Name: Síntesis y evaluación de un inhibidor de la absorción de calcio mitocondrial basado en rutenio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Aprende a sintetizar y purificar un análogo de rutenio 360 diez veces más potente que el comercial para inhibir la absorción de calcio mitocondrial. Este método mejora los ensayos de biología mitocondrial.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta investigación fue apoyada por la Universidad de Cornell. Este trabajo hizo uso del centro de Cornell para materiales comparten instalaciones de investigación, que son apoyadas a través del programa NSF MRSEC (Grant DMR-1120296). S.R.N. reconoce apoyo de una beca de investigación postgrado en NSF (Grant DGE - 1650441) y el Dr. Dave Holowka para obtener ayuda con los experimentos de calcio. Cualquier opinión, resultados y conclusiones o recomendaciones expresadas en este material son las de los autores (s) y no reflejan necesariamente las opiniones de la National Science Foundation.

Nota: ácidos concentrados y bases se utilizan en esta síntesis. Utilizar todas las prácticas de seguridad apropiadas cuando se realiza la reacción entre el uso de controles de ingeniería (campana extractora) y equipo de protección personal (EPP) incluyendo gafas de seguridad, guantes, bata, pantalón largo y zapatos cerrados.
 1. preparación de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (μ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 <ol><li>síntesis de [Ru (NH 3) 5 Cl] Cl 2 12 <ol><li>disolver 1.00 g de RuCl 3 · n H 2 O (40% Ru por peso, 4,1 mmol) en 5 mL de H 2 O. enfríe la solución marrón oscurezca a 0 ° C en un baño de hielo. Agregar 11 mL (0,23 mol) de solución de hidrato de hidracina de 80% en forma de gota a gota. La reacción inicial será vigorosa con el gas de la evolución, lo que resulta en una solución de color marrón. Deje que la solución resultante a agitar a temperatura ambiente durante 16 h; la solución final será rojo oscuro 
		PRECAUCIÓN: La hidracina es agudo tóxico y cancerígeno. Además, las formas anhidras de este reactivo son explosivas. Como siempre, usar campanas apropiadas de PPE y humo al manejar. No concentre estas soluciones sequedad.</li>
		<li>a esta solución, agregar aproximadamente 5-10 mL de ácido clorhídrico concentrado para ajustar el pH a 2. En este punto, la solución será amarillo-marrón en color.</li>
		<li>De calor esta solución a 105 ° C removiendo durante 1-2 h. Precipita un sólido amarillo de la solución. Cuando no más visiblemente precipitan formas, retirar del fuego.</li>
		<li>Permite la mezcla de reacción se enfríen a temperatura ambiente y luego colocar en un baño de hielo de 0 ° C por 10 minutos recoge el amarillo sólido por filtración de vacío y lavado con 5 mL de etanol y éter dietílico.</li>
		<li>Disolver totalmente el producto crudo en 15-25 mL de agua caliente. Enfriar 10 mL de una solución concentrada de HCl en un matraz de filtración al colocarlo en un baño de hielo. Filtrar la solución amarilla en la solución de ácido clorhídrico fría para inducir la precipitación de un sólido puro amarillo pálido. Este precipitado de filtro y lavar con 5 mL de HCl 0,5 M, etanol y éter.</li>
		<li>Caracterizar el compuesto usando espectroscopía de IR. Verificar la pureza de la identificación de frecuencias de estiramientos de 3226 cm -1, 1604 cm -1, cm 1297 -1 y 801 cm -1. Una impureza menor común en 2069 cm -1 se asigna a [5 N Ru (NH 3) 2] Cl 3.</li>
	</ol></li> <li>Síntesis de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (μ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 <ol><li>disolver 100 mg (0.34 mmol) [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 en 50 mL de 1 M NH 4 OH en un recipiente de presión esférico de fondo redondo de pared gruesa de 200 mL. Libremente tapa el matraz con un tapón y la mezcla de reacción a 75 ° C por 6 h. Retire del calor y agitar a temperatura ambiente durante 4 días producir una solución verde oscurezca. 
		¡PRECAUCIÓN! Resultados de un recipiente sellado en una acumulación de la presión de la calefacción. Asegúrese de utilizar material de vidrio de seguridad de presión apropiado. Para esta reacción, el propósito de sellar el recipiente es minimizar la pérdida de gases NH 3. Por lo tanto, poner el tapón sin apretar para permitir la liberación de exceso de presión.</li>
	</ol></li> <li>Purificación por cromatografía de intercambio catiónico <ol><li>en un vaso de precipitados de 25 mL, suspender g 5-resina de intercambio catiónico (p. ej., Dowex 50WX2 200-400 mallas (forma de H +) en 10 mL de 0.1 M HCl.</li>
		<li>De carga esta mezcla en una columna de 10 mL (10 mm de diámetro, 15 cm altura) con un depósito de disolvente 50 mL. Lavar la resina con aproximadamente 20-30 mL de 0.1 M HCl, hasta que el efluente quede descolorido.</li>
		<li>Volver a la solución de reacción verde aislada en paso 1.2.1. A esta solución, Añadir ácido clorhídrico concentrado para ajustar el pH a 2, momento en el que el color de la solución cambia a marrón.</li>
