y vortex para disolver 20 mL PBS.</li>
	<li>Masa hacia fuera una cantidad apropiada de fibra EGLP en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL. Normalmente, 75 mg de fibra se utiliza para cada lote de reacción.</li>
	<li>Añada 8 mL de tampón MES al tubo de 15 mL.</li>
	<li>Agregue 1 mL de cada una de las soluciones EDC y NHS preparado anteriormente para el tubo. El volumen final de la solución debe ser 10 mL. Las concentraciones finales de EDC y NHS deben ser 0,4 mg/mL y 0.6 mg/mL, respectivamente.</li>
	<li>Cierre y selle el tubo de 15 mL con película de plástico y colóquelo en un rotor para permitir que la solución de invertirse suavemente durante 15 min a temperatura ambiente ( figura 3 B). Este paso activa los grupos carboxyl en el polímero para permitir la modificación covalente con la proteína GRFT ( figura 3 A).</li>
	<li>Después de la activación, cuidadosamente calmar la reacción mediante la adición de 14 μl de β-mercaptoetanol al tubo. Invertir el tubo varias veces para asegurar una mezcla completa. 
	PRECAUCIÓN: β-mercaptoetanol es altamente tóxico y debe ser utilizado en una campana de humos químicos.</li>
	<li>Eliminar el sobrenadante y lavar dos veces, la fibra PLGA con 10 mL de PBS para quitar cualquier resto de β-mercaptoetanol.</li>
	<li>Después de enjuagar, agregar una cantidad apropiada de solución madre GRFT al tubo. Por ejemplo, un 5 nmol fibra GRFT/mg requeriría 6,35 μl de solución stock GRFT (de un stock de 10 mg/mL) por mg de fibra. Así una muestra de fibra 75 mg requeriría 476.25 μl de solución stock de 10 mg/mL GRFT. 
	Nota: Se fabrican fibras GRFT con cargas teóricas de 0.05, 0.5 y 5 nmol GRFT por fibra mg.</li>
	<li>Añadir suficiente PBS para llevar el volumen final a 8 mL, cerrar e invertir el tubo para asegurar una mezcla completa.</li>
	<li>Sellar el tubo con película de plástico y colóquelo en un rotor nuevo, tiempo de 2 h.</li>
	<li>Después de las 2 h incubación, calmar la reacción mediante la adición de 2 mL de solución de hidroxilamina en el tubo de centrífuga de 15 mL. Siguiendo las instrucciones del fabricante, la concentración final de hidroxilamina durante la reacción de enfriamiento debe ser 0,7 mg/mL.</li>
	<li>La solución se mezcla bien y desechar el sobrenadante. Enjuague la fibra PLGA de superficie modificada dos veces con 10 mL de agua ultrapura para quitar cualquier GRFT.</li>
	<li>Transferencia de la fibra a un plato de Petri y lugar dentro de un desecador hasta que la fibra quede completamente seca. Transferencia de la caja Petri a 4 ° C para almacenamiento de información.</li>
</ol> 3. SEM fibras caracterización de GRFT superficie modificada montaje del espécimen de <ol><li>lugar una tira de cinta de carbón de doble cara en un SEM. La parte inferior del montaje del espécimen de la etiqueta con los datos identificativos de la muestra utilizando un marcador permanente.</li>
	<li>Cortar tres muestras de una fibra de superficie modificada y en montajes de muestras separadas. El grueso de cada muestra es aproximadamente de 0,5 mm.</li>
	<li>Farfulle la capa las muestras mediante la deposición de partículas inducida por electrones de una placa de oro. Sputter coat por 90 s, en 2.4 kV. 
	Nota: El tiempo de capa catódica puede variar dependiendo de los parámetros del equipo, incluyendo el voltaje y amperaje.</li>
	<li>Las muestras de la imagen a 8 kV con aumentos que van desde 1.000 a 5, 000 x.</li>
</ol> 4. Extracción de GRFT de fibras de superficie modificada <ol><li>total a 2 mg de fibra por triplicado en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Agregar dimetilsulfóxido 1 mL (DMSO) en el tubo, entonces vortex e incubar durante 1 min a temperatura ambiente para disolver completamente la fibra.</li>
	<li>Después de la incubación, diluir una alícuota de 10 μl de la solución de DMSO-fibra en el paso 4.2, por lo menos 100-fold en tampón Tris-EDTA (TE) (pH = 8.0).</li>
	<li>Almacenar las muestras a-20 ° C hasta carga caracterización con ELISA de.</li>
</ol> 5. Medición GRFT desorción de fibras <ol><li>para evaluar la cantidad de GRFT lanzado o desorbida de la fibra, peso 5-10 mg de fibra de superficie modificada y colocarla en un tubo de microcentrífuga. Registrar la masa de fibra en cada tubo.</li>
	<li>Añada 1 mL de una solución apropiada que imita el entorno fisiológico (e.g., PBS, buffer TE, fluido vaginal simulado (SVF), etc.) para cada muestra.</li>
	<li>Incubar las muestras durante 1 hora en un agitador rotatorio a 200 rpm, 37 ° C.</li>
	<li>Después de incubación, retirar aproximadamente 1 mL de tampón de TE que contiene el GRFT deabsorbido del frasco y alícuota a cluster tubos. Almacenar a-20 ° C hasta la cuantificación de proteína.</li>
	<li>Transferir la muestra a un tubo nuevo de microcentrífuga, añadir 1 mL de solución amortiguadora fresca a la fibra dentro del tubo de microcentrífuga e incubar hasta el siguiente momento.</li>
	<li>Puntos de tiempo típico utilizado para medir la versión: 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72 wk. h y 1 insignificante desorción se observó en estos estudios después de 4 h.</li>
</ol> 6. Cuantificación de GRFT extracción y desorción mediante ELISA <ol><li>capa un ELISA de 96 pocillos placa con 0,1 mL de HA (10 μg/mL) por pozo como se describió anteriormente 51. Selle la placa con la película plástica e incubar durante una noche a 4 ° C ( figura 4).</li>
	<li>Quitar el tampón con revestimiento y añadir 0,3 mL tampón (2-3% albúmina de suero bovino (BSA) en PBS con 0.05% polisorbato 20) a cada pozo de bloqueo. Incube la placa durante al menos 2 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Después de la incubación, lavar la placa 3 veces con PBS 1 x con 0.1% polisorbato 20 (PBS-P). Después de enjuagar, dispensar 0.1 mL de muestra, estándar o PBS como control negativo en los pocillos respectivos. Incube la placa otra vez por 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar la placa otra vez 3 veces con PBS-P. Después de enjuagar, agregar 0,1 mL de anticuerpo primario (antisuero de cabra anti-GRFT) en cada pocillo e incubar durante al menos 1 h a temperatura ambiente. Por lo general, se diluye la solución de anticuerpo primario de 1: 10,000 en PBS.</li>
	<li>Después de incubar las muestras con enjuague de anticuerpo primario las placas otra vez 3 veces con PBS-P. Añadir 0,1 mL de anticuerpo secundario (peroxidasa de rábano (HRP)-cabra anti conejo Conjugado IgG) a cada uno bien e incubar 1 h a temperatura ambiente. Se diluye la solución de anticuerpo secundario de 1: 10,000 en PBS.</li>
	<li>Lavar la placa 3 veces. Agregar sustrato de peroxidasa 2 TMB 0.1 mL en cada pocillo. Supervisar el desarrollo de color (aproximadamente 2 minutos), a continuación, Añadir 0,1 mL de H 2 hasta 4 (1 N) para calmar la reacción. Leer la placa a 450 nm en un lector de placas.</li>
	<li>Promedio de los valores de OD de fondo (pozos que sólo reciben la PBS) y restar esto de los grupos experimentales.</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Debido a sus estructuras porosas y superficies grandes, EFs han encontrado una variedad de aplicaciones en la salud, uno de los cuales incluye servir como vectores terapéuticos. Drogas y otros agentes activos pueden ser incorporados dentro de EFs para entrega regulable, mientras que los productos biológicos y químicos ligandos pueden ser conjugados con la superficie de la fibra para celular específica dirigida a52 o biosensores53. Aquí la fabricación de GRFT superficie modi...

