Síntesis y evaluación de un inhibidor de la absorción de calcio mitocondrial basado en rutenio
26 de octubre de 2017
Se presenta un protocolo para la síntesis, purificación y caracterización de un inhibidor basado en rutenio de la absorción de calcio mitocondrial. Un procedimiento para evaluar su eficacia en células de mamífero permeabilized está demostrado.
El objetivo general de la síntesis y purificación es producir con relativa facilidad un análogo de rutenio 360 utilizado en ensayos de absorción de calcio mitocondrial que sea 10 veces más eficaz que el rutenio 360 disponible comercialmente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del calcio mitocondrial al proporcionar un inhibidor puro de la absorción de calcio mitocondrial. La principal ventaja de esta técnica es que el producto final es a la vez muy potente y puro.
Las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque la purificación requiere tiempo y paciencia. La demostración del productor estará a cargo de Sarah Nathan, una estudiante graduada de mi laboratorio. Comience este procedimiento con la síntesis de dicloruro de pentaammina cloro rutenio como se describe en el protocolo de texto.
Disolver 100 miligramos de dicloruro de clororutenio pentaammina en 50 mililitros de una solución de hidróxido de amonio molar en un matraz de fondo redondo de 200 mililitros. Tape sin apretar el matraz con un tapón de vidrio y caliente la mezcla de reacción a 75 grados centígrados durante seis horas. Calentar un recipiente sellado da como resultado una acumulación de presión.
Asegúrese de que el tapón de vidrio esté suelto para permitir la liberación del exceso de presión. Después de seis horas, retire la mezcla de reacción del fuego. Y revuelva a temperatura ambiente durante cuatro días para obtener una solución de color verde oscuro.
Para purificar el pentacloruro de dirutenio mu-oxo dirutenio octo octamina trans-diaqua resultante, primero suspenda cinco gramos de resina de intercambio catiónico de malla en 10 mililitros de HCL 0,1 molar en un vaso de precipitados de 25 mililitros. Cargue esta suspensión en una columna de 10 mililitros fijada con un depósito de solvente de 50 mililitros. Lave la resina con aproximadamente 20 a 30 mililitros de HCL 0,1 molar hasta que el eluido sea incoloro.
A continuación, agregue HCL concentrado a la solución de reacción verde previamente aislada para ajustar el PH a dos, momento en el que el color de la solución cambia a marrón. Cargue esta solución acidificada en la columna de resina de intercambio catiónico pipeteándola suavemente sobre la resina. Deje que el eluido se drene por completo y continúe cargando la solución.
Repita este proceso hasta que se haya agregado toda la solución. La parte superior de la resina será de color marrón oscuro o negro. La resina disminuirá ligeramente de volumen.
A continuación, cubra la parte superior de la resina con perlas de vidrio para evitar que la resina se altere cuando se añadan nuevas soluciones. Eluir la columna con 20 mililitros de HCL molar. A continuación, eluir la columna con 50 mililitros de una concentración aumentada de HCL de 1,5 molar.
Una solución amarilla comenzará a desprenderse de la columna. A continuación, aumente la concentración de HCL a dos molares y continúe eluyendo con 150 a 200 mililitros. El eluyente comenzará como un amarillo muy pálido y pasará a un amarillo brillante.
Espere hasta que el eluyente que sale de la columna vuelva a estar muy pálido. La paciencia es fundamental en este paso. El eluyente debe ser muy pálido.
Aumente aún más la concentración de HCL a 2,5 molar. Recoja el eluyente en fracciones en tubos de ensayo. Finalmente aumentar la concentración a tres molares de HCL.
El producto se eluirá de la columna como una solución de color marrón verdoso. Una fracción de color marrón rojizo también puede comenzar a desprenderse de la columna. Estas fracciones son impurezas de color marrón rutenio y no deben agruparse con las fracciones de color marrón verdoso.