		<li>De carga esta solución acidificada a la columna de resina de intercambio catiónico preparada en el paso 1.3.2 transfiriendo suavemente encima de la resina. Que el efluente completamente drenar y seguir cargando la solución. Repita este proceso hasta que se ha agregado la solución completa. La parte superior de la resina será marrón oscuro/negro. La resina se reducirá en volumen un poco.</li>
		<li>Perlas de vidrio de uso para cubrir la parte superior de la resina. Estos evitará la resina ser molestado cuando se agregan nuevas soluciones.</li>
		<li>Eluir la columna con 20 mL de 1 M de HCl.</li>
		<li>Eluir la columna con una concentración elevada de ácido clorhídrico de 1,5 M (&#8776; 50 mL). Una solución amarilla comenzará a salir de la columna. Aumentar la concentración de HCl 2 m y continuar liberador hasta que el efluente quede descolorido o un verde muy pálido-amarillo. Será necesario para este proceso un volumen total de 150-200 mL.</li>
		<li>Aumentar la concentración de ácido clorhídrico a 2.5 M (20-50 mL). Recoger el eluido como fracciones en tubos de ensayo. Aumentar a 3 M de HCl. El producto se procederá a la elución de la columna como una solución verde marrón. Una fracción de rojo marrón también puede comenzar a venir de la columna. Ya que estas fracciones son las impurezas oxidadas rutenio rojo, no piscina con las fracciones marrón verde.</li>
	</ol></li> <li>Caracterización y verificación de pureza de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (μ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 <ol><li>probarlas de las fracciones de Paso 1.3.8. por espectroscopía UV-vis. Para realizar esta tarea, añada 100 μl de una fracción dada en 2 mL de 3 M de NH3 y análisis por espectroscopía UV-vis. Fracciones que contiene el producto puro tendrá una banda de gran absorbancia a 360 nm y una menos intensa absorbancia a 600 nm. Absorbancia a 480 o 533 nm es indicativa de rojo oxidado rutenio e impurezas de rutenio rojo, respectivamente.</li>
		<li>Fracciones con puro producto de la piscina y evaporar la solución hasta la sequedad por evaporación rotatoria. El producto estará aislado como un sólido verde marrón. Los rendimientos son típicamente del orden de 5-15 mg (10-20% de rendimiento). Monocristales, convenientes para la difracción de rayos x, pueden obtenerse por la difusión de vapor de etanol en soluciones acuosas de los compuestos.</li>
		<li>Para verificar pureza, analizar el compuesto por espectroscopía UV-vis en solución salina con tampón fosfato de pH 7,4 (PBS). Pureza puede evaluarse tomando el cociente de la intensidad de los 360 nm y 600 nm picos. Esta relación es de 31, para un compuesto puro. Compuestos impuros, el cociente será menor.</li>
		<li>Análisis de la muestra en el estado sólido por espectroscopia IR. Bandas de diagnóstico están en 3234 cm -1 cm 3151 -1, 1618 cm -1, cm 1313 -1 y 815 cm -1. Se observan bandas de impureza común en 1762 cm -1 y 1400 cm -1, característico de NH 4 cl. rutenio rojo puede ser identificado por bandas en 1404 cm -1, 1300 cm -1, 1037 cm -1 y 800 cm -1.</li>
	</ol></li> <li>Evaluación de la inhibición de la absorción de calcio mitocondrial por espectroscopia de fluorescencia PRECAUCIÓN! Los siguientes procedimientos utilizan células de mamíferos. Trabajo debe ser llevado a cabo en campanas de flujo laminar adecuadas que están certificadas para la seguridad biológica de nivel 2 (BSL2) investigación. 
	&#8203; Nota: [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (μ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 hará referencia a como [Ru] en esta sección <ol><li>hacer tamponado que contiene glucosa solución salina (BGSS) como los medios de ensayo. BGSS es una solución que comprende 110 mM KCl 1 m m KH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido ácido (HEPES), succinato de sodio de 5 mM, 30 μm glicol de etileno-bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N &#39;, N &#39;-ácido tetraacético (EGTA). Combine todo, excepto el EGTA, ajustar el pH a 7,4. Añade EGTA y vuelva a ajustar pH a 7.4. Para 50 mL de medio de ensayo añada 0,5 mL de glucosa 1 mg/mL.</li>
		<li>Cultura HeLa células en cajas Petri de 2 500 cm en Dulbecco &#39; s medio de Eagle modificado (DMEM) con 10% suero fetal bovino (FBS) en una incubadora humidificada con 5% CO 2 en 37 ° C. amplificar las células HeLa crecen en una placa de Petri de 100 mm por la siembra ellos en un plato de petri 500 cm 2. El volumen total de los medios de comunicación en el plato grande es de 115 mL. Cada plato grande producirá células de 18 millones aproximadamente, suficiente para dos experimentos de espectroscopia de fluorescencia.
		<ol><li>Crecer las células hasta llegar a 90-95% confluency. Retire los medios de comunicación y lavar las células con PBS pH 7,4 de 15 mL. Añadir 15 mL de ácido de 1 mM etilendiaminotetracético (EDTA) en PBS e incubar durante 10 minutos separar las células. Transferir las células a 14 mL fondo Halcón tubos redondos</li></ol></li> <li>contar las células con un microscopio invertido trypan azul y un hemocitómetro y calcular el número total de células y el volumen de los medios necesarios para llegar a 7,5 millones de células por volumen de 1.8 mL del medio. Centrifugar las células 10 min a 5310 x g. decantar el sobrenadante y agregar el volumen calculado de BGSS. Resuspender suavemente las células.
