Obtención de imágenes de ca²⁺ mitocondrial en astrocitos y neuronas utilizando indicadores de Ca²⁺ codificados genéticamente (GECI)

Este proctocol tiene como objetivo proporcionar un método para imágenes de Ca²⁺ mitocondrial in vitro e in vivo en astrocitos y neuronas.

Demostrando el procedimiento estarán el estudiante graduado Zhe Zhang, el especialista en investigación Nannan Zhang, los profesores Illker Ozden y Shinghua Ding. El objetivo general de este procedimiento es desarrollar astrocitos de pares específicos de tipo celular y las neuronas y el método de orientación mitocondrial para recuentos mitocondriales in vitro e in vivo de imágenes utilizando el indicador de calcio codificado genéticamente, GCaMP5G y 6s. Para la obtención de imágenes in vitro o in vivo, construiremos plásmidos de ADN que contengan promotores específicos de astrocitos o neuronas gfaABC1D o CaMKII e indicadores de calcio codificados genéticamente, GCaMP5G/6s con secuencias de orientación mitocondrial.

Para la obtención de imágenes de calcio mitocondrial in vitro se transfectaron astrocitos de neuronas cultivados en trozos de cubierta de vidrio con los plásmidos de ADN antes mencionados utilizando el método lipofectamine. Las imágenes se pueden iniciar uno o dos días después de la transfección transfiriendo los resbalones de la cubierta de vidrio a la cámara de profusión bajo un microscopio de epifluorescencia o de dos fotones. Aquí hay ejemplos de señales fluorescentes de mitocondrias y un astrocito que expresa GCaMP6s a la izquierda, y para mitocondrias en una neurona, expresando GCaMP5G a la derecha.

Para la obtención de imágenes in vivo, preparamos adenovirus asociados al serotipo 5 para la expresión de mito-GCaMP5G en astrocitos y adenovirus asociado al serotipo 9 para la expresión de mito-GCaMP6 en neuronas. Para las cirugías de inyección de virus estereotáxicos, primero anestesiamos al ratón con 3% de isoflurano. Más tarde, durante la cirugía, los niveles de isoflurano se reducen al 2% Después de que se alcanza el nivel adecuado de anestesia, el cabello sobre el cuero cabelludo se afeita y el ratón se coloca en un instrumento quirúrgico estereotax.

Se aplica un ungüento oftálmico a los ojos para protegerlos durante la cirugía. Las cirugías de inyección se realizan mediante procedimientos asépticos, incluidos instrumentos estériles y técnicas asépticas. Los instrumentos quirúrgicos se esterilizan en autoclave o mediante un esterilizador de cuentas calientes.

Después de montar el ratón en el estereotax, el cuero cabelludo se limpia con betadina y etanol al 70% tres veces. Luego, la piel se corta a lo largo del eje Bregma Lambda y la vertical se hace mediante un taladro de alta velocidad sobre la ubicación objetivo. En este trabajo, nos dirigimos a la corteza motora o al paracórtex.

Una jeringa Hamilton de calibre 33 que transporta un vector de adenovirus asociado se inserta a través del orificio en el cerebro y los vectores se inyectan en el área objetivo. Para la administración cortical, inyectamos la solución de virus a dos profundidades en múltiples pasos. Primero, insertamos la aguja un milímetro de profundidad en la corteza.

Después de dejar cinco minutos para que el cerebro se recupere, movemos la aguja hasta 700 micrómetros de profundidad, inyectamos 500 nano litros de solución de virus. Después de completar la inyección, esperamos cinco minutos para permitir que el virus se difunda en el cerebro. Y luego movemos la aguja hasta la segunda ubicación de inyección a 300 micrómetros de profundidad.

Aquí, inyectamos otros 500 nano litros de solución de virus. Después de completar la inyección, esperamos 10 minutos para permitir que el virus se difunda y luego retiramos la aguja del cerebro y cerramos el orificio de rebaba con cera ósea o Kwik-Sil. Finalmente, la piel se sutura con Vetbond y el ratón se recupera en una almohadilla térmica antes de ser enviado de vuelta a la instalación de animales.