Para analizar todas las fracciones mediante espectroscopia UV-Vis, agregue 100 microlitros de una fracción dada a dos mililitros de amoníaco de tres molares. A continuación, analice la mezcla mediante espectroscopía UV-Vis. Las fracciones que contengan producto puro tendrán una banda de absorbancia grande a 360 nanómetros y una absorbancia menos intensa a 600 nanómetros.
La absorbancia a 480 nanómetros es indicativa de rutenio marrón y la absorbancia a 533 nanómetros representa las impurezas del rojo rutenio. Otras impurezas se observan con una absorbancia de menos de 300 nanómetros. Las fracciones de la piscina contienen producto puro y evaporan la solución hasta la sequedad por evaporación rotativa antes del análisis de la muestra en estado sólido por espectroscopía IR.
Proceda a evaluar la inhibición de la absorción de calcio mitocondrial mediante espectroscopia fluorescente como se detalla en el protocolo de texto. Los espectros UV-Vis del pentacloruro de dirutenio mu-oxo dirutenio purificado se caracterizan por las absorciones mayores y menores a 360 nanómetros y 600 nanómetros respectivamente. Por el contrario, una mezcla impura muestra bandas de absorción a 533 nanómetros de las impurezas rojas de rutenio y a 275 a 300 nanómetros del material de partida.
La caracterización del estado sólido mediante espectroscopia infrarroja tiene los tramos esperados de las aminas. Así como el tramo de rutenio, oxígeno, rutenio, a 850 centímetros inversos. Las células HeLa permeabalizadas tratadas con un colorante fluorescente sensible al calcio y pentacloruro de dirutenio mu-oxo dirutenio octo trans-diaqua muestran inhibición de la absorción de calcio en las mitocondrias.
Al intentar el procedimiento, es importante recordar que debe permitir que las fracciones se eluyan por completo. La paciencia producirá un producto puro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar, purificar y caracterizar este potente análogo de rutenio 360.
Los niveles de calcio mitocondrial regulan una amplia gama de procesos intercelulares, incluyendo la bioenergética y la muerte celular controlada. El inhibidor producido a partir de este método se puede aplicar en estudios para comprender el papel de la biología del calcio mitocondrial en la mediación de otros procesos biológicos. No olvide que trabajar con ácidos y bases concentrados es corrosivo y siempre se deben tomar precauciones como el uso de EPP adecuado al realizar este procedimiento.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para sintetizar, purificar y caracterizar un inhibidor basado en rutenio de la captación mitocondrial de calcio. El método tiene como objetivo producir un análogo más eficaz para su uso en ensayos de captación mitocondrial de calcio.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Bioquímica
- Biología mitocondrial
Antecedentes
- La síntesis se centra en un análogo de rutenio 360.
- Se diseñó este análogo para que sea 10 veces más eficaz que las opciones existentes.
- Comprender la captación mitocondrial de calcio es crucial para la función celular.
- El proceso de purificación es lento y requiere paciencia.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un inhibidor puro y potente para la captación de calcio mitocondrial.
- Facilitar la investigación en biología del calcio mitocondrial.
- Mejorar la eficacia de los ensayos mitocondriales existentes.
Métodos Utilizados
- Síntesis de pentaamminclororutenio dicloruro.
- Purificación del compuesto sintetizado.
- Caracterización de la eficacia del inhibidor.
- Evaluación en células de mamífero permeabilizadas.
Resultados principales
- El análogo de rutenio sintetizado demostró una alta potencia.
- La purificación produjo un producto puro adecuado para ensayos.
- El método es efectivo para estudios de captación mitocondrial de calcio.
- Los resultados indican mejoras significativas respecto a las opciones disponibles comercialmente.
Conclusiones
- Este protocolo ofrece un método confiable para producir un inhibidor potente de la captación de calcio mitocondrial.
- Puede mejorar las capacidades de investigación en biología mitocondrial.