		<ol><li>Para este ensayo, preparación de soluciones stock de digitonin de 40 mM en dimetil sulfóxido (DMSO), 1 mM de calcio verde-5N en H 2 O y 10 mM CaCl 2 en H 2 O. [Ru] soluciones, preparadas en agua pura, puede variar de 1-3 mM. 
			&#8203; Nota: calcio verde-5N es sensible a la luz. Almacenar en la oscuridad y minimizar la exposición a la luz.</li>
		</ol></li> <li>Configurar el Fluorímetro para excitar en 506 nm y leer la emisión en 532 nanómetro con el portacubetas controlado a 37 ° C. preparar una cubeta de acrílico con una barra de agitación o rueda, suspensión de la célula de 1,8 mL de 1.5.2 arriba, solución de digitonin μL 1.8, 3.6 y #181; L calcio verde-5N (solución) y 9 μl [Ru] (para solución stock de 1 mM, concentración final de 5 μm). Incube las células durante 15 min en el Fluorímetro.
		<ol><li>Lee los datos como la proporción de excitación/emisión en lugar de la absorción de materia prima. Esta práctica minimiza los errores asociados con las fluctuaciones en la intensidad de la fuente de luz.</li>
			<li>Llevar a cabo el primer análisis de la muestra en la ausencia de [Ru] para medir el efecto de la adición de CaCl 2 en la respuesta de las células.</li>
			<li>Análisis de comenzar en el Fluorímetro con los ajustes descritos en 1.5.4. Espere aproximadamente 2 minutos para establecer una línea base de emisión estable y luego agregar 1.8 μl de CaCl 2 (concentración final de 10 μm). La intensidad de emisión aumentará inmediatamente a la adición de CaCl 2 y luego se desvanecerán en el transcurso de minutos como los iones de calcio entrar en la mitocondria. Espere hasta que haya terminado el decaimiento (&#8776; 5 min). Añadir bolos de calcio adicional para determinar la respuesta de la absorción de calcio mitocondrial de las células no tratadas con [Ru].</li>
		</ol></li> <li>En otra cubeta que contiene 5 μm [Ru], repite el experimento tal como se describe arriba en 1.5.4.3. En presencia de inhibidor de la intensidad de emisión aumentan, pero no decae. Esta observación significa que bloquea la absorción de calcio mitocondrial.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enjoy+the+trip%3A+Calcium+in+mitochondria+back+and+forth%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth.</a> Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).</li>
<li>Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+the+calcium+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: the calcium connection.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).</li>
<li>Giorgi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+homeostasis+as+potential+target+for+mitochondrial+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine.</a> Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).</li>
<li>De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+forty-kilodalton+protein+of+the+inner+membrane+is+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).</li>
<li>Baughman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+identifies+MCU+as+an+essential+component+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).</li>
<li>Kamer, K. J., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+era+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).</li>
<li>Ying, W. -L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mitochondrial+calcium+ion+transport+by+an+oxo-bridged+dinuclear+ruthenium+ammine+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex.</a> Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).</li>
<li>Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -L., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/244437951_The_component_of_ruthenium_red_responsible_for_inhibition_of_mitochondrial_calcium_ion_transport_Spectra_electrochemistry_and_aquation_kinetics_Crystal_structure_of_m-O-HCO2NH34Ru2Cl_3">The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3.</a> J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).</li>
<li>Matlib, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-bridged+Dinuclear+Ruthenium+Amine+Complex+Specifically+Inhibits+Ca2%2B+Uptake+into+Mitochondria+in+Vitro+and+in+Situ+in+Single+Cardiac+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes.</a> J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).</li>
<li>Oxenoid, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Architecture of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).</li>
<li>Nathan, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Methods+for+the+Preparation+of+a+Functional+Analogue+of+Ru360%2C+a+Potent+Inhibitor+of+Mitochondrial+Calcium+Uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake.</a> Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).</li>
<li>Allen, A. D., Senoff, C. V. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/v67-220#.WW5AYYjyvIU">Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III).</a> Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).</li>
<li>Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).</li>
<li>Deak, A. T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25631032">Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake.</a> Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

