Síntesis y evaluación de un inhibidor de la absorción de calcio mitocondrial basado en rutenio

El objetivo general de la síntesis y purificación es producir con relativa facilidad un análogo de rutenio 360 utilizado en ensayos de absorción de calcio mitocondrial que sea 10 veces más eficaz que el rutenio 360 disponible comercialmente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del calcio mitocondrial al proporcionar un inhibidor puro de la absorción de calcio mitocondrial. La principal ventaja de esta técnica es que el producto final es a la vez muy potente y puro.

Las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque la purificación requiere tiempo y paciencia. La demostración del productor estará a cargo de Sarah Nathan, una estudiante graduada de mi laboratorio. Comience este procedimiento con la síntesis de dicloruro de pentaammina cloro rutenio como se describe en el protocolo de texto.

Disolver 100 miligramos de dicloruro de clororutenio pentaammina en 50 mililitros de una solución de hidróxido de amonio molar en un matraz de fondo redondo de 200 mililitros. Tape sin apretar el matraz con un tapón de vidrio y caliente la mezcla de reacción a 75 grados centígrados durante seis horas. Calentar un recipiente sellado da como resultado una acumulación de presión.

Asegúrese de que el tapón de vidrio esté suelto para permitir la liberación del exceso de presión. Después de seis horas, retire la mezcla de reacción del fuego. Y revuelva a temperatura ambiente durante cuatro días para obtener una solución de color verde oscuro.

Para purificar el pentacloruro de dirutenio mu-oxo dirutenio octo octamina trans-diaqua resultante, primero suspenda cinco gramos de resina de intercambio catiónico de malla en 10 mililitros de HCL 0,1 molar en un vaso de precipitados de 25 mililitros. Cargue esta suspensión en una columna de 10 mililitros fijada con un depósito de solvente de 50 mililitros. Lave la resina con aproximadamente 20 a 30 mililitros de HCL 0,1 molar hasta que el eluido sea incoloro.

A continuación, agregue HCL concentrado a la solución de reacción verde previamente aislada para ajustar el PH a dos, momento en el que el color de la solución cambia a marrón. Cargue esta solución acidificada en la columna de resina de intercambio catiónico pipeteándola suavemente sobre la resina. Deje que el eluido se drene por completo y continúe cargando la solución.

Repita este proceso hasta que se haya agregado toda la solución. La parte superior de la resina será de color marrón oscuro o negro. La resina disminuirá ligeramente de volumen.

A continuación, cubra la parte superior de la resina con perlas de vidrio para evitar que la resina se altere cuando se añadan nuevas soluciones. Eluir la columna con 20 mililitros de HCL molar. A continuación, eluir la columna con 50 mililitros de una concentración aumentada de HCL de 1,5 molar.

Una solución amarilla comenzará a desprenderse de la columna. A continuación, aumente la concentración de HCL a dos molares y continúe eluyendo con 150 a 200 mililitros. El eluyente comenzará como un amarillo muy pálido y pasará a un amarillo brillante.

Espere hasta que el eluyente que sale de la columna vuelva a estar muy pálido. La paciencia es fundamental en este paso. El eluyente debe ser muy pálido.

Aumente aún más la concentración de HCL a 2,5 molar. Recoja el eluyente en fracciones en tubos de ensayo. Finalmente aumentar la concentración a tres molares de HCL.

El producto se eluirá de la columna como una solución de color marrón verdoso. Una fracción de color marrón rojizo también puede comenzar a desprenderse de la columna. Estas fracciones son impurezas de color marrón rutenio y no deben agruparse con las fracciones de color marrón verdoso.

Para analizar todas las fracciones mediante espectroscopia UV-Vis, agregue 100 microlitros de una fracción dada a dos mililitros de amoníaco de tres molares. A continuación, analice la mezcla mediante espectroscopía UV-Vis. Las fracciones que contengan producto puro tendrán una banda de absorbancia grande a 360 nanómetros y una absorbancia menos intensa a 600 nanómetros.

La absorbancia a 480 nanómetros es indicativa de rutenio marrón y la absorbancia a 533 nanómetros representa las impurezas del rojo rutenio. Otras impurezas se observan con una absorbancia de menos de 300 nanómetros. Las fracciones de la piscina contienen producto puro y evaporan la solución hasta la sequedad por evaporación rotativa antes del análisis de la muestra en estado sólido por espectroscopía IR.

Proceda a evaluar la inhibición de la absorción de calcio mitocondrial mediante espectroscopia fluorescente como se detalla en el protocolo de texto. Los espectros UV-Vis del pentacloruro de dirutenio mu-oxo dirutenio purificado se caracterizan por las absorciones mayores y menores a 360 nanómetros y 600 nanómetros respectivamente. Por el contrario, una mezcla impura muestra bandas de absorción a 533 nanómetros de las impurezas rojas de rutenio y a 275 a 300 nanómetros del material de partida.

La caracterización del estado sólido mediante espectroscopia infrarroja tiene los tramos esperados de las aminas. Así como el tramo de rutenio, oxígeno, rutenio, a 850 centímetros inversos. Las células HeLa permeabalizadas tratadas con un colorante fluorescente sensible al calcio y pentacloruro de dirutenio mu-oxo dirutenio octo trans-diaqua muestran inhibición de la absorción de calcio en las mitocondrias.

Al intentar el procedimiento, es importante recordar que debe permitir que las fracciones se eluyan por completo. La paciencia producirá un producto puro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar, purificar y caracterizar este potente análogo de rutenio 360.

Los niveles de calcio mitocondrial regulan una amplia gama de procesos intercelulares, incluyendo la bioenergética y la muerte celular controlada. El inhibidor producido a partir de este método se puede aplicar en estudios para comprender el papel de la biología del calcio mitocondrial en la mediación de otros procesos biológicos. No olvide que trabajar con ácidos y bases concentrados es corrosivo y siempre se deben tomar precauciones como el uso de EPP adecuado al realizar este procedimiento.