El ratón estará listo para su uso para imágenes in vivo en un mínimo de tres semanas, que es el período de tiempo en el que madura la expresión de GCaMP. Las cirugías de implantación de ventanas craneales también se realizan mediante el uso de condiciones asépticas como se describe para las cirugías de inyección. Los procedimientos quirúrgicos de la ventana craneal son idénticos a los procedimientos quirúrgicos de inyección hasta el punto de exposición del cráneo.

Una vez que el cráneo está expuesto, los cuartos de una craneotomía de 2-3 mm de diámetro sobre el área inyectada por el virus están marcados con cuatro agujeros poco profundos hechos por un taladro de alta velocidad conectado a un manipulador. Luego, la sección del cráneo, en las gargantas de la craneotomía, se adelgaza perforando cuidadosa y lentamente el hueso en un círculo, conectando estos cuatro agujeros. Una vez que el cráneo en los bordes es lo suficientemente delgado, entonces el hueso se levanta con pinzas afiladas y se retira.

La duramadre expuesta se puede quitar o mantener intacta para la implantación de la ventana craneal. Nuestra ventana craneal consiste en una cubierta de vidrio deslizante de 3-5 milímetros de diámetro, creando un disco de silicona de aproximadamente 300 micras de espesor en el centro. El montaje de la ventana craneal se logra colocándola sobre la craneotomía.

Un trozo de palillo de dientes unido a un manipulador se utiliza para empujar la ventana craneal suavemente sobre la superficie del cerebro. Luego, el borde de la ventana craneal se sella con una pequeña cantidad de adhesivo de silicona Kwik-Sil. Finalmente, la ventana craneal se fija en los bordes del cráneo con acrílico dental.

Se debe tener cuidado al aplicar el acrílico dental ligeramente sobre los bordes de la ventana craneal para una unión fuerte. Como muchos otros grupos de investigación han implementado en el pasado, se puede usar un gel de agarosa al 1.2% entre el vidrio de la cubierta y el cerebro como una alternativa al disco de silicona. Después de que la ventana craneal se instala de forma segura, se adhiere una placa de metal al cráneo.

Esta placa de cabeza se utilizará para fijar la cabeza del ratón en el escenario de un microscopio de dos fotones durante las sesiones de imágenes. La absorción de calcio mitocondrial en los astrocitos puede ser provocada por la aplicación de ATD, mientras que la absorción de calcio mitocondrial en las neuronas puede ser provocada por la aplicación de glicina de glutamato en el líquido cefalorraquídeo artificial, con gravedad a través de un sistema de perfusión. La absorción de calcio en las mitocondrias individuales en los astrocitos y las neuronas se puede observar.

Las siguientes películas muestran la absorción de calcio mitocondrial en un astrocito provocado por ATP a la izquierda y en una neurona provocada por el glutamato y la glicina a la derecha. La obtención de imágenes se realiza mediante la recopilación de imágenes de dos fotones in vivo con lapso de tiempo de señales fluorescentes mitocondriales en astrocitos y neuronas con un sistema de microscopía de dos fotones Ultima de Prairie Technologies, que está equipado con un millón de lásers Ti Sapphire Ultra one de Coherent. Utilizamos las longitudes de onda de excitación de 880 a 910 nanómetros, que son óptimas para imágenes in vivo con GCaMP5G y 6s.

Astrocitos y expresión específica de neuronas de mito-GCaMP5G y 6s y reconfirmada por co-localización del marcado específico de astrocitos de SR101 o marcador específico de neurona NeuN. La absorción espontánea de calcio mitocondrial en astrocitos y neuronas in vivo se puede observar mediante imágenes de lapso de tiempo utilizando microscopía de dos fotones. Las imágenes muestran aumentos espontáneos de calcio en las mitocondrias individuales en un astrocito a la izquierda y una neurona a la derecha.

Nuestros enfoques son útiles para imágenes de calcio mitocondrial específicas del tipo celular in vitro e in vivo. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo obtener imágenes de la absorción de calcio mitocondrial en los astrocitos y en las neuronas.