Captación mitocondrial de calcio inhibidor [(OH2) (NH3)4Ru Ru (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 puede ser sintetizada de [Ru (NH3)5Cl] Cl2, una conocida rutenio a partir de material, como se describe en este procedimiento. La síntesis de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 se logra fácilmente con poca dificultad. Después de revolver RuCl3 por 16 h en la hidracina hidrato, el pH de la solución debe ...

El calcio mitocondrial es un regulador clave de una serie de procesos que son críticos para la función normal de la célula, incluyendo la apoptosis y la producción de energía. 1 , 2 , 3 el calcio mitocondrial uniporter (MCU), una proteína del transportador de iones que reside en la membrana mitocondrial interna, regula el flujo de iones calcio en las mitocondrias. 4 , 5 , 6 inhibidores químicos de la MCU son herramientas valiosas para continuar los esfuerzos para estudiar la función y funciones celulares de esta proteína de transporte y de calcio mitocondrial. El compuesto [(HCO2) (NH3)4Ru Ru (μ-O) (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, es uno de los inhibidores selectivos de la conocida sólo para el MCU con un valor informado ded K de 24 μm.7 ,8,9,10 este complejo es una impureza común en formulaciones comerciales de rojo de rutenio (RuRed), un triruthenium di-μ-oxo puente hexacation de la fórmula [(NH3) 5 RU (μ-O) Ru (NH3)4(μ-O) Ru (NH3)5)]6 +, que también se ha utilizado como un inhibidor de la absorción de calcio. Aunque Ru360 está disponible en el mercado, es muy costoso. Por otra parte, la síntesis y el aislamiento de Ru360 es desafiado por purificación difíciles procedimientos y métodos de caracterización ambigua.
Recientemente hemos reportado procedimientos alternativos para acceder a un Ru360 análogo, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5. 11 este compuesto inhibe el MCU con alta afinidad, similar a Ru360. En este protocolo, describimos nuestro más eficaz síntesis de este compuesto, que comienza de [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Purificación del producto usando resina de intercambio catiónico fuertemente ácida es detallado, junto con errores comunes de este procedimiento. También presentamos los métodos para la caracterización y evaluación de la pureza compuesto y delinear un enfoque simple para probar su eficacia en el bloqueo de la absorción de calcio mitocondrial.