El uso de EFs como una plataforma de entrega tópica tiene el potencial para reducir significativamente las ITS. Actualmente, hay más 36 millones personas que viven con el VIH, con sobre 2 millones de nuevos casos reportados en 2015 solo1,2. Además, el virus herpes simple tipo 2 (HSV-2) la infección afecta cientos de millones de personas en todo el mundo y se ha demostrado para mejorar la adquisición del VIH por 2-5 veces3. Debido a esta relación entre infección por VHS-2 y la infección por el VIH, existe gran interés en el desarrollo de nuevos agentes activos que proporcionan la protección simultánea contra las ITS múltiples. Por otra parte, el desarrollo de nuevos vehículos para mejorar la entrega de estos agentes antivirales ofrece el potencial para aumentar la Potencia protectora y terapéutica. Hacia este objetivo EFs han sido investigados como una nueva plataforma para reducir la prevalencia de infecciones por el VIH-1 y HSV-2.
Durante las últimas dos décadas, EFs se han utilizado extensivamente en los campos de la administración de fármacos y tejidos ingeniería4. A menudo, polímeros biocompatibles se seleccionan traducir fácilmente a aplicaciones terapéuticas. Para fabricar el EFs poliméricos, el polímero seleccionado se disuelve en una solución acuosa o disolvente orgánica, dependiendo del grado de hidrofobicidad de polímero5. Agentes activos de interés entonces se agregan a la solución acuosa o disolvente antes del proceso de centrifugado eléctrico. La solución de polímero es entonces aspira en una jeringa y expulsada lentamente mientras sujeta a una corriente eléctrica. Este proceso típicamente resulta en fibras de polímero con hoja o macroestructuras cilíndrico (figura 1) y diámetros de fibra que van desde la micro a nano-escala6. Para aplicaciones más terapéuticas, agentes activos se incorporan dentro de las fibras durante el proceso de centrifugado eléctrico y son liberados de la fibra a través de la difusión y la degradación de fibra posterior. La tasa de degradación o de liberación puede ser alterada usando diferentes tipos de polímeros o mezclas de polímeros para establecer un perfil de liberación deseado, impartiendo propiedades químicas y físicas únicas7y la promoción de la encapsulación de prácticamente cualquier compuesto. Como tal, EFs han demostrado ser beneficiosos para la entrega de fármacos de molécula pequeña y agentes biológicos, como proteínas, péptidos, oligonucleótidos y factores de crecimiento6,8,9.
En el campo de la prevención de ITS, EFs han utilizado recientemente para incorporar y ofrecer o inducible-liberación sostenida de agentes antivirales10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. En uno de los primeros estudios, se desarrollaron fibras sensible al pH para liberar a agentes activos en respuesta a cambios ambientales dentro de la zona reproductiva femenina (FRT), como un método en demanda de protección contra el VIH-111. Desde entonces, otros estudios han investigado mezclas de polímero compuestos de óxido de polietileno (PEO) y el ácido poli-l-láctico (PLLA), para evaluar la liberación ajustable de agentes antivirales y anticonceptivos para VIH-1 prevención y anticoncepción in vitro 12. estudios adicionales han demostrado la viabilidad de EFs para proporcionar lo siguiente: prolongada liberación de pequeñas moléculas antivirales14, fuerte y flexible propiedades mecánicas20, arquitecturas de entrega 3-21 , inhibición de esperma penetración12y la capacidad para combinar con otras tecnologías de entrega13. Finalmente, el trabajo previo ha evaluado fibras poliméricas para la entrega sostenida de los antivirales contra el virus de co-contagioso comunes, HSV-2 y VIH-114. En este estudio, las fibras de polímero proporcionan actividad complementaria a la entrega de antiviral por su estructura de retención hasta por 1 mes y proporcionar una barrera física a la entrada viral. De estos resultados, se observó que la EFs pueden utilizarse tanto física como químicamente impedir la infección del virus.