- Estudios futuros podrían basarse en este método para explorar aplicaciones adicionales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la producción de un inhibidor potente y puro basado en rutenio para la captación mitocondrial de calcio, abordando una necesidad crítica de herramientas confiables en estudios de validación de dianas y mecanísticos. Al proporcionar un compuesto 10 veces más eficaz que los análogos existentes, respalda la confianza predictiva en flujos de trabajo tempranos de descubrimiento centrados en la disfunción mitocondrial. El enfoque mejora la reproducibilidad de ensayos y la evaluación de compuestos en sistemas relevantes para enfermedades, impactando directamente en la identificación de compuestos líderes y en estrategias de reducción de riesgos preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la homeostasis del calcio mitocondrial como diana terapéutica en las vías de neurodegeneración y muerte celular.
- Valor operativo: Proporciona un inhibidor puro y bien caracterizado para ensayos consistentes de interacción con el blanco.
- Valor predictivo: Apoya el cribado basado en hipótesis al reducir los efectos fuera de blanco provocados por compuestos impuros.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Genera un inhibidor validado adecuado para ensayos de captación de calcio mitocondrial basados en fluorescencia en células permeabilizadas.
- Resultado cuantitativo: Permite la medición precisa de la inhibición mediante lecturas de UV-Vis y fluorescencia a 360 nm y 600 nm.
- Reproducibilidad: La purificación estandarizada mediante cromatografía de intercambio catiónico asegura consistencia entre lotes para campañas de cribado.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Sistema relevante para la enfermedad: Aplicable en células HeLa permeabilizadas para modelar la disfunción mitocondrial en cáncer y trastornos neurodegenerativos.
- Reducción mecanicista de riesgos: Clarifica los efectos sobre el blanco de la modulación del calcio mitocondrial en perfiles de seguridad preclínicos.
- Continuidad traslacional: Conecta la validación del blanco con ensayos funcionales en modelos con relevancia patofisiológica.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en la fase inicial del descubrimiento, apoyando la validación del blanco mediante la interrogación mecanicista del flujo de calcio mitocondrial antes de los esfuerzos de identificación de compuestos líderes.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la validación funcional del unificador de calcio mitocondrial como diana al permitir su inhibición específica en ensayos en células vivas.
- Tamizaje: Proporciona un compuesto puro para la evaluación con alta confianza de moduladores en ensayos de flujo de calcio mitocondrial.
- Análisis: Ofrece firmas espectroscópicas claras (picos a 360 nm y 600 nm) para el control de calidad y la evaluación de la pureza del compuesto.
- Investigación Traducional: Asegura la continuidad desde el descubrimiento de la diana hasta la evaluación preclínica, garantizando la pureza y potencia del inhibidor en modelos de enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable de síntesis y purificación para generar sondas dirigidas a mitocondrias en múltiples proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios de calcio mitocondrial mediante la disponibilidad de un inhibidor puro y de alta potencia.
- Valor operativo: Permite la producción a escala mediante cromatografía de intercambio catiónico con métricas definidas de control de calidad (UV-Vis a 360/600 nm).
- Valor estratégico: Mejora la confianza en las decisiones de avance o interrupción al minimizar los falsos positivos derivados de compuestos impuros en la validación del blanco.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de blancos mitocondriales mediante compuestos herramienta preclínicos confiables.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en síntesis inorgánica y manipulación de complejos de rutenio sensibles al aire en condiciones básicas.
- Exige acceso a sistemas de cromatografía de intercambio catiónico, espectroscopía UV-Vis e IR para la purificación y caracterización.
- Necesita estandarización entre equipos para los criterios de agrupamiento de fracciones basados en la pureza espectroscópica (evitando impurezas a 480 nm y 533 nm).
- Implica consideraciones de adaptación para su uso en diversos tipos de células permeabilizadas más allá de las HeLa, requiriendo validación empírica.
- Incluye limitaciones prácticas, como el tiempo prolongado de purificación (más de 4 días de agitación) y la necesidad de gestión de presión durante la síntesis con calentamiento.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
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Title
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Synthesis of [(OH2)(NH3)4Ru(μ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5
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Characterization and Verification of Purity of [(OH2)(NH3)4Ru(μ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5
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Results: Purified [(OH2)(NH3)4Ru(μ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5 as a Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor
6:20
Conclusion