<table><tbody><tr><td>Hidrato de tricloruro de rutenio</td><td>Química a presión</td><td>3750</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico concentrado</td><td>J.T. Baker</td><td>9535</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de amonio concentrado</td><td>Mallinckrodt Chemical Works</td><td>A669C-2 1</td><td></td></tr><tr><td>Dowex 50 WX2 200-400 Malla</td><td>Alfa Aesar</td><td>13945</td><td></td></tr><tr><td>Verde Calcio 5N</td><td>Invitrogen</td><td>C3737</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Aldrich</td><td>260746</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Aldrich 471267</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>USB</td><td>20598</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fluka</td><td>54466</td><td></td></tr><tr><td>Succinato de sodio</td><td>Alfa Aesar</td><td>33386</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T. Baker</td><td>8993-01</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Aldrich</td><td>G5000</td><td></td></tr><tr><td>200 Matraz de fondo redondo</td><td>ChemGlass</td><td>CG-1506-14</td><td></td></tr><tr><td>Tapón de vidrio</td><td>ChemGlass</td><td>CG-3000-05</td><td></td></tr><tr><td>Columna de vidrio de 10 mm x 15 cm con depósitos</td><td>Personalizado - similar a las columnas Chemglass</td><td>Similar a CG-1203-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Falcon de fondo redondo</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-11B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>500 cm2 placas de Petri</td><td>Corning</td><td>431110</td><td></td></tr><tr><td>Azul tripán</td><td>Hemacitómetro ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Aldrich Z359629</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubetas acrílicas</td><td>VWR&nbsp;</td><td>58017-875</td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro UV-Vis</td><td>Agilent Modelo Cary 8454&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrofluorímetro</td><td>SLM Modelo 8100C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro IR</td><td>Bruker Hyprion FTIR con accesorio</td><td></td><td></td>ATR</tr><tr><td>Centrífuga</td><td>ALC Modelo PM140R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de luz invertida</td><td>VWR&nbsp;</td><td>89404-462</td><td></td></tr></tbody></table>

síntesis y evaluación de un inhibidor de la absorción de calcio mitocondrial basado en rutenio

Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

Detallamos la síntesis y purificación de un inhibidor de la absorción calcio mitocondrial, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (μ-O) (NH3)4(OH2)]5 +. La síntesis optimizada de este compuesto inicia de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 en 1 M NH4OH en un envase cerrado, produciendo una solución verde. Se logra la purificación con cromatografía de intercambio catiónico. Este compuesto es caracterizado y verificada a ser puros por espectroscopia UV-vis e IR. Las propiedades inhibidoras de absorción calcio mitocondrial se evalúan en las células HeLa permeabilized por espectroscopia de fluorescencia.

Este método describe una síntesis del calcio mitocondrial absorción inhibidor [(OH2) (NH3)4Ru Ru (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 a partir de [Ru (NH3)5Cl] Cl2, un material de partida conocido de rutenio. [Ru (NH3)5Cl] CL2 se caracteriza por espectroscopia IR, con modos vibracionales en 3200 cm-1, 1608 cm-1, 1298 cm-1y 798 cm...

Se presenta un protocolo para la síntesis, purificación y caracterización de un inhibidor basado en rutenio de la absorción de calcio mitocondrial. Un procedimiento para evaluar su eficacia en células de mamífero permeabilized está demostrado.

Síntesis y evaluación de un inhibidor de la absorción de calcio mitocondrial basado en rutenio

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of ...

El objetivo general de la síntesis y purificación es producir con relativa facilidad un análogo de rutenio 360 utilizado en ensayos de absorción de calcio mitocondrial que sea 10 veces más eficaz que el rutenio 360 disponible comercialmente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del calcio mitocondrial al proporcionar un inhibidor puro de la absorción de calcio mitocondrial. La principal ventaja de esta técnica es que el producto final es a la vez muy potente y puro.Las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque la purificación requiere tiempo y paciencia. La demostración del productor estará a cargo de Sarah Nathan, una estudiante graduada de mi laboratorio. Comience este procedimiento con la síntesis de dicloruro de pentaammina cloro rutenio como se describe en el protocolo de texto.Disolver 100 miligramos de dicloruro de clororutenio pentaammina en 50 mililitros de una solución de hidróxido de amonio molar en un matraz de fondo redondo de 200 mililitros. Tape sin apretar el matraz con un tapón de vidrio y caliente la mezcla de reacción a 75 grados centígrados durante seis horas. Calentar un recipiente sellado da como

synthesis-evaluation-ruthenium-based-mitochondrial-calcium-uptake

Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

Este protocolo describe un método para la medición en tiempo real de los flujos de calcio mitocondrial de imagen fluorescente. El método se aprovecha de una circular permutaciones YFP basada en sensor de calcio de doble excitación radiométrica (radiométrica pericam-mt) expresa selectivamente en las mitocondrias.

Seguimiento de los cambios dinámicos en niveles de calcio mitocondrial de la apoptosis mediante un sensor de calcio genéticamente codificados

Un protocolo espectrofluorométrico para la medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial en el corazón de ratón mitocondrias aisladas se presenta aquí. El ensayo involucra la medición simultánea de las mitocondrias...