Mientras que propiedades sintonizables poliméricos EFs una plataforma atractiva para la entrega de microbicidas, EFs se han desarrollado en otras aplicaciones como andamios de superficie modificada7. EFs se han utilizado para imitar la morfología de la matriz extracelular (ECM), actuando a menudo como andamios para mejorar la regeneración celular22y su utilidad en tejidos ingeniería23,24. Las fibras de polímeros como el poli-ε-caprolactone (LCP) y PLLA han sido superficie modificada con factores de crecimiento y proteínas después de electrospinning impartir propiedades de ECM como incluyendo aumento celular adherencia y proliferación25 , 26. Además, EFs modificado superficie antimicrobianas han sido evaluadas para prevenir el crecimiento de bacterias patógenas específicas27,28. Debido a esta versatilidad y la capacidad de inducir efectos biológicos, tecnología EF continúa expandiéndose a través de una variedad de campos para proporcionar funcionalidad de múltiples mecanismos. Sin embargo, a pesar de su utilidad en una diversidad de aplicaciones, fibras de superficie modificada sólo recientemente se han explorado en el campo microbicida del29.
En paralelo con el desarrollo de las nuevas tecnologías de entrega para prevenir y tratar las ITS, se han desarrollado novedosas terapias biológica. Uno de los candidatos más prometedores del microbicida es el adhesivo lectinas antiviral, GRFT30. Derivado originalmente de una especie de algas rojas, GRFT ha demostrado actividad como un potente inhibidor de la HIV, HSV-2, SARS, así como de la Hepatitis C virus31,32,33,34, 35 , 36. de hecho, entre los inhibidores de base biológica, GRFT tiene la más potente actividad anti-VIH, inactivar el VIH-1 casi de inmediato en contacto30, manteniendo la estabilidad y la actividad en presencia de medios de cultivo de vaginal microbios por hasta 10 días37. Más recientemente, gel 0.1% GRFT fue demostrado proteger a ratones contra el desafío de HSV-2 intravaginal, convirtiéndolo en un candidato prometedor para la primera línea de protección contra HSV-2 y VIH-132, 38. para VIH GRFT inhibe específicamente, infección atando físicamente gp120 o terminal de residuos de glicanos N-ligados de manosa en las superficies de la envoltura vírica para prevenir la entrada de38,39,40,41 ,42. Esta inhibición es muy potente, con IC50s a 3 ng/mL43. Además de inhibir la infección por VIH, los estudios también han demostrado que GRFT protege contra la infección por HSV-2 inhibiendo la propagación de célula a célula del virus32. En todos los casos, GRFT ha demostrado ser adhesivo a partículas virales, demostrando alta resistencia a la desnaturalización. Por último, GRFT ha demostrado actividad sinérgica con combinaciones de Tenofovir (TFV) y otros antivirales44, lo que es factible y probable beneficioso administrar conjuntamente con EFs. Las potentes propiedades de GRFT hacen un excelente base biológica antiviral candidato, en el cual entrega puede mejorarse con la tecnología EF.
Utilizando este conocimiento de las propiedades antivirales de GRFT adhesivo e innatas, un andamio de fibra polimérica fue diseñado, que integra estas propiedades para proporcionar la primera capa de virus entrada inhibición29. Encontrando inspiración en el camino que moco cervicovaginal dificulta el transporte de virus principalmente a través de las interacciones de mucina mucoadherentes, presumimos con EFs como andamio y covalente modificando la superficie con GRFT, una alta densidad de conjugados con superficie GRFT debilitar e inactivar virus en su punto de entrada45,46,47. Aquí EFs se desarrollaron como un andamio fijo para proporcionar una viral, basada en la proteína adhesiva inactivar barrera plataforma. Intentamos combinar las potentes propiedades antivirales de GRFT con una plataforma de polímero biocompatible, modificable y durable, para crear un nuevo virus "trampa."
Para alcanzar estos objetivos, las fibras de PLGA eran electrospun y química NHS EDC utilizó posteriormente modificar la superficie EF con GRFT. PLGA sirvió como un polímero del modelo debido a su amplio uso en electrospinning48, combinado con su biocompatibilidad y su rentabilidad. Además, modificación superficial explota la gran superficie de EFs y ofrece una alternativa útil que puede combinarse con la encapsulación para maximizar la utilidad de la fibra49. A diferencia de los métodos de encapsulación tradicionales donde solamente una porción de GRFT está disponible (y sólo transitoriamente presentes en la FRT), modificación superficial puede permitir GRFT mantener bioactividad máxima durante toda la duración del tratamiento. Además, la incorporación de compuestos hidrofílicos como proteínas por métodos tradicionales de electrospinning, puede resultar en rendimientos más bajos de la encapsulación y la pérdida de proteína actividad50. Por lo tanto, las fibras de superficie modificada GRFT pueden ofrecer un método prometedor de entrega alternativos que puede utilizarse solos o en combinación con electrospinning para optimizar la protección contra la infección de ITS.

<table><tbody><tr><td>Poli(Lactide-co-glicólido) (PLGA) 50:50</td><td>Lactel</td><td>B6013-2P</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>147541000</tr><tr><td>Aguja dispensadora roma 18g x 1/2</td><td>Brico Medical Supplies</td><td>BN1815</td><td></td></tr><tr><td>BD 3mL Jeringa Luer-lok</td><td>VWR</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm (película de plástico)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 2-(N-Morfolino)etanosulfónico (tampón MES)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3671&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Hidroxisuccinimida (NHS)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Fisher</td><td>BP176</td><td></td></tr><tr><td>Griffithsin (GRFT)</td><td>Kentucky Bioprocessing</td><td>NA</td><td>hecho a medida, sin número</td></tr><tr><td>de producto Dimethyl Sulfoxide</td><td>Milipore</td><td>317275</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicol sorbitán monolaurato (Polisorbato, Tween 20)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tampón Tris EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>Placas inmuno no estériles de 96 pocillos de fondo plano</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>3355</td><td></td></tr><tr><td>Influenza Hemaglutinina (HA)</td><td>Kentucky Bioprocessing</td><td>NA</td><td>hecho a medida, sin número</td></tr><tr><td>de producto Cabra Anti-GRFT (Anticuerpo primario)</td><td>Kentucky Bioprocessing</td><td>NA</td><td>hecho a medida, sin número de producto</td></tr><tr><td>Conejo anti-cabra IgG-HRP (Anticuerpo secundario)</td><td>Santa Cruz</td><td>2056</td><td></td></tr><tr><td>Sure Blue TMB Microwell Peroxidasa Sustrato</td><td>KPL</td><td>52-00-00</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricación y caracterización de andamios de fibra modificado griffithsin para la prevención de infecciones de transmisión sexual

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Electrospun fibras (EFs) han sido ampliamente utilizadas en una variedad de aplicaciones terapéuticas; sin embargo, sólo recientemente aplicados como una tecnología para prevenir y tratar sexualmente transmitidas (ETS). Además, muchas tecnologías EF se centran en encapsular al agente activo, en relación con la utilización de la superficie para impartir biofunctionality. Aquí se describe un método para fabricar y superficie-modificar poly(lactic-co-glycolic) ácido (PLGA) electrospun fibras, con las lectinas antiviral potente Griffithsin (GRFT). PLGA es un polímero aprobado por la FDA que ha sido ampliamente utilizado en la administración de fármacos debido a sus excelentes propiedades químicas y biocompatibles. GRFT es un natural, potente y seguro lectina que posee actividad amplia contra numerosos virus incluyendo el virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1). Cuando se combinan, las fibras modificadas GRFT han demostrado potente inactivación del VIH-1 en la vitro. Este manuscrito describe los métodos para fabricar y caracterizar EFs GRFT modificado. En primer lugar, PLGA es electrospun crear un andamio de fibra. Las fibras son posteriormente modificado de superficie con GRFT usando 1-etil - 3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y la química de N-hydroxysuccinimide (NHS). Microscopía electrónica de barrido (SEM) se utilizó para evaluar el tamaño y la morfología de las formulaciones de superficie modificada. Además, un gp120 o hemaglutinina (HA)-ELISA de base puede utilizarse para cuantificar la cantidad de GRFT conjugada, así como desorción GRFT desde la superficie de la fibra. Este protocolo puede aplicarse más ampliamente para fabricar fibras que son modificados por la superficie con una variedad de proteínas diferentes.

Morfología de la fibra tiene un efecto significativo en la capacidad de la EFs de superficie modificada para proporcionar protección contra virus. Aunque electrospinning es un procedimiento conveniente y sencillo, formulaciones de polímeros no optimizado pueden resultar en la morfología de la fibra irregular (figura 5B-C). Alteraciones en la condiciones de electrospinning que resultan en la formación de morfologías de estera-como cuentas o am...

Este manuscrito describe el procedimiento para fabricar y caracterizar fibras de electrospun modificado Griffithsin poli (ácido láctico-co-glicólico) que muestran potente actividad adhesiva y antiviral contra la infección por virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 en vitro. Métodos utilizados para sintetizar, modificar superficie, caracterizar la morfología resultante, Conjugación, y se describen desorción de Griffithsin de fibras de superficie modificada.

Fabricación y caracterización de andamios de fibra modificado Griffithsin para la prevención de infecciones de transmisión sexual

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

El objetivo general de este procedimiento es fabricar y modificar la superficie del ácido poliláctico, el ácido co-glicólico, las fibras electrohiladas, con cantidades variables de la proteína antiviral Griffithsina. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la administración de fármacos, como la forma de formular y caracterizar nuevos vehículos de administración que puedan prevenir las infecciones virales de transmisión sexual, como el VIH-1. La principal ventaja de la técnica es que la actividad antiviral de la Griffithsina se maximiza mediante el uso de fibras poliméricas-electrohiladas como andamio estacionario para la Griffithsina altamente localizada en la superficie de la fibra.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de otras infecciones virales y bacterianas, debido al potente potencial profiláctico y terapéutico de Griffithsin contra una variedad de tipos de infecciones. Aunque este método puede proporcionar información sobre la prevención de la infección por VIH-1, también se puede aplicar a otros sistemas, como otras infecciones virales o bacterianas en las que Griffithsin ha demostrado su potencia. Para comenzar este procedimiento, pese 720 miligramos de PLGA 50/50 en un centelleo de 10 mililitros.Con una pipeta de vidrio serológico, agregue 3,0 mililitros de HFIP. Cubra el vil con una película de plástico. Luego, mide y registra la masa vil.Incubar la suspensión de polímero a 37 grados centígrados durante la noche para asegurar la disolución completa del polímero. Después de esto, prepare el aparato de electrospinning como se describe en el protocolo de texto. Use una jeringa de tres mililitros para aspirar la solución de polímero.A continuación, conecte una punta de aguja roma de calibre 18 de 0,5 pulgadas a la jeringa. Dispense el exceso de solución para eliminar el espacio vacío de la cabeza en la aguja. Coloque la jeringa en una bomba de jeringa y ajuste el caudal del instrumento a 2,0 mililitros por hora.Conecte la fuente de alimentación a la aguja de la jeringa. Electrospin la solución de polímero utilizando un voltaje positivo de 27 kilovoltios. Después de que toda la solución esté electrohilada, apague la fuente de alimentación.Deje que el mandril gire durante 30 minutos más, para evaporar completamente el solvente. Luego, apague el colector de mandril giratorio. Con una cuchilla de afeitar, pela suavemente la fibra del mandril.Recoja la fibra de PLGA electrohilada en una placa de Petri etiquetada. Coloque el plato en un desecador durante la noche para eliminar cualquier solvente residual. Para comenzar, prepare las soluciones PBS y MES como se describe en el protocolo de texto.A continuación, retire el EDC y el NHS del congelador. Déjalos reposar para que se equilibren a temperatura ambiente. Después de esto, pese cuatro miligramos de EDC en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Pese seis miligramos de NHS en un tubo de microcentrífuga diferente. Agregue un mililitro de tampón MES a cada tubo. Agite ambos tubos vigorosamente para asegurarse de que los reactivos se disuelvan por completo.Luego, pese 70 miligramos de hidroxilamina en un tubo centrífugo cónico de 50 mililitros. Agregue 20 mililitros de PBS y vórtice. Coloque una cantidad adecuada de fibra PLGA en un tubo de centrífuga cónico de 15 mililitros.Agregue ocho mililitros de tampón MES a la fibra. A continuación, agregue un mililitro de las soluciones EDC y NHS. Use una película de plástico para sellar el tubo de centrífuga cónico de 15 mililitros.Coloque el tubo en un rotador para invertir suavemente la solución durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de esto, agregue 14 microlitros de beta-mercaptoetanol para apagar la reacción. Invierta el tubo varias veces para asegurar una mezcla completa.Deseche el sobrenadante y enjuague la fibra PLGA dos veces usando 10 mililitros de PBS para cada lavado. Agregue una cantidad apropiada de solución madre GRFT al tubo, como se describe en el protocolo de texto. Luego, agregue suficiente PBS para llevar el volumen final a ocho mililitros.Cierre e invierta el tubo para asegurar una mezcla completa. Selle el tubo con una película de plástico. Coloque el tubo en el rotador para invertir suavemente la solución durante dos horas.Después de esto, apague la reacción agregando dos mililitros de la solución de hidroxilamina preparada y agite el vórtice durante 30 segundos. Deseche el sobrenadante. Enjuague la fibra PLGA modificada en la superficie dos veces, usando 10 mililitros de agua ultrapura y vórtice para cada lavado.A continuación, transfiera la fibra lavada a una placa de Petri. Coloque la placa de Petri dentro de un desecador, hasta que la fibra esté completamente seca. A continuación, guarde la placa de Petri a cuatro grados centígrados.Para empezar, coloque tres tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Masa dos miligramos de fibra en cada uno. Luego, agregue un mililitro de DMSO a cada tubo.Vórtice durante un minuto a temperatura ambiente para disolver completamente la fibra. Después de esto, diluya una alícuota de 10 microlitros al menos 100 veces, en tampón TE. Almacenar a menos 20 grados centígrados, hasta cargar la caracterización con Eliza.Pese entre 5 y 10 miligramos de fibra modificada en la superficie y transfiérala a un tubo de microcentrífuga. Registre la masa de fibra colocada en cada tubo. A continuación, agregue un mililitro de una solución que imite el entorno fisiológico de cada muestra.Incubar las muestras en un agitador giratorio a 200 RPM y 37 grados Celsius durante una hora. Después de esto, retire aproximadamente un mililitro de la solución que contiene el GRFT desorbido y alícuota en tubos de racimo. Almacene a menos 20 grados centígrados hasta que esté listo para realizar la cuantificación de proteínas.A continuación, transfiera la muestra a un nuevo tubo de microcentrífuga. Agregue un mililitro de solución tampón fresca e incube hasta el próximo punto de tiempo, como se describe en el protocolo de texto. En este estudio, se examinan las condiciones para la fabricación de fibras electrohiladas PLGA.El análisis SEM de fibras GRFT en blanco, 0,05 nanomoles, 0,5 nanomoles y 5 nanomoles indica que la modificación GRFT no tiene ningún efecto sobre la morfología de las fibras. Se observa que todas las formaciones tienen diámetros promedio similares, alrededor de 1,9 micras, lo que demuestra la consistencia del proceso de fabricación modificado en todos los lotes. A continuación, se determina la cantidad de GRFT conjugado en las fibras electrohiladas.La modificación de 5 nanomoles contiene 373 nanogramos de GRFT, mientras que las modificaciones de 0,5 y 0,05 contienen 165 y 42, respectivamente. Esto demuestra que las fibras conjugadas con una mayor densidad teórica de modificación de la superficie dan como resultado más GRFT conjugado con la fibra. Sin embargo, se puede ver una correlación inversa en la eficiencia de conjugación resultante.A continuación, se evalúa la cantidad de GRFT conjugado covalentemente con la fibra. Dentro de las primeras cuatro horas, se detectan 113 nanogramos, 25 nanogramos y 10 nanogramos de GRFT por miligramo de fibra electrohilada en las concentraciones de modificación teórica de 5 nanomoles, 0,5 nanomoles y 0,05 nanomoles, respectivamente. Después de cuatro horas, se detecta GRFT insignificante en el eluido de liberación para las tres formulaciones.Estos datos indican que la mayor parte del GRFT se une covalentemente a las fibras electrohiladas y que el GRFT absorbido en la superficie se libera dentro de las primeras cuatro horas. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente cuatro días. El electrohilado del andamio de fibra polimérica requiere dos días para preparar la solución polimérica y electrospinar.Mientras que la modificación de la superficie, el secado posterior y la caracterización de las fibras requirieron al menos dos días adicionales. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las proporciones adecuadas de reactivos para garantizar una modificación óptima. Además, también es importante verificar que los parámetros de electospinning sean correctos para garantizar una morfología de fibra adecuada.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la administración de fármacos fabricaran fibras electrohiladas, que no solo encapsulan agentes antivirales dentro de la fibra, sino que tienen la capacidad de conjugar agentes activos a través de la superficie de la fibra. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo electroespender la fibra polimérica, realizar la modificación de la superficie de la fibra con la proteína antiviral Griffithsin, y la Griffithsina cualitativa conjugada con la fibra. No olvide que trabajar con reactivos como HFIP, beta-mercaptoetanol, EDC y NHS puede ser extremadamente peligroso.Siempre se deben tomar precauciones, como la aplicación adecuada de EPP y el uso de campanas extractoras químicas, al realizar este procedimiento.

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Bioengineering

Bioingeniería

El proceso de electrospinning polímeros de ingeniería de tejidos y cultivos celulares se trata en este artículo. En concreto, el electrospinning de macrómeros fotorreactivos con capacidades de procesamiento adicional de photopatterning y electrospinning multi-polímero se describe.

Electrospinning andamios fibroso polímero para ingeniería de tejidos y cultivos celulares

Andamios electrospun puede ser procesado post-producción para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Aquí se describen los métodos para hacer girar los andamios complejos (por hilado consecutivos), para la fabricación de andamios más gruesas (por el multi-capas usando calor o recocido de vapor), para lograr la esterilidad (la producción aséptica o esterilización de la post-producción) y para la consecución de adecuadas propiedades biomecánicas.

Postproducción de procesamiento de las Fibras electrospun de Ingeniería de Tejidos

A pesar de las excelentes propiedades mecánicas y bioquímicas de las sedas de araña, este material no pueden ser cosechadas en grandes cantidades por medios convencionales. A continuación se describe una estrategia eficiente para hacer girar las fibras artificiales de seda de araña, que es un proceso importante para los investigadores que estudian la producción de seda de araña y su uso como la próxima generación de biomateriales.

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Los nanosensores sol-gel biocompatibles que responden al pH se pueden incorporar en andamios electrohilados de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA). Los andamios autoinformados producidos se pueden utilizar para el monitoreo in situ de las condiciones microambientales mientras se cultivan células en el andamio. Esto es beneficioso ya que la construcción celular 3D se puede monitorear en tiempo real sin perturbar el experimento.

Los andamios de autoinforme para el 3-Dimensional Cultivo Celular

Este protocolo combina electrospinning y microesferas para desarrollar andamios de ingeniería tisular para dirigir neuronas. El factor de crecimiento nervioso se encapsuló dentro de microesferas de PLGA y se electrohiló en andamios fibrosos de ácido hialurónico (HA).  La bioactividad proteica se probó sembrando los andamios con ganglios primarios de la raíz dorsal del pollito y cultivando durante 4-6 días.

Factor de Crecimiento de electrospinning Liberar microesferas en Fibrosa andamios

A continuación, presentamos un protocolo para fabricar nanofibras andamios electrospun con organización gradated de fibras y explorar sus aplicaciones en la regulación de la morfología celular / orientación. Gradientes con respecto a las propiedades físicas y químicas de las nanofibras andamios ofrecen una amplia variedad de aplicaciones en el campo biomédico.

Electrospun nanofibras andamios con gradaciones en Organización de fibra

Los andamios para la ingeniería de tejidos necesitan recapitular el complejo microambiente bioquímico y biofísico del nicho celular. Aquí, mostramos el uso de fibras de complejación de polielectrolitos interfaciales como plataforma para crear andamios poliméricos compuestos de múltiples componentes con liberación bioquímica sostenida.

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Se presenta un protocolo para el spinning de microfluidos y caracterización de la microestructura de monofilamento de fibroína de seda regenerado.

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Aquí hay un protocolo para crear andamios de alginato macroporoso seco que median la transferencia eficiente de genes virales para su uso en ingeniería genética de células T, incluidas las células T para la terapia de células CAR-T. Se demostró que los andamios transducen células T primarias activadas con una transducción del &gt;85%.

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Los insertos de cultivo de tejidos con membranas de plástico son el estándar de oro en los laboratorios de cultivo celular como soportes permeables para establecer capas celulares y modelos de tejidos de barrera. En este artículo, presentamos un método simple para reemplazar la membrana de plástico con una membrana biológicamente más relevante hecha de una proteína de seda de araña funcionalizada recombinante.

Membrana basal nanofibrilar imitadora hecha de seda de araña funcionalizada recombinante en insertos de cultivo de tejidos hechos a medida

Aprende a fabricar y modificar fibras electrohiladas de PLGA con Griffithsin para sistemas de liberación de fármacos antivirales contra VIH-1. Este método maximiza la actividad antiviral mediante la conjugación superficial de la proteína.

Fabricación y caracterización de andamios de fibra modificado Griffithsin para la prevención de infecciones de transmisión sexual (Video) | JoVE Journal

Fabricación y caracterización de andamios de fibra modificado Griffithsin para la prevención de infecciones de transmisión sexual

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