Multi-parámetro de medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad en el corazón del ratón mitocondrias aisladas

Este video describe un ensayo basado en un lector de placas para medir la absorción de calcio mitocondrial en mitocondrias aisladas. El ensayo analiza la señal de fluorescencia de un colorante fluorescente sensible al calcio para estudiar la cinética de la absorción de calcio mitocondrial y la sobrecarga de calcio.

Ensayo de absorción de calcio mitocondrial: un método basado en lectura de placas para medir la absorción de calcio en mitocondrias aisladas

Este video describe un ensayo basado en imágenes de microscopía confocal para medir la absorción de calcio mitocondrial en células cultivadas. El ensayo utiliza el colorante fluorescente sensible al calcio Rhod-2/AM para medir el calcio mitocondrial en células cultivadas permeabilizadas.

Ensayo de afluencia de calcio para medir la absorción de calcio mitocondrial en células cultivadas

Complejos de fosfina de rutenio se utilizan ampliamente para reacciones catalíticas homogéneas tales como hidrogenaciones. Se ha informado de la síntesis de una serie de complejos de rutenio tridentado novedosos que lleven la N -triphos ligando N (CH 2 PPh 2) 3. Además, se describe la reacción estequiométrica de un complejo dihidruro SRC N -triphos con ácido levulínico.

La síntesis, caracterización y reactividad de una serie de rutenio<em&gt; N</em&gt; -triphos<sup&gt; Ph</sup&gt; Complejos

Las mitocondrias pueden utilizar el potencial electroquímico a través de su membrana interna (Δ Ψm) para secuestrar calcio (Ca2 +), lo que les permite dar forma Ca 2+ citosólico de señalización dentro de la célula. Se describe un método para medir simultáneamente las mitocondrias Ca 2+ absorción y ΔΨ m en células vivas utilizando colorantes fluorescentes y microscopía confocal.

Medición simultánea de calcio mitocondrial y mitocondrial potencial de membrana en células vivas por microscopía fluorescente

Este protocolo tiene por objeto describir un método para examinar la capacidad de retención de Ca2 + y Ca2 +- activa hinchazón de mitocondrias aisladas de SH-SY5Y mitocondrial de células paso a paso.

Mitocondrial de Ca2 + retención capacidad análisis y Ca2 +-activa hinchazón mitocondrial ensayo

Aquí, presentamos dos protocolos para la medición de mitocondrial Ca2 + afluencia en mitocondrias aisladas y células cultivadas. Para mitocondrias aisladas, detallamos una placa base de lector Ca2 + importación de ensayo utilizando el Ca2 + sensible tinte verde-5N de calcio. Para las células cultivadas, se describe un método de microscopia confocal con el Ca2 + tinte Rhod-2/AM.

Análisis de la afluencia del calcio mitocondrial en las mitocondrias aisladas y células cultivadas

Este proctocol tiene como objetivo proporcionar un método para imágenes de Ca2+ mitocondrial in vitro e in vivo en astrocitos y neuronas.

Obtención de imágenes de ca2+ mitocondrial en astrocitos y neuronas utilizando indicadores de Ca2+ codificados genéticamente (GECI)

La adaptación metabólica es fundamental para las células T, ya que dicta la diferenciación, la persistencia y la citotoxicidad. Aquí, se presenta un protocolo optimizado para monitorear la respiración mitocondrial en células T primarias humanas diferenciadas por citoquinas ex vivo .

Monitoreo en tiempo real de la respiración mitocondrial en células T primarias humanas diferenciadas por citoquinas

Presentamos un método no invasivo y en tiempo real para monitorizar la salud mitocondrial utilizando la espectroscopía Raman por resonancia (RRS). Utilizamos RRS para cuantificar los estados redox mitocondriales y desarrollamos una métrica para la salud mitocondrial, la Resonancia Raman reduce la relación mitocondrial (3RMR), que muestra una respuesta más rápida a los cambios en la oxigenación que los analitos hemato-gases tradicionales.

Evaluación en tiempo real y no invasiva de la función mitocondrial mediante espectroscopía Raman por resonancia

Aprende a sintetizar y purificar un análogo de rutenio 360 diez veces más potente que el comercial para inhibir la absorción de calcio mitocondrial. Este método mejora los ensayos de biología mitocondrial.

Síntesis y evaluación de un inhibidor de la absorción de calcio mitocondrial basado en rutenio

Explorar